一种腈水合酶基因、编码酶、载体、工程菌及其制备酰胺化合物的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高效水合芳香腈的腈水合酶基因和一种高效表达该重组酶的基 因工程菌的构建，以及该基因工程菌在制备酰胺化合物中的应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 腈化合物是一类含有氰基（-CN)的有机化合物。在化工领域，腈化合物可以作为 重要的化工原料及中间体，广泛应用于化学品酰胺和羧酸及其衍生物的有机合成中。然而， 采用化学法转化腈化合物通常需要强酸、强碱和高压等条件，势必对环境造成严重的污染。 与化学水解法相比，生物催化法反应条件温和（常温、常压和中性PH值），同时对环境污染 的压力较小。更重要的是，由酶介导的生物催化法能实现化学、区域和对映体选择性等优 点，提高其原子经济利用率。腈化合物的生物转化过程中主要涉及到腈水合酶、酰胺酶和腈 水解酶。其中，腈水合酶可以催化腈水合生成酰胺，而酰胺酶进一步将酰胺催化水解产生羧 酸化合物；而腈水解酶可以直接将腈化合物转化为羧酸化合物。
[0003] 在自然界中，生产腈水合酶的微生物分布非常广泛，如红球菌、假单胞菌、诺卡 氏菌、假诺卡氏菌、产碱杆菌、棒状杆菌等。其中，一些微生物已经用于丙烯酰胺、烟酰胺 等化合物的工业化生产中，如专利号为US007405064B2的专利公开了一种野生睾丸酮丛 毛单胞菌5-MGAM-4D ;专利号ZL88106735的专利公开了一种野生玫瑰色红球菌Jl ;专 利号为ZL86100062的专利公开了一种红球菌S-6、氧化节杆菌和黄色微杆菌；专利号为 ZL99106291. 4的专利公开了一种野生嗜热假诺卡氏菌JCM3095。目前，该领域的主要研宄 针对野生菌株进行筛选和培育，以达到工业生产的要求。然而，在腈水合酶的基因簇中往往 同时含有酰胺酶基因，从而可以转化丙烯酰胺和烟酰胺为丙烯酸和烟酸，严重影响到目标 产物的纯度和实际产率。另外，已报道的腈水合酶具有稳定性差、对底物和产物的耐受性低 等问题。随着生物技术的迅速发展，采用基因工程手段构建腈水合酶的基因工程菌株，不仅 可以从源头阻断酰胺的进一步水解，保证酰胺产品的高质量；而且可以采用蛋白质工程技 术手段对其进行定向改造，提高腈水合酶的某些特性，如稳定性和底物耐受性等。同时，腈 水合酶一般具有很强的底物特异性，往往对体积较大的芳香腈表现出很低的活力，限制了 其在某些药物中间体的转化中的应用。因此，开发新型的针对芳香腈的腈水合酶具有较高 的研宄和应用价值。 (三）
【发明内容】
[0004] 本发明目的是提供一种可以高效转化芳香腈生产相应酰胺的重组腈水合酶及其 催化腈化合物生成酰胺中的应用，该酶由α亚基、β亚基和活化元件基因编码构成。其中， α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示，β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示，活 化元件的氨基酸序列如SEQ ID NO. 7所示。
[0005] 本发明采用的技术方案是：
[0006] 本发明涉及一种重组腈水合酶基因，所述重组腈水合酶基因由SEQ ID NO. 2所示 α亚基、SEQ ID NO. 3所示β亚基和SEQ ID NO. 4所示活化元件依次连接构成。
[0007] 本发明还涉及一种由所述的腈水合酶基因编码的重组腈水合酶，具体优选所述重 组腈水合酶由SEQ ID NO. 2所示α亚基基因编码的SEQ ID NO. 5所示氨基酸序列、SEQ ID NO. 3所示β亚基基因编码的SEQ ID NO. 6所示氨基酸序列和SEQ ID NO. 4所示活化元件 编码的SEQ ID NO. 7所示氨基酸序列依次连接构成。
[0008] 由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7所 示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸 序列同源性在90%以上，且具有相同的酶活力，均可实现本发明目的，属于本发明保护范围 之列。
[0009] 由于核苷酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3和 SEQ ID NO. 4所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90%以上同源性，均可实现本 发明目的，属于本发明保护范围之列。
[0010] 本发明还涉及一种由所述重组腈水合酶基因构建的重组载体。
[0011] 本发明涉及一种由所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
[0012] 本发明提供一种所述重组腈水合酶基因在制备重组腈水合酶中的应用，所述的应 用为：将SEQ ID NO. 2所示α亚基、SEQ ID NO. 3所示β亚基和SEQ ID NO. 4所示活化元 件依次连接，合成重组腈水合酶基因，将重组腈水合酶基因与载体连接，构建含重组腈水合 酶基因的重组载体，再将重组载体转化宿主菌，获得的重组基因工程菌诱导培养，培养液分 离获得含重组腈水合酶的菌体细胞。
[0013] 本发明提供一种所述的重组腈水合酶在催化腈化合物生成酰胺中的应用，具体所 述的应用为：以含重组腈水合酶基因的重组基因工程经诱导培养后获得的湿菌体为催化 剂，以pH5. 0?8. 0的磷酸缓冲液为反应介质，以腈化合物为底物，在25°C下进行反应，反应 结束后，获得含酰胺的反应液，将反应液分离纯化，获得酰胺；所述催化剂的用量以湿菌体 的重量计为10?50g/L缓冲液（优选20?30g/l)，所述底物的终浓度为0. 2?I. Omol/L 缓冲液（优选〇· 5?0· 8mol/L) 〇
[0014] 本发明所述的催化剂制备方法为：将含重组腈水合酶基因的重组基因工程接于含 50 μ g/ml Kan的LB液体培养基中，37°C，200rpm振荡培养10?14h，取培养液以体积浓度 2 %的接种量转接至含50 μ g/ml Kan的新鲜LB液体培养基中，37°C，200rpm振荡培养至 〇D_达到0· 6?L 0时，加入终浓度0· ImM的IPTG，18?37°C下诱导12?18h，离心，获得 湿菌体。
[0015] 本发明所述腈化合物为3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、苯甲腈、3-甲基苯甲腈或苯乙 腈。
[0016] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明实现了源自亚硫酸杆菌 E-36中假定腈水合酶基因在大肠杆菌细胞中的功能表达，提供了一种高效表达该酶的基因 工程菌，可以高效转化芳香腈生产相应酰胺化合物，转化率达到100%。 (四）【附图说明】
[0017] 图1为实施例1亚硫酸杆菌E-36中腈水合酶基因的PCR扩增电泳图；M :核酸 Marker ;2?4 :腈水合酶基因的PCR扩增产物。
[0018] 图2为实施例2重组质粒pET28a(+)-NH_E36的图谱。
[0019] 图3为实施例3基因工程菌株E. coli BL21(DE3)/pET28a(+)-NH_E36诱导表 达产物的SDS-PAGE电泳图；M :低分子量标准蛋白质；1 :基因工程菌E. coli BL21(DE3)/ pET28a(+)-NH_E36 诱导后菌体破胞液；2 :基因工程菌 E. coli BL21 (DE3)/pET28a(+)-NH_ E36诱导菌体破胞上清液；3 :基因工程菌E. coli BL21(DE3)/pET28a(+)-NH_36表达经过纯 化后的重组腈水合酶，箭头指示重组腈水合酶E36的位置。
[0020] 图4为实施例9中3-氰基吡啶及其转化产物高效液相色谱图。 (五）【具体实施方式】
[0021] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0022] DNA 聚合酶（PrimerSTAR HS，X 2)、DNA Marker、限制性内切酶（Nde I、Xho I)和 T4DNA连接酶菌购自宝生物工程（大连）有限公司（Takara?)。细菌基因组提取试剂盒、质 粒提取试剂盒和DNA凝胶回收纯化试剂盒购自康宁生命科技有限公司（Axygen?)。E. coli DH5a、Ε· coli BL21(DE3)和质粒 pET_28a(+)购自 Novagen 公司；低分子量蛋白质 Marker、 琼脂糖电泳试剂购自北京全式金生物技术有限公司。
[0023] LB培养基（g/L) : 10蛋白胨；10氯化钠；5酵母粉，pH 7. 0,溶剂为水。
[0024] 实施例1 :全长臆水合酶基因的克隆
[0025] 采用细菌基因组提取试剂盒提取亚硫酸杆菌E-36 (Sulfitobacter sp. E-36ATCC BAA-1142)的基因组。再根据亚硫酸杆菌E-36基因组中假定腈水合酶的核苷酸序列（如 SEQ ID NO. 1)设计引物NH_E36-Up和NH_E36-Down，以亚硫酸杆菌E-36基因组为模板，PCR 扩增全长腈水合酶基因，如图1所示。PCR产物采用DNA凝胶回收纯化试剂盒进行回收，获 得的全长腈水合酶基因由SEQ ID NO. 2所示α亚基（编码的氨基酸序列为SEQ ID NO. 5所 示）、SEQ ID NO. 3所示β亚基（编码的氨基酸序列为SEQ ID NO. 6所示）和SEQ ID NO. 4 所示活化元件（编码的氨基酸序列为SEQ ID NO. 7所示）组成，SEQ ID NO. 2所示α亚基、 SEQ ID NO. 3所示β亚基和SEQ ID NO. 4所示活化元件依次连接构成，具体步骤参考该试 剂盒的使用说明书。上游引物NH_E36-Up (含有Nde I酶切位点）如SEQ ID NO. 8所示，下 游引物NH_E36-Down (含有Hind III酶切位点）如SEQ ID NO. 9所示。
[0026] 上游引物 NH_E36_Up :5' -ggaattccat atgacatccc acgggcatga tc_3'
[0027] 下游引物 NH_E36_Down :5' -ccgctcgagc tacagcgtga tagcttgccc-3'
[0028] PCR反应体系和PCR反应条件：
[0029] PCR扩增体系：
[0030] PrimerSTAR DN A 聚介 1?: 25 μ I; 上游引物（lOpmol/μΙ) 2.0 μ?； 下游引物（lOpmol/μΙ) 2.0 μ?； 模板DNA (基因组） 2.0 μ?; 加双蒸水至 50 μΙ,.
[0031] PCR扩增条件：
[0032] 1)预变性：95°C 2min ;
[0033] 2)变性：95°C IOs ;退火：58°C 15s ;延伸：72°C 15s ;共循环 30 次；
[0034] 3)延伸：72°C IOmin ;
[0035] 4)4。〇保存2.011。
[0036] 实施例2 :基因工程菌株E. coli pET28a(+)-NH_E36的构建和鉴定
[0037] 为了实现来源于亚硫酸杆菌E-36基因组中腈水合酶基因在大肠杆菌BL21 (DE3) 细胞内的高效功能表达，选择含有T7启动子的pET28a (+)作为表达载体。将载体pET28a (+) 和全长腈水合酶基因经Nel I和Xho I双酶切，采用DNA凝胶回收试剂盒进行酶切产物的 回收。
[0038] 双酶切体系和反应条件：
[0039] 基因或质粒 20 μ?; jVe/I 酶 2 μ?; Χ/κ)丨酶 2μΙ; 加双蒸水至 40 μΙ;
[0040] 37。〇保温511。
[0041] 采用核酸电泳初步确定两者的浓度，以基因/质粒（mol/mol, 2:1)进行混合，加入 T4DNA连接酶16°C连接过夜，得到重组质粒pET28a (+) -NH_E36 (示意图如图2所示）。然后， 将重组质粒转化入感受态E. coli BL21(DE3)细胞中。再将转化后的菌液涂布于含有终浓 度100 μ g/ml卡那霉素（Kanamycin，Kan)的LB平板上，经37°C静止培养，挑取单菌落，由上 海生工进行基因序列的测定，从而验证重组质粒pET2