专利名称：番茄pg基因启动子反向重复序列及其载体和工程菌株的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及的是一种番茄多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因启动子反向重复序列、构建含有该序列克隆与表达载体过程中的PCR特异引物与中间载体、含有该序列的克隆与表达载体转化菌株。
背景技术：
多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PG)是在果实成熟过程中特异表达的细胞壁水解酶，其主要功能是将果实细胞壁中多聚半乳糖醛酸降解为半乳糖和醛酸，使细胞壁结构解体，导致果实的软化。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近几年发现的真核生物功能基因表达抑制的特殊机制，并成为一项极具潜力的真核生物基因功能研究和应用的新技术。在植物中RNA干扰可发生在转录水平，即通过被抑制基因的启动子序列的双链RNA(dsRNA)来实现。因为反向重复序列可使DNA形成复杂的二级结构，因此，构建含有反向重复序列的克隆和表达载体成为植物RNA干扰研究与应用中的关键技术。目前还没有针对PG基因启动子构建的反向重复序列克隆和表达载体。
发明内容本发明提供一种番茄PG基因启动子反向重复序列及其载体和工程菌株。
本发明的目的之一是提供长度为1736bp、互补区为310bp的一种番茄PG基因启动子反向重复序列。
本发明的目的之二是提供用于获得上述序列过程中所设计的扩增番茄PG基因启动子1.4kb和310bp序列的两对引物及含有扩增产物的克隆载体。
本发明的目的之三是提供含有该反向重复序列的克隆载体pPGPIR及转化的E.coli的DH5α工程菌株。
本发明的目的之四是提供含有该反向重复序列的克隆载体pSKPGPIR及转化的E.coli的DH5α工程菌株。
本发明之三和四提供的工程菌株带有φ80lacZΔM15基因和Ampr基因，可以与pUC载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补并具有抗氨苄青霉素抗性的能力。
本发明的目的之五是提供克隆该反向重复序列所用的植物表达载体pPGN及转化的土壤农杆菌LBA4404工程菌株。
本发明的目的之六是提供含有该反向重复序列的植物表达载体pNPGIR及E.coli的JM109工程菌株和土壤农杆菌LBA4404工程菌株。
本发明之五和之六的大肠杆菌JM109工程菌株具有抗卡那霉素的能力。
本发明之五和之六的土壤农杆菌LBA4404工程菌株为章鱼碱类型农杆菌，携带一个由Ti质粒pTiAch5上去掉T-DNA毒性区的卸甲质粒pAL4404，该质粒提供vir区的辅助功能，具有抗链霉素、壮观霉素和壮观霉素的能力。
PG是一个受发育调控的具有组织特异性的酶，其活性在果实成熟的早期出现，并随果实成熟而显著增加。PG基因5′上游231bp是最小的具有启动活性的区段，而5′上游1.4kb序列包括了PG基因转录的正、负调控区。本项发明涉及的1736bp番茄PG基因启动子反向重复序列中的310bp互补区包含了上述231bp的最小启动子。
首先设计和合成两对特异引物，以番茄幼嫩子叶提取的核基因组DNA为模板，分别扩增PG基因启动子1.4kb和310bp序列，以BamHI和KpnI酶切1.4kb序列PCR产物并克隆到pUC18载体上，将测定的序列在GenBank中进行同源性比对，与登陆的番茄PG基因启动子相应的部位同源性超过99％，从而确定克隆的是目的序列，构建成了pPGP克隆载体。扩增的PG基因启动子310bp序列以BamHI和PstI酶切并克隆到pUC18载体上，将测定的序列在GenBank中进行同源性比对，与登陆的番茄PG基因启动子相应的部位同源性为100％，确定克隆的是目的序列，构建成了pPGPmr克隆载体。
从pPGPmr克隆载体上以BamHI和PstI酶切下310bp序列并反向连接到pPGP克隆载体上，序列测定后确认构建成了含有1736bp反向重复序列的克隆载体pPGPIR。
以KpnI和PstI双酶从克隆载体pPGPIR上切下该反向重复序列，克隆到pSK载体上，构建成含有1736bp反向重复序列的克隆载体pSKPGPIR。
向E.coli的DH5α菌株中转化含有番茄PG基因启动子1.4kb序列的克隆载体pPGP、含有番茄PG基因启动子1736bp反向重复序列的克隆载体pPGPIR和pSKPGPI所用的是分子克隆常规的预冷0.1mol/L CaCI2结合热休克的方法。
用SmaI酶切植物表达载体pPGA，将11kb大片段回收并连接形成含有XhoI，NcoI，SstI，KpnI，SmaI，XbaI，BamHI切点的植物表达载体pPGN。以KpnI和BamHI双酶从克隆载体pSKPGPIR上切下1736bp反向重复序列并克隆到pPGN载体上，形成植物表达载体pNPGIR。植物表达载体pPGN和pNPGIR向E.coli的JM109菌株和土壤农杆菌LBA 4404菌株中的转化采用电转化方法，使用的是Micro pulser电转化仪(Bio-Rad)。
本发明的优点及效果本发明可广泛用于植物PG基因表达抑制的相关理论及延缓果实衰老等应用研究。
图1为pPGP重组质粒(克隆载体)PCR鉴定电泳图。其中泳道1为DNA分子量标准DL2000，泳道2为阳性PCR对照；泳道34为重组质粒PCR产物。
图2为pPGPmr重组质粒(克隆载体)PCR鉴定电泳图。其中泳道1为DNA分子量标准DL2000，泳道2为阳性PCR对照；泳道3-9为重组质粒PCR产物。
图3为pPGP重组质粒(克隆载体)BamHI-KpnI双酶切鉴定电泳图。其中泳道1为DNA分子量标准DL15000，泳道8为重组质粒BamHI-KpnI双酶切，泳道9为非酶切重组质粒。
图4为pPGPmr重组质粒(克隆载体)PstI-BamHI双酶切鉴定电泳图。其中泳道1为DNA分子量标准DL2000，泳道2为PstI-BamHI双酶切pUC18对照，泳道3和5为PstI-BamHI双酶切的重组质粒，泳道4和6为非酶切重组质粒。
图5为pPGPIR重组质粒(克隆载体)酶切鉴定电泳图。其中泳道1为BamHI-PstI双酶切pPGPIR质粒，泳道2为KpnI-PstI双酶切pPGPIR质粒，泳道3为KpnI-BamHI双酶切pPGP质粒对照，泳道4为DNA分子量标准DNA ladder，泳道5为BamHI-PstI双酶切pPGP质粒对照，泳道6为BamHI单酶切pPGPIR质粒，泳道7为KpnI单酶切pPGPIR质粒，泳道8为非酶切pPGPIR质粒，泳道9为DNA分子量标准DL2000。
图6为pSKPGPIR重组质粒(克隆载体)酶切鉴定电泳图。其中泳道1为DNA分子量标准DL15000+2000，泳道2为KpnI-PstI双酶切载体pSK，泳道3为KpnI-PstI双酶切pSKPGPIR重组质粒，泳道4为KpnI单酶切pSKPGPIR重组质粒，泳道5为非酶切pSKPGPIR重组质粒。
图7为pNPGIR重组子质粒(植物表达载体)酶切鉴定电泳图。其中泳道1为DNA分子量标准DL15000+DL2000，泳道2为KpnI-XbaI双酶切植物表达载体pPGN，泳道3为XbaI-KpnI双酶切pNPGIR重组质粒，泳道4为XbaI单酶切pNPGIR重组质粒，泳道5为KpnI-XbaI双酶切pNPGIR重组质粒，泳道6为KpnI单酶切pNPGIR重组质粒，泳道7为非酶切pNPGIR重组质粒，泳道8为非酶切植物表达载体PGN。
图8为植物表达载体pPGN构建流程图。
图9为植物表达载体pNPGIR的构建流程图。
具体实施方式实施例1重组质粒pPGP和pPGPmr的获得根据GenBank已发表的番茄PG基因(GenBank accession numberX14074)启动子的DNA序列信息和RNAi研究中选择用于构建hpRNA序列的基本经验，设计如下PCR特异引物。
Primer(PG)15′CGCGGATCCGCGGCTTCTTAAAAAGGCAAATTG 3′Primer(PG)25′CGGGGTACCCCGATGATAAGAGGTATGGGAAG 3′Primer(PG)35′CGCGGATCCGCGCCATTTAACTTTGATTGTAATTA 3′Primer(PG)45′AAAACTGCAGCCATGATAAGAGGTATGGGAAG 3′以番茄幼嫩子叶核基因组DNA为模板，以Primer(PG)1和Primer(PG)2作为扩增番茄PG基因启动子1.4kb序列的上下游引物；以Primer(PG)3和Primer(PG)4作为扩增番茄PG基因启动子310bp序列的上下游引物。50μl PCR反应体系，PCR反应程序为94℃预变性5min，以94℃变性1min、56℃退火1min、72℃延伸2min的条件循环32个反应，最后72℃延伸8min。
扩增分别得到了含有PG基因启动子区域1415bp序列和310bp序列的1439bp和334bp的PCR扩增产物。将用BamHI和KpnI酶切的1439bp PCR扩增产物克隆到经相同酶切的pUC18载体上，经图1、图3鉴定重组质粒和序列测定，确定克隆的为目标序列的pPGP重组质粒。
将用BamHI和PstI酶切的334bp的PCR扩增产物克隆到经相同酶切的pUC18载体上，经图2、图4鉴定重组质粒和序列测定，确定克隆的为目标序列的pPGPmr重组质粒。
实施例2克隆载体pPGPIR的构建分别提取上述重组质粒pPGP和pPGPmr，并分别用BamHI和PstI酶切。将pPGPmr酶切产物电泳，回收约310bp泳带并与pPGP酶切产物连接，连接产物用常规的预冷0.1mol/L CaCI2和热休克结合处理的方法转化E.coli的DH5α菌株。重组质粒经图5所示KpnI、BamHI单酶切和BamHI-PstI、KpnI-PstI双酶切鉴定，并与同样经过这些酶切的重组质粒pPGP对比，确定所克隆的为含有PG基因启动子区域1415bp序列和反向310bp序列的克隆载体pPGPIR。
实施例3克隆载体pSKPGPIR的构建分别提取克隆载体pSK和重组质粒pPGPIR，并分别用KpnI-PstI双酶切。将pPGPIR酶切产物电泳，回收约1.7kb泳带并与酶切的pSK产物连接，连接产物用常规的预冷0.1mol/L CaCI2和热休克结合处理的方法转化E.coli的DH5α菌株。重组质粒经图6所示KpnI单酶切和KpnI-PstI双酶切鉴定，并与同样经过这些酶切的重组质粒pSK对比，以及序列测定(详见序列表)确定所克隆的为含有1736bp PG基因启动子反向重复序列的克隆载体pSKPGPIR。在距离该反向重复序列一端313bp和另一端1417bp之间为标志性BamHI酶切点，从反向重复序列的两个端部分别向序列中延伸310bp为互补序列。
实施例4植物表达载体pPGN和pNPGIR的构建提取植物表达载体pPGA并用SmaI酶切，电泳后回收11kb大片段并进行自连(见图8所示)，连接物用Bio-Rad生产的电转化仪Micro pulser电转化到E.coli JM109中，获得含有XhoI，NcoI，SstI，KpnI，SmaI，XbaI，BamHI切点的能在E.coli和土壤农杆菌中复制的植物表达载体pPGN。分别提取克隆载体pSKPGPIR和植物表达载体pPGN并用KpnI和BamHI双酶切，电泳回收酶切的pSKPGPIR约1.7kb泳带，如图9所示将该1.7kb酶切序列与经同样酶切的植物表达载体pPGN连接，连接物用上述电转化方法转化到E.coli JM109菌株中，重组质粒经图7所示XbaI单酶切、KpnI-XbaI双酶切、XbaI-KpnI双酶切及与相应酶切的pPGN进行对比，确定为含有1736bpPG基因启动子反向重复序列的植物表达载体pNPGIR。
用类似的电转化方法将植物表达载体pNPGIR转化到土壤农杆菌LBA4404菌株中。
经转化获得含有植物表达载体pPGN和pNPGIR的工程菌株E.coli JM109具有抗卡那霉素的能力；含有植物表达载体pPGN和pNPGIR的工程菌株的土壤农杆菌LBA4404菌株具有抗链霉素、壮观霉素和壮观霉素的能力。
序列表<110>南开大学，天津市农业生物技术研究中心<120>番茄PG基因启动子反向重复序列及其载体和工程菌株<160>1<210>1<211>1736<212>DNA<213>番茄(Lycopersicon Esculentum)<400>
atgataagag gtatgggaag ggtttgtcta tttatagatt ttaaggggtt tgagttggtc 60aatatggtta attgtaatgg gtattatatt agtttggatg agagatattt agacgaaaga 120gtttcttgga catttttgtc tggcttgtct tctcccgtct caattttttt gtcgtatttc 180ttttatatga tgtttaaaaa tatttatttt gaataattaa aaaaatatta tgttacaatt 240ctttgttaaa tattaatttt atttatatgt tggtaatttt taaaaattaa ttacaatcaa 300agttaaatgg cgcggatccg cgcttcttaa aaaggcaaat tgattaattt gaagtcaaaa 360taattaatta taacaatggt aaagcacctt aagaaaccat agtttgaaag gttaccaatg 420cgctatatat taatcaactt gataatataa aaaaaatttc aattcgaaaa gggcctaaaa 480tattctcaaa gtattcgaaa tggtacaaaa ctaccatccg tccacctatt gactccaaaa 540taaaattatt atccaccttt gagtttaaaa ttgactactt atataacaat tctaaattta 600aactatttta atacttttaa aaatacatgg cgttcaaata tttaatataa tttaatttat 660gaatatcatt tataaaccaa ccaactacca actcattaat cattaaatcc cacccaaatt 720ctactatcaa aat tgtccta aacactactaaaacaagacg aaattgttcg agtccgaatc 780gaagcaccaa tctaatttag gttgagccgc atatttagga ggacactttc aatagtattt 840ttttcaagca tgaatttgaa atttaagatt aatggtaaag aagtagtaca tcccgaatta 900
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1.一种长度为1736bp、互补区为310bp的番茄PG基因启动子反向重复序列，其具体序列如序列表所示。
2.用于获得权利要求1序列过程中所设计的扩增番茄PG基因启动子1.4kb和310bp序列的两对引物及含有扩增产物的克隆载体，即pPGP克隆载体和pPGPmr克隆载体。
3.根据权利要求2所述的克隆载体，其特征在于以番茄幼嫩子叶提取的核基因组DNA为模板，分别扩增PG基因启动子1.4kb和310bp序列，以BamHI和KpnI酶切1.4kb序列PCR产物并克隆到pUC18载体上，构建成pPGP克隆载体；扩增的PG基因启动子310bp序列以BamHI和PstI酶切并克隆到pUC18载体上，构建成pPGPmr克隆载体。
4.一种克隆载体，其特征在于含有权利要求1的序列的克隆载体pPGPIR。
5.一种工程菌株，其特征在于是用权利要求4的克隆载体pPGPIR转化的E.coli的DH5α工程菌株。
6.一种克隆载体，其特征在于含有权利要求1的序列的克隆载体pSKPGPIR。
7.一种工程菌株，其特征在于是用权利要求6的克隆载体pSKPGPIR转化的E.coli的DH5α工程菌株。
8.一种表达载体，其特征在于含有权利要求1序列的植物表达载体pNPGIR。
9.一种工程菌株，其特征在于是用权利要求8的植物表达载体pNPGIR转化的E.coli的JM109工程菌株。
10.一种工程菌株，其特征在于是用权利要求8的植物表达载体pNPGIR转化的土壤农杆菌LBA4404工程菌株。
全文摘要
一种番茄PG基因启动子反向重复序列及其载体和工程菌株。本发明针对番茄果实成熟相关酶PG基因，设计特异性引物扩增PG基因启动子1400bp和310bp序列，将这两个序列反向连接到pUC18上构建成pPGPIR；再将反向重复序列克隆到pSK载体上构建成pSKPGPIR。测定反向重复序列长度为1736bp，在距该序列一端313bp和另一端1417bp之间为标志性BamHI酶切点，从两个端部分别向序列中延伸310bp为互补序列。构建的通用植物表达载体pPGN上的MCS包含6个特征性酶切点，PG基因启动子反向重复序列克隆到pPGN上KpnI和BamHI之间，构建成可广泛研究植物PG基因抑制表达的新型载体pNPGIR。
文档编号C12N15/82GK101045927SQ20061013066
公开日2007年10月3日 申请日期2006年12月29日 优先权日2006年12月29日
发明者白艳玲, 王丹, 付丽娅, 乔明强, 徐海津, 张秀明, 刘仲齐 申请人:南开大学, 天津市农业生物技术研究中心