一种含腈水解酶细胞的固定化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种细胞的固定化方法，特别涉及一种含腈水解酶细胞的固定化方 法。 (二）
【背景技术】
[0002] 腈水解酶具有催化效率高和区域选择性好的特点，能够快速高效地将1-氰基环 己基乙腈中亚甲基上的氰基水解为羧基而保留环己基上的氰基，可用于生物合成抗癫痫药 加巴喷丁药物中间体1-氰基环己基乙酸的催化剂。相对游离细胞反应过程易破损、重复利 用率低，产物回收困难等缺点，通过物理，化学的方法将腈水解酶全细胞固定成颗粒后，可 增强细胞对毒性腈类底物的耐受性，有利于催化剂连续多批次使用和产物分离精制，可实 现生产过程的连续化，自动化，可控化，从而提高产品质量，降低生产成本。因此在工业化应 用中研宄了众多固定化的方法，以提高腈水解酶全细胞的稳定性。
[0003] 在腈水解酶全细胞固定化方法中，Almatawah等人利用海藻酸钠包埋腈水解酶细 胞连续生产烟碱酸，在IOOmM底物浓度下使用10批次后，酶活残留70% (Almatawah et al/ Enzyme and Microbial Technology 25(1999)718-274)。Nigam 等人利用琼脂包埋腈水 解酶细胞连续生产丙烯酸，在IOOmM底物浓度下使用25批次后，酶活残留65% (Nigam et al/J. Biosci 34(2009)21-26)。柳志强等人利用海藻酸钠和聚乙烯醇复合包埋腈水解酶 细胞连续生产亚胺基二乙酸，在75mM底物浓度下使用10批后，酶活残余40% (Zhi-Qiang Liu et al/J Mol Microbiol Biotechnol 22(2012)35-47)。薛亚平等人用海藻酸钠包 埋腈水解酶细胞并用聚乙烯亚胺和戊二醛交联生产R-(-)_扁桃酸，在20mM扁桃腈底物 浓度下重复利用 19 批次（Ya-Ping Xue et al/0rganic Process Research&Development 17(2013)213-220)。Cooling等人利用卡拉胶包埋腈水解酶细胞并用聚乙烯亚胺和戊二 醛交联连续生产4-氰基戊酸，在150mM底物浓度下使用4批后酶活残留80% (Cooling et al/Journal of Molecular Catalysis B :Enzymatic 11(2001)295-306)。这些细 胞包埋法在工业化应用中都要面临载体基质传质受限制，底物浓度低，载体机械强度不 高导致操作稳定性差等缺点。张志军等人用戊二醛交联腈水解酶细胞生产R-(-)_扁 桃酸，IOOmM 底物浓度下重复使用 15 批（Zhi-Jun zhang et al/Bioprocess Biosyst Eng(2014) 1241-1248)，虽然解决了传质限制等问题，但仍然存在颗粒强度低，使用批次低 的问题。Ni等人用邻苯二酚壳聚糖结合氧化铁纳米颗粒制备固定化腈水解酶细胞生产 R_(_)_ 扁桃酸，IOOmM 底物浓度下重复使用 16 批（Ni et al/Journal of Biotechnology 167(2013)433-440)。虽然此方法具有一定创新性，但在实际的工业化应用中存在固定化细 胞制备复杂，细胞回收不便捷难以在大规模生产中使用等问题。
[0004] 美国专利（US6551804B2)报道了用海藻酸钙包埋腈水解酶细胞并交联戊二醛和 聚乙烯亚胺以及卡拉胶包埋腈水解酶细胞并交联戊二醛和聚乙烯亚胺的方法生产4-氰基 戊酸。美国专利（US20050009154A1)报道了用海藻酸钠固定化腈水解酶细胞生产1-氰基 环己基乙酸。这些包埋方法受到海藻酸钙载体基质传质限制，大量非催化载体影响催化剂 性能。卡拉胶凝胶过程温度较高容易使酶失活等问题而难于很有效应用于工业化生产。
[0005] 在游离腈水解酶固定化的方法中，Sandeep Kumar等人用交联腈水解酶聚体的 方法进行固定化生产R-(-)_扁桃酸，IOmM底物浓度下重复使用5批（S. kumar et al/ Bioresource Technology 101(2010)6856-6858)。Joshua D. Swartz 等人用二氧化娃纳米 颗粒包埋腈水解酶生产烟碱酸，5mM底物浓度下重复使用10批（Joshua D. Swartz/Organic Process Research&Development 13(2009)584-589)。这些方法仍然没有很好解决操作稳 定性差，游离酶在固定化过程中易失活，所用材料难以有效放大等问题。
[0006] 因此研宄一种成本低、性能优异，制备简单且可实现1-氰基环己基乙酸工业化生 产的固定化方法，具有非常重要的现实意义。 (三）
【发明内容】
[0007] 本发明目的在于克服腈水解酶催化生产1-氰基环己基乙酸过程中由于双腈底物 毒性大，底物溶解度低而造成的反应批次低等问题，提供了一种含腈水解酶细胞的固定化 方法。
[0008] 本发明采用的技术方案是：
[0009] 本发明提供一种含腈水解酶细胞的固定化方法，所述方法为：将含腈水解酶基因 的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体加入缓冲液或蒸馏水中，制成菌悬液；向菌悬 液中添加载体，搅拌混匀，再加入聚乙烯亚胺，搅拌絮凝〇. 5~2h，然后加入戊二醛进行交 联，10~25°C搅拌交联0. 5~2h后，弃去上清液，真空抽滤后，得含腈水解酶的固定化细 胞；所述载体为硅藻土、珍珠岩或活性炭；所述载体与菌悬液中湿菌体重量比为〇. 01~ 0· 1 :1〇
[0010] 进一步，所述腈水解酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO. 1所示，编码蛋白的氨基酸 序列为SEQ ID NO. 2所示。
[0011] 进一步，所述缓冲液为pH = 7. 0、IOOmM磷酸盐缓冲液。
[0012] 进一步，所述缓冲液或蒸馏水体积用量以湿菌体湿重计为5ml/g~15ml/g。
[0013] 进一步，所述戊二醛以体积浓度25% (v/v)戊二醛水溶液形式加入，所述25% (v/ v)戊二醛水溶液体积用量以湿菌体重量计为0. 05~0. 5ml/g(优选0. 3ml/g)。
[0014] 进一步，所述聚乙烯亚胺以体积浓度5% (v/v)聚乙烯亚胺水溶液形式加入，所述 5% (v/v)聚乙稀亚胺水溶液体积用量以湿菌体重量计为0. 01~I. 0ml/g(优选0. lml/g)， 本发明所述聚乙烯亚胺分子量70000,聚合度1600。
[0015] 进一步，所述重组基因工程菌构建方法为：将SEQ ID NO. 1所示腈水解酶基因与 PGEM-T载体连接后导入E. coli JM109中，提取连接质粒并与质粒pET28b(+)-Nit进行双 酶切后，连接过夜，将连接产物导入宿主E. coli BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/pET28b(+)-F168V。
[0016] 进一步，所述湿菌体的制备方法为：
[0017] (1)将含腈水解酶基因的重组基因工程菌接种至斜面培养基，37°C培养12h，获得 斜面菌体；斜面培养基组成为：l〇g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉，20g/L琼脂，溶剂 为水，pH自然；
[0018] ⑵将斜面菌体接种至种子培养基，37°C培养12h，获得种子液；种子培养基组成： lOg/L蛋白胨，lOg/L氯化钠，5g/L酵母粉，溶剂为水，pH自然；
[0019] (3)将种子液以体积浓度3. 3%接种量接种至发酵培养基，37°C、150rpm条件下培 养2h，然后加入10g/L乳糖诱导剂，28°C、150rpm条件下诱导12h，取发酵液离心，收集湿菌 体；发酵培养基组成：甘油12g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉12g/L，NaCl 10g/L，KH2PO4L 36g/ L，Κ2ΗΡ042· 28g/L，MgSO4O. 375g/L，（NH4) 2S045g/L，溶剂为去离子水，pH 7· 0。
[0020] 本发明所述重组基因工程菌最优选以含腈水解酶的重组大肠杆菌E. coli BL21(DE3)/pET28b(+)-F168V为例，所述重组大肠杆菌是将Acidovorax facilis ZJB09122 腈水解酶突变体基因 F168V(核苷酸序列为SEQ ID NO. 1所示）与PGEM-T载体进行连接 后导入E. coli JM109中，对F168V/PGEM-T和质粒pET28b (+)-Nit进行双酶切，连接酶连 接过夜，将连接产物pET28b(+)-F168V导入宿主E. coli BL21(DE3)中，所得的重组大肠杆 菌 E. coli BL21(DE3)/pET28b(+)_F168V 作为生产菌种（Xin-Hong Zhang et al/Process Biochemistry 49(2014)2141-2148)。
[0021] 本发明所述硅藻土分子式为SiO2，分子量为60. 08,中位粒径19. 6 μ m，比重0. 32 能吸收大于本身4倍的水；溶于浓碱和氢氟酸，不溶于水、酸或稀碱，优选购自阿拉丁公司。
[0022] 本发明所述珍珠岩，化学组成Si02:70~75%，Al 203:12~16%，Na2O :1· 0%~ 4. 0%，K2O :1· 0%~4. 0%，外观白色颗粒，比重0· 09,熔点：1280~1350°C，优选购自杭州 锦大绿产业技术有限公司。
[0023] 本发明所述活性炭，分子式为C，分子量为12. 01，比重1. 8,对有机色素和含氮碱 有高容量的吸附能力，优选购自阿拉丁公司。
[0024] 本发明方法是在初始高密度培养基中发酵生产腈水解酶；然后将发酵液离心获得 菌体与缓冲液或蒸馏水混合成菌悬液，添加载体（如硅藻土），搅拌混匀，再与聚乙烯亚胺 混合，搅拌使菌体絮凝；最后向溶液中加入戊二醛进行交联，真空抽滤后得固定化细胞。
[0025] 本发明所述含腈水解酶细胞的固定化方法中，在缓冲液或蒸馏水混合成菌悬液 中，载体、聚乙烯亚胺、戊二醛的添加顺序是：首先添加载体、然后添加聚乙烯亚胺、最后添 加戊二醛；添加顺序调将显著降低固定化细胞酶活回收率和操作稳定性。众所周知，没有一 种固定化方法适合所有的酶或细胞，即使是同样的细胞由于含有不同的酶，同样固定化细 胞的方法或相同方法不同操作步骤产生的效果也会有巨大的差异。本发明的重点是提供一 种适用于SEQ ID NO. 1所示核苷酸编码的腈水解酶细胞的固定化方法，为催化1-氰基环己 基乙腈生产1-氰基环己基乙酸降低成本。
[0026] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
[0027] 本发明所提供的固定化方法具有固定化材料成本低，操作简单，重