专利名称：一种产腈水合酶优良菌种的选育方法
技术领域：
本发明涉及一种产腈水合酶优良菌种的选育方法。
背景技术：
腈水合酶(nitrile hydratase, NHase)是生物催化法生产丙烯酰胺(acrylamide, AM)的催化剂，能催化丙烯腈(acrylonitrile, AN)水合生成丙烯酰胺。该酶的活性大小是微生物法生产丙烯酰胺的关键技术。在工业生产中，当丙烯酰胺达到一定浓度后，腈水合酶的催化速率显著降低，丙烯酰胺浓度很难有进一步提高，终浓度通常为300 400 g/L。要得到丙烯酰胺晶体，还要通过蒸气浓缩及结晶才能得到98%的含量，生产中得到的结果表明，提高丙烯酰胺溶液百分比浓度可减少蒸气用量，所以提高腈水合酶 菌的丙烯酰胺耐受性有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种产腈水合酶优良菌种的选
育方法。为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为
(1)接种发酵液的制备在无菌室内，将诺卡氏菌斜面菌种接种于装有发酵培养基的锥形瓶内，将锥形瓶放入摇床进行发酵培养，摇床转速设定为150-200r/min，温度为28±2°C，培养IOOh后得到具有腈水合酶活性的发酵液；
(2)耐受性培养按照步骤(I)制备菌体发酵液，当发酵培养IOOh时，每隔l-2h向摇瓶发酵液中加入含量95-99%的丙烯腈2ml继续摇瓶培养，同时，每隔l_2h取样进行平板菌落计数和酶活测定，筛选出一株最耐丙烯酰胺的二次出发菌种；
(3)低温驯化培养步骤(2)中得到二次出发菌种，取其发酵液5ml稀释100倍后，平皿涂布，分别置于10-20°C的培养箱里低温培养100h，观察菌体生长情况；
(4)扩大培养将长出少数菌落的菌种进行摇瓶发酵，摇床转速设定为150-200r/min,温度为28±2°C，培养IOOh后分别检测不同低温处理的腈水合酶酶活，从而得到酶活性最高的菌株。优选地，所述的斜面和平板培养基的配方为葡萄糖15-20 g/1, K2HPO4 O. 5-0. 6g/I，酵母浸膏 4.5-5. Og/1 ,MgSO4 · 7H20 0.8 -1.0 g/1，味精 O. 9_1· 0，磷酸氢二钾 O. 5-0. 6,尿素 7-7. 5g/l，消泡剂 IOOppm,琼脂 20. O -25. Og/Ι ；
优选地，所述的发酵培养基配方为葡萄糖20-25g/l，K2HPO4 O. 6-0. 8g/l，酵母浸膏
7.0-9. Og/1, MgSO4 ·7Η20 I. 2-1. 3 g/1，味精 I. 4_1· 5 g/1，脲 7· 0-8.0 g/1，消泡剂 150ppm。本发明的优点在于对诺卡氏菌进行丙烯酰胺耐受性培养和低温驯化培养，优选得到腈水合酶酶活性高达1643万μ /mg的菌株，比原诺卡氏菌菌株的腈水合酶酶活性854万u/mg提闻了 92%。同时该菌株对丙稀酸胺的耐受:性也提闻了 20%。
具体实施例方式以下实施例仅为了进一步说明本发明，并不限制本发明的内容。实施例I
I、斜面和平板培养基的配制
葡萄糖 15-20 g/1 ,K2HPO4 0.5-0. 6g/l，酵母浸膏 4. 5-5. Og/1 ,MgSO4 ·7Η20 0.8 -1.0 g/1，味精 O. 9-1. 0，磷酸氢二钾 O. 5-0. 6，尿素 7-7. 5g/l，消泡剂 IOOppmJl^g 20. O -25. Og/L·2、发酵培养基配制 葡萄糖 20-25g/l，K2HPO4 O. 6-0. 8g/l，酵母浸膏 7. 0-9. Og/1, MgSO4 · 7H20 I. 2-1. 3 g/1，味精 I. 4-1. 5 g/U7.0-8.0 g/1，消泡剂 150ppm。3、耐受性实验
在无菌室内，将诺卡氏菌斜面菌种接种于装有发酵培养基的锥形瓶内，将锥形瓶放入摇床进行发酵培养，摇床转速设定为150-200r/min，温度为28±2°C，培养IOOh后得到具有腈水合酶活性的发酵液，每隔I. 5h向摇瓶发酵液中加入含量99%的丙烯腈2ml继续摇瓶培养，通过平板菌落计数观察菌种生长情况，发现113. 5h时，菌体的存活率最低，只有
O.0013%，腈水合酶活性为510万μ /mg。2、低温驯化实验
将上述113. 5h时得到的二次出发菌种，取其发酵液5ml稀释100倍后，平皿涂布，分别置于10°C、12°C、14°C、16°C、18°C >20 V的培养箱里低温培养100h，观察菌体生长情况，获得30个残存菌落，将30个菌落的菌种进行摇瓶发酵，摇床转速设定为150-200r/min，温度为28±2°C，培养IOOh后分别检测不同低温处理的腈水合酶酶活，发现18°C下培养一菌株的酶活性最高，其腈水合酶活性达到1643万μ/mg，比原诺卡氏菌菌株的腈水合酶酶活性854万μ/mg提高了 92%，同时该菌株对丙烯酰胺的耐受性也提高了 20%。
权利要求
1.一种产腈水合酶优良菌种的选育方法，其特征在于包括以下步骤 (1)接种发酵液的制备在无菌室内，将诺卡氏菌斜面菌种接种于装有发酵培养基的锥形瓶内，将锥形瓶放入摇床进行发酵培养，摇床转速设定为150-200r/min，温度为28±2°C，培养IOOh后得到具有腈水合酶活性的发酵液； (2)耐受性培养按照步骤(I)制备菌体发酵液，当发酵培养IOOh时，每隔l-2h向摇瓶发酵液中加入含量95-99%的丙烯腈2ml继续摇瓶培养，同时，每隔l_2h取样进行平板菌落计数和酶活测定，筛选出一株最耐丙烯酰胺的二次出发菌种； (3)低温驯化培养步骤(2)中得到二次出发菌种，取其发酵液5ml稀释100倍后，平皿涂布，分别置于10-20°C的培养箱里低温培养100h，观察菌体生长情况； (4)扩大培养将长出少数菌落的菌种进行摇瓶发酵，摇床转速设定为150-200r/min,温度为28±2°C，培养IOOh后分别检测不同低温处理的腈水合酶酶活，从而得到酶活性最高的菌株。
2.根据权利要求I所述的一种产腈水合酶菌种的选育方法，其特征在于所述的斜面和平板培养基的配方为葡萄糖15-20 g/1，K2HPO4 O. 5-0. 6g/l，酵母浸膏4. 5-5. Og/1,MgSO4 ·7Η20 0.8 -1.0 g/1，味精 O. 9-1.0，磷酸氢二钾 O. 5-0. 6，尿素 7-7. 5g/l，消泡剂IOOppm,琼脂 20. O -25. Og/Ι。
3.根据根据权利要求I所述的一种产腈水合酶菌种的选育方法，其特征在于所述的发酵培养基配方为葡萄糖20-25g/l，K2HPO4 O. 6-0. 8g/l，酵母浸膏7. 0-9. Og/1,MgSO4 ·7Η20 I. 2-1. 3 g/1，味精 I. 4_1· 5 g/1，脲 7.0-8.0 g/1，消泡剂 150ppm。
全文摘要
本发明公开了一种产腈水合酶优良菌种的选育方法，对诺卡氏菌进行丙烯酰胺耐受性培养得到单菌落，经过摇瓶发酵得到二次出发菌种，再通过低温驯化培养，优选性能优良的腈水合酶酶菌种，其酶活性高达1643万μ/mg，比原诺卡氏菌菌株的腈水合酶酶活性854万μ/mg提高了92%，同时该菌株对丙烯酰胺的耐受性也提高了20%。为后续的丙烯酰胺生产提供高效的催化剂。
文档编号C12N1/20GK102776142SQ20121025164
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月20日 优先权日2012年7月20日
发明者张小琴, 曹艳, 杨涛, 水瑞芬, 沈瑞华, 熊光辉, 顾稀平 申请人:江苏南天农科化工有限公司