专利名称：一种全细胞生物法立体选择性水解dl－脂肪酸薄荷酯制备l－薄荷醇的方法
技术领域：
一种全细胞生物法立体选择性水解DL-脂肪酸薄荷酯制备L-薄荷醇的方法，属于生物法拆分外消旋化合物技术领域。
背景技术：
薄荷醇是目前最有工业价值的手性化合物之一，在医药、食品、化妆品和手性试剂制备等领域广泛应用。天然薄荷醇受天气、地域等影响，产量和质量波动较大，合成薄荷醇则可以解决以上问题。人们对薄荷醇的合成途径进行了大量的研究，许多已经应用于工业化生产(范存良，杨忠保，《香料香精化妆品》，2002年，第4期，p28)。通常采用这些方法合成的是L-薄荷醇的外消旋混合物，D-薄荷醇的存在大大影响了薄荷醇的气味和味道，以及生理活性，因此对薄荷醇进行手性拆分十分重要。近几年来，由于对食品和药品添加剂的绿色、环保和安全性要求的提高，生物学拆分方法已成为手性拆分的主流趋势，开发新型的手性拆分用酶已成为薄荷醇手性拆分的关键。
目前，薄荷系列产品在国内外供不应求，我国薄荷醇的年需求量也持续上升。薄荷醇的合成方法主要是国外开发的，国内自主开发并工业化的还很少，由于天然薄荷醇已无法满足现代工业迅猛增长的需求，厂家对合成薄荷醇的依赖日益严重，随着酶的开发与应用的发展，化学法合成薄荷醇外消旋体，结合生物催化拆分进行L-薄荷醇的生产，必将有广阔的发展前景。
国际上拆分DL-薄荷醇对映体常使用三种技术利用光学活性试剂拆分、利用非光学活性试剂拆分或生物催化手性拆分。
DL-薄荷醇与光学活性试剂反应生成两种物理性质不同的非对映体化合物，这两种化合物可以通过分步结晶的方法分开，然后分别进行水解就得到纯净的L-薄荷醇和D-薄荷醇。光学活性试剂有许多种，例如生物碱类，光学活性的胺类如1-(α-萘基)乙胺盐，邻苯二甲酸龙脑酯，光学活性的酸类如薄荷氧基乙酸、樟脑-10-磺酸等等。
利用非光学活性试剂拆分的原理是一种DL-混合物的饱和溶液，当用某一对映体进行接种(引入晶种)时，就会诱导此种对映体结晶析出，而另一种对映体仍留在溶液中。具体操作是先制得DL-混合物的溶液，然后将溶液分成两等份，一份加入D-型晶种，另一份加入L-型晶种，从而可以分别从两份溶液中分离出D-和L-异构体晶体。所剩两份母液合并混合后，再分成两份，重复上面操作，直至将绝大部分D-和L-异构体分开。
以上两种DL-薄荷醇的拆分方法所用的光学活性或非光学活性的试剂价格昂贵，难于回收，且工艺复杂，需要经过多次分步结晶分离，在生产过程中易带入毒性物质，这都使得合成薄荷醇的应用受到很大的限制。生物催化拆分方法反应条件温和、环保、高效，已引起人们的关注。
生物催化手性拆分的原理是用某些特殊的微生物或酶对外消旋对映体中某一个异构体具有高度的立体选择性，而对另一个异构体不起作用或作用很小，从而利用反应速率的快慢实现对映体分离的技术。80年代起国际上对DL-薄荷醇的生物催化手性拆分进行了大量的研究，主要是利用商品化酶催化的不对称酯化或转酯化反应，或利用商品化酶催化的不对称水解反应。因手性拆分不但涉及酶的活性，立体选择性也是一非常重要的考察指标，这提高了对酶的要求。
关于酶催化不对称水解方法有如下一些报道日本研究学者(Yamada H，Tani Y et al.，Jp 56015690，1981)最早报道了利用Gloeophyllum sepiarium IFO 6267 esterases水解DL-乙酸薄荷酯，但产物收率低，仅20％左右。同年，Omata等(Omata T，Iwamoto N et al.，European Journalof Applied Microbiology and Biotechnology，1981，11(4)，p199)又利用固定化Rhodotorula-Minuta Var Texensis细胞在水饱和的正庚烷中成功的立体选择性水解了DL-琥珀酸薄荷酯，并制备了L-薄荷醇。1990年，Murase等(Murase H，Yoshikawa K et al.，Jp 02299596，1990)用Ochrobactrum anthropi esterases选择性水解DL-乙酸薄荷酯，但酶活性很低，反应65h后仅达21％的转化率。
目前国际上利用生物拆分方法生产L-薄荷醇的方法主要有南非CSIR组织(Chaplin J A，Gardiner N S et al.，WO 0236795，2002)利用Pseudomonas fluorescens lipase选择性转酯化拆分DL-薄荷醇制备L-薄荷醇，反应平衡转化率低(约20％)，反应产物复杂，包括L-乙酸薄荷酯、有机溶剂、未转化的立体异构体、过量的酯化剂及反应副产物，给L-乙酸薄荷酯的分离带来困难，分离程序繁琐且产物纯度不高；并且利用碱液水解L-乙酸薄荷酯，转化率低，小于50％。
德国Haarmann&Reimer公司(Gatfield I L，Hilmer J M et al.，US 6706500，2002)利用重组Candida Rugosa lipase选择性水解DL-苯甲酸薄荷酯制备L-薄荷醇，该酶在水溶液中稳定性不高，难于回收利用，采用固定化后虽可以提高酶的稳定性，但固定化引起的酶失活严重，最高活性收率仅43％；并且酶催化水解反应的底物浓度不高，最高约0.8％。
发明内容
(1)要解决的技术问题本发明的目的在于提供一种全细胞生物法立体选择性水解DL-脂肪酸薄荷酯制备L-薄荷醇的方法，以获得高纯度的L-薄荷醇时，副产物D-脂肪酸薄荷酯可以通过水解制备高纯度的D-薄荷醇。
(2)技术方案本发明首先从微生物出发，筛选了能够高效立体选择性水解DL-脂肪酸薄荷酯的菌种。
设计该转化方法的途径如下 主要材料与试剂所用菌株及来源华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M201021，中国专利ZL03113274.X巳公开，中国典型培养物保藏中心，米根霉(Rhizopus oryzae)AS 3.41 中国普通微生物菌种保藏中心，米根霉(Rhizopus oryzae)AS 3.253 国普通微生物菌种保藏中心，近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CICC 1676中国工业微生物菌种保藏中心，近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CICC 1627中国工业微生物菌种保藏中心，皱褶假丝酵母(Candida rugosa)CICC 31281 中国工业微生物菌种保藏中心，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.823中国普通微生物菌种保藏中心，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55 中国普通微生物菌种保藏中心，或葱头布克氏菌(Burkholderia cepacia)ATCC 25416 美国典型菌种保藏中心。
主要试剂D-薄荷醇，L-薄荷醇，DL-薄荷醇皆购于美国Sigma-Aldrich公司。
DL-脂肪酸薄荷酯选择DL-乙酸薄荷酯为典型物。
DL-薄荷醇和DL-乙酸薄荷酯分析方法的确定L-薄荷醇、D-薄荷醇、L-乙酸薄荷酯、D-乙酸薄荷酯标样在cp-chirasil Dex CB色谱柱(购于美国Varian公司)上，通过带有FID检测器的手性气相色谱(Varian3900)进行分析。L-薄荷醇的保留时间为7.3min，D-薄荷醇的保留时间为8.3min，L-乙酸薄荷酯的保留时间为8.8min，D-乙酸薄荷酯的保留时间为8.5min。
确定具体色谱条件手性柱cp-chirasil Dex CB(25m×0.25mm×0.25μm)；分流比1∶50；进样口温度270℃；检测器温度270℃；载气H2；柱升温程序100℃保持8min，4℃/min升温至140℃，保持2min。在该条件下L-薄荷醇、D-薄荷醇、L-乙酸薄荷酯、D-乙酸薄荷酯均可以达到基线分离。
产物的光学纯度通过对映过量值(％e.e.)来评价。
反应后产物e.e.p值 ％e.e.p＝[(SL-SD)/(SL+SD)]×100％反应后底物e.e.s值 ％e.e.s＝[(SD′-SL′)/(SL′+SD′)]×100％反应转化率转化率(％)＝[(e.e.s+e.e.0)/(e.e.s+e.e.p)]×100％SL反应后L-薄荷醇的峰面积；SD反应后D-薄荷醇的峰面积；SL′反应后L-乙酸薄荷酯的峰面积；SD′反应后D-乙酸薄荷酯的峰面积；e.e.0反应起始时底物e.e.值。
菌株的培养及全细胞的制备(1)菌株的培养基组成霉菌培养基组成以g/100ml计为麦芽糖0.5～3，蛋白胨0.5～4，MgSO4·7H2O0.01～0.1，K2HPO40.2～1.0，橄榄油1.0～2.0，豆饼粉1.0～5.0，pH4～6。
酵母菌培养基组成以g/100ml计为葡萄糖3.5～5.0，酵母膏0.15～0.5，KH2PO40.1～1.5，MgSO4·7H2O 0.01～0.25，NaCl 0.001～0.025，FeSO4·7H2O0.001～0.025，pH6.0～7.5。
细菌培养基组成以g/100ml计为葡萄糖0.5～2.0，牛肉膏0.1～1.0，胰蛋白胨0.1～1.0，Fe2SO4·7H2O 0.001～0.05，K2HPO40.1～0.5，NaCl 0.1～1.0，pH7.0～8.0。
(2)全细胞的制备将菌株接种在装液量为5％～30％的250ml摇瓶中于20～35℃、100～300转/分钟振荡培养24～72小时；培养结束后离心，收集菌体用生理盐水洗涤两次，并冷冻干燥得到干细胞用于立体选择性水解反应。
微生物细胞催化立体选择性水解反应全细胞催化立体选择性水解反应条件为反应在细胞浓度以g/100ml计为0.5～20，底物浓度以g/100ml计为0.1～15，控制反应缓冲液pH值6.0～8.5，反应温度20～40℃，反应时间12～48小时，反应缓冲液可选用Tris-盐酸、磷酸盐缓冲或柠檬酸盐缓冲。
采用全细胞立体选择性水解DL-脂肪酸薄荷酯得到的L-薄荷醇的光学纯度为90％e.e.～100％e.e.，转化率40％～50％。
所述立体选择性水解反应的稳定性好，反应半衰期达240小时。
在制备L-薄荷醇时，得到的副产物D-脂肪酸薄荷酯通过水解制备高纯度的D-薄荷醇，光学纯度为80％e.e.～100％e.e.，产率为30％～60％。
立体选择性水解所用的全细胞能重复使用4个批次，每次使用后离心所得菌体用新鲜磷酸钾缓冲液洗涤两次，重复用于水解反应，能保持优良的催化性能。
(3)有益效果本发明通过筛选得到一系列高立体选择性菌株。用该类菌株进行不对称水解DL-脂肪酸薄荷酯制备L-薄荷醇，光学纯度可达90％e.e.以上。与国际上相关L-薄荷醇的制备方法相比，采用全细胞催化省去了繁琐的酶纯化、固定化过程，减少了酶活损失，提高了酶作用的底物范围及操作稳定性，并降低了L-薄荷醇的生产成本。
本发明与国际上相关方法比较，在制备L-薄荷醇时，得到的副产物D-脂肪酸薄荷酯通过水解可以制备高纯度的D-薄荷醇，其光学纯度可达80％e.e.以上。
本发明采用不同的全细胞微生物立体选择性水解DL-脂肪酸薄荷酯制备光学纯的L-薄荷醇；底物操作范围较广，可以为0.1～15(以g/100ml计)；反应稳定性高，半衰期可以达240小时。
本发明首次将微生物全细胞应用于薄荷醇的手性拆分研究中，为薄荷醇及结构类似物的手性拆分以及最终实现大规模工业化生产提供思路。
本发明对于新型手性拆分用酶源的开发具有较为重要的意义，体现了生物法在手性化合物生产中的优势和重要作用。
具体实施例方式
实施例1DL-乙酸薄荷酯的制备在装有冷凝回流器和温度计的100ml三口烧瓶中加入0.02mol薄荷醇和0.02mol乙酸酐，并加入0.4mmol对甲苯磺酸作催化剂，加入正庚烷作反应溶剂至反应体积为10ml，搅拌并加热回流反应4h。反应完毕后降温至40℃以下，加入5％NaHCO3中和过量的酸，至不再产生气泡为止，静置分层，去水相，有机相用饱和食盐水洗涤，分去水相后用无水MgSO4干燥过夜。过滤，混合液旋转蒸发除去溶剂即得纯粹的DL-乙酸薄荷酯。气相色谱检测DL-乙酸薄荷酯的纯度为99.9％，产率(以薄荷醇计)为98.5％。
实施例2不同菌株对DL-乙酸薄荷酯的水解情况在1ml、50mmol/L的磷酸钾缓冲溶液中(pH7.0)，加入13mg干菌体及10mg DL-乙酸薄荷酯，于30℃的恒温摇床上分别振荡反应24小时，反应后，混合物离心除菌体，上清液用乙酸乙酯萃取产物和底物，手性气相色谱分析产物e.e.值和转化率。各菌株的转化情况如表1。
表1
实施例3用CCTCC M201021全细胞不对称水解DL-乙酸薄荷酯在1ml、50mmol/L的磷酸钾缓冲溶液中(pH7.0)，加入13mg干菌体及10mg DL-乙酸薄荷酯，于30℃的恒温摇床上分别振荡反应12、16、20、24、36、48小时，反应后，混合物离心除菌体，上清液用乙酸乙酯萃取产物和底物，手性气相色谱分析产物e.e.值和转化率。结果如表2。
表2
表2说明，反应24小时后已接近理论转化率50％，继续延长反应时间至48小时，产物光学纯度仍能达到90％e.e.以上。
实施例4用CCTCC M201021全细胞不对称水解不同浓度DL-乙酸薄荷酯在1ml、50mmol/L的磷酸钾缓冲溶液中(pH7.0)，分别加入7mg、13mg、67mg、133mg、200mg干菌体及5mg、10mg、50mg、100mg、150mg DL-乙酸薄荷酯，于30℃的恒温摇床上振荡反应24小时，反应后，混合物离心除菌体，上清液用乙酸乙酯萃取产物和底物，手性气相色谱分析产物e.e.值和转化率。结果如表3。
表3
表3说明采用CCTCC M201021全细胞不对称水解DL-乙酸薄荷酯，在底物浓度较高时仍能维持较高的转化率和选择性，全细胞具有较高的底物耐受性。
实施例5不同温度下CCTCC M201021全细胞不对称水解DL-乙酸薄荷酯在1ml、50mmol/L的磷酸钾缓冲溶液中(pH7.0)，加入13mg干菌体及10mg DL-乙酸薄荷酯，分别于20℃、30℃、40℃、50℃的恒温摇床上振荡反应24小时，反应后，混合物离心除菌体，上清液用乙酸乙酯萃取产物和底物，手性气相色谱分析产物e.e.值和转化率。结果如表4。
表4
表4说明温度在20～40℃时，全细胞的转化活力和对映选择性均较高。温度超过50℃时，全细胞中起作用的酶因高温失活，转化能力迅速下降。
实施例6不同pH值下CCTCC M201021全细胞不对称水解DL-乙酸薄荷酯在1ml、50mmol/L不同pH值的磷酸钾缓冲溶液中，加入13mg干菌体及10mg DL-乙酸薄荷酯，于30℃的恒温摇床上振荡反应24小时，反应后，混合物离心除菌体，上清液用乙酸乙酯萃取产物和底物，手性气相色谱分析产物e.e.值和转化率。结果如表5。表5
表5说明全细胞转化反应在pH6.0～8.5范围内，均具有较高的产物e.e.值和转化率。
实施例7用Candida rugosa CICC 31281全细胞不对称水解DL-辛酸薄荷酯在1ml、50mmol/L的磷酸钾缓冲溶液中(pH7.0)，加入13mg干菌体及10mg DL-辛酸薄荷酯，于30℃的恒温摇床上振荡反应24小时，反应后，混合物离心除菌体，上清液用乙酸乙酯萃取产物和底物，手性气相色谱分析产物e.e.值和转化率。所得产物L-薄荷醇的光学纯度97.7％e.e.，转化率43.8％。
实施例8全细胞使用批次在1ml、50mmol/L的磷酸钾缓冲溶液中(pH7.0)，加入13mg Pseudomonasfluorescens AS 1.823干菌体及10mg DL-乙酸薄荷酯，于30℃的恒温摇床上振荡反应24小时，反应后，混合物离心除菌体，上清液用乙酸乙酯萃取产物和底物，手性气相色谱分析产物e.e.值和转化率。离心所得菌体用新鲜磷酸钾缓冲洗涤两次，重复上述拆分反应，反应条件不变，反应结束后同样测定产物e.e.值和转化率。结果如表6。
表6
表6说明，Pseudomonas fluorescens AS 1.823全细胞冻干粉具有良好的反应稳定性，反应四次后，转化率仅下降不到12％。
实施例9D-乙酸薄荷酯水解制备D-薄荷醇将3.0mol/L的NaOH溶液100mL加热到60℃，然后加入转化反应结束后分离出的0.2mol D-乙酸薄荷酯，并激烈搅拌60分钟，乙酸乙酯萃取产物和底物，定性GC分析表明49％峰面积的D-乙酸薄荷酯和51％峰面积的D-薄荷醇，D-薄荷醇的e.e.值为90.1％。
权利要求
1.一种全细胞生物法立体选择性水解DL-脂肪酸薄荷酯制备L-薄荷醇的方法，其特征是经过立体选择性菌株的培养及全细胞的制备，以DL-脂肪酸薄荷酯为底物，细胞浓度以g/100ml计为0.5～20，底物浓度以g/100ml计为0.1～15，控制反应缓冲液pH值6.0～8.5，反应温度20～40℃，反应时间12～48小时，通过全细胞生物法立体选择性水解制备L-薄荷醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所用制备全细胞的菌株为华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M201021中国典型培养物保藏中心，米根霉(Rhizopus oryzae)AS 3.41中国普通微生物菌种保藏中心，米根霉(Rhizopus oryzae)AS 3.253中国普通微生物菌种保藏中心，近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CICC 1676中国工业微生物菌种保藏中心，近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CICC 1627中国工业微生物菌种保藏中心，皱褶假丝酵母(Candida rugosa)CICC 31281中国工业微生物菌种保藏中心，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.823中国普通微生物菌种保藏中心，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AS 1.55中国普通微生物菌种保藏中心，上或葱头布克氏菌(Burkholderia cepacia)ATCC 25416美国典型菌种保藏中心。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是全细胞的制备(1)菌株的培养基组成霉菌培养基组成以g/100ml计为麦芽糖0.5～3，蛋白胨0.5～4，MgSO4·7H2O0.01～0.1，K2HPO40.2～1.0，橄榄油1.0～2.0，豆饼粉1.0～5.0，pH 4～6；酵母菌培养基组成以g/100ml计为葡萄糖3.5～5.0，酵母膏0.15～0.5，KH2PO40.1～1.5，MgSO4·7H2O 0.01～0.25，NaCl 0.001～0.025，FeSO4·7H2O0.001～0.025，pH6.0～7.5；细菌培养基组成以g/100ml计为葡萄糖0.5～2.0，牛肉膏0.1～1.0，胰蛋白胨0.1～1.0，Fe2SO4·7H2O 0.001～0.05，K2HPO40.1～0.5，NaCl 0.1～1.0，pH7.0～8.0；(2)全细胞的制备将菌株接种在装液量为5％～30％的250ml摇瓶中于20～35℃、100～300转/分钟振荡培养24～72小时；培养结束后离心，收集菌体用生理盐水洗涤两次，并冷冻干燥得到干细胞用于立体选择性水解反应。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是水解反应所用的缓冲液为Tris-盐酸、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是采用全细胞立体选择性水解DL-脂肪酸薄荷酯得到的L-薄荷醇的光学纯度为90％e.e.～100％e.e.，转化率40％～50％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述立体选择性水解反应的稳定性好，反应半衰期达240小时。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是在制备L-薄荷醇时，得到的副产物D-脂肪酸薄荷酯通过水解制备高纯度的D-薄荷醇，光学纯度为80％e.e.～100％e.e.，产率为30％～60％。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征是立体选择性水解所用的全细胞能重复使用4个批次，每次使用后离心所得菌体用新鲜磷酸钾缓冲液洗涤两次，重复用于水解反应，能保持优良的催化性能。
全文摘要
一种全细胞生物法立体选择性水解DL－脂肪酸薄荷酯制备L－薄荷醇的方法，属于生物法拆分外消旋化合物技术领域。本发明提供了具有高立体选择性的菌株，并制备全细胞，以DL－脂肪酸薄荷酯为底物，通过全细胞生物法立体选择性水解制备L－薄荷醇。在制备L－薄荷醇时，得到的副产物D－脂肪酸薄荷酯通过水解制备高纯度的D－薄荷醇，L－薄荷醇的光学纯度为90％e.e.～100％e.e.，转化率为40％～50％，D－薄荷醇的光学纯度为80％e.e.～100％e.e.，产率为30％～60％。本发明与国际上相关L－薄荷醇的制备方法相比，采用全细胞催化省去了繁琐的酶纯化、固定化过程，减少了酶活损失，提高了酶作用的底物范围及操作稳定性，并降低了L－薄荷醇的生产成本。
文档编号C12N1/16GK1978659SQ20061009819
公开日2007年6月13日 申请日期2006年12月8日 优先权日2006年12月8日
发明者徐岩, 于丽娟 申请人:江南大学