专利名称：植物和病毒启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及赋予带有启动子的转基因植物高水平基因表达的植物和病毒启动子。本发明也涉及利用这些启动子构建用于植物转化的重组基因以使得能在特定时间、在特定组织中以及以特定比率表达。
具体地，本发明涉及从侵染香蕉的badnavirus分离物分离的启动子。
背景技术：
已证明植物的遗传工程是用于植物育种和用于导入反映在改变表型的新的有利特征的可选方法。另外，它提供用于生物研究的有利工具。植物基因操作集中于机体形成的细胞水平上，并且涉及细胞生物学、分子生物学和基因转移方法的所有方面的交叉领域(sharp等，食品技术，1984年2月，112-119页)。遗传工程工具组织培养、体细胞克隆和配子克隆变异、细胞选择操作和重组DNA都直接或间接地与加强基因表达和基因转移有关。这一点的关键问题是选择可得到所需基因表达比率、定位和时间的适当启动子。在遗传工程的大量应用中，需要强启动子以确保足够量的基因产物得到表达。这些应用包括对植物进行遗传操作以得到针对侵染植物的病毒、细菌、真菌或线虫的抗性或耐受性，得到针对食植动物的抗性，得到针对除草剂、重金属和选择性标记试剂的抗性，得到针对非生物因子(如风、盐、寒冷和无氧条件)的抗性，进行基因和基因产物的功能性分析研究、使基因和基因产物沉默或加强(基因表达的调节)，修饰大分子和次生代谢物的组成(如提高营养价值或改变结构组成)，修饰植物发育以及改进水果或农作物品质(如收获后保存期或抗病性)。
在单子叶和双子叶植物中，启动子的功能和作用方式已得到广泛研究。在某些情况下，报告基因如编码β-葡糖醛酸酶的UidA基因[GUS；Jefferson等，EMBO J.6，3901-3907(1987)]或编码花色素苷合成或水母绿色荧光蛋白[GFP；Chalfie等，科学263，802-805(1994)]的基因可用于在瞬间或稳定基因表达系统中分析启动子活性。来自单子叶植物物种的启动子常在转基因双子叶植物中不表现可调性基因表达模式，尽管在转基因单子叶植物中它们表现高度可调性表达[Shimamoto，CurrentOpinion in Biotechology 5，158-162(1994)]。已在转基因单子叶植物中证实了几个启动子的高度可调性表达模式，尽管没有绝对的特异性。这些启动子包括光诱导和叶特异性的启动子、种子特异性启动子、分生组织特异性启动子、根特导性启动子、花特异性启动子、激素诱导的启动子、病原体诱导的启动子和组成型启动子。在单子叶和双子叶植物，已证明从相同群体的物种衍生而来的启动子表现相同或相似的高度可调性表达模式(Shimamoto，1994，同上)。
对于植物遗传工程中的许多目的，需要强的几乎组成型启动子以确保在整个植物中的足够表达。用于植物遗传操作的几个强的几乎组成型启动子已获得专利(如花椰菜花叶病毒的35S启动子-见美国专利号5,352,605；5,164,316；5,196,525；5,322,938和5,359,142)。然而当几个不同基因在植物中表达时(基因累积)，带有一个以上几乎组成型启动子可能是非常有用的。目前经常观察到用由相同启动子调控的几个基因转化的植物中出现基因沉默[Flavell，美国国家科学院院报91，3490-3496(1994)；Finnegan和McElroy，生物/技术12，883-888(1994)；Matzake等，Mol.Gen.Genet.244，219-229(1994)；Park等，植物杂志9，183-194(1996)]。此问题认为是由基于同源性的遗传干扰引起并且可以通过使用不同启动子用于基因累积来避免。
发明概述本发明的一个目的是提供在植物细胞中起作用的、可用于调控基因表达的遗传工程的启动子。
本发明的另一目的是提供含有与编码RNA和/或多肽的DNA可操作连接的一个或多个所述启动子的嵌合基因的至少一部分。
根据本发明的第一实施方案，提供在植物细胞中起作用的启动子，所述启动子包括(1)来自badnavirus、具有由SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3所定义的序列的分离DNA；(2)作为(1)的DNA的病毒同系物或植物基因组来源的变体的分离DNA；(3)(1)或(2)的分离DNA的启动子活性部分；(4)在严格条件下与(1)或(2)的DNA杂交的分离DNA；或者(5)(4)的分离DNA的启动子活性部分。
根据本发明的第二实施方案，提供一种DNA构建体，包含至少一个含有与编码序列可操作连接的至少一个根据第一实施方案所述的启动子的基因。
根据本发明的第三实施方案，提供一种DNA构建体，包含(1)含有与编码序列可操作连接的至少一个根据第一实施方案所述的启动子的第一个基因；以及(2)含有与编码序列可操作连接的启动子的第二个基因，其中所述第二个基因编码序列的表达产物调节所述第一个基因编码序列的表达产物的活性。
根据本发明的第四实施方案，提供在植物细胞中表达产物的方法，所述方法包括将根据第二实施方案所述的DNA构建体或所述构建体的RNA转录物导入植物细胞，其中DNA构建体或RNA转录物编码序列编码所述产物。
根据本发明的第五实施方案，提供一种植物细胞，其中所述植物细胞的基因组含有根据第二实施方案或第三实施方案所述的DNA构建体。
根据本发明的第六实施方案，提供一种植物、植物组织或植物繁殖材料，其中所述植物、植物组织或植物繁殖材料包含根据第五实施方案所述的细胞。
附图简述
图1表示含有与报告基因(GUS或GFP)融合的、来自栽培品种Mysore(My)、Gavendish型Williams(Cv)和Goldfinger(Go)的侵染澳大利亚香蕉的病毒分离物的启动子区域的启动子-报告基因构建体。
图2-图5表示使用图1的启动子-报告基因构建体分析瞬间启动子活性的结果。
图6是在标准化瞬间条件下不同启动子活性的比较。
图7-13表示使用图1的启动子-报告基因构建体分析稳定启动子活性的结果。
图14表示以转基因甘蔗叶中GFP合成为基础的半定量启动子活性比较。
图15表示以转基因香蕉植株不同组织中GUS合成为基础的定量启动子活性比较。
图16-18表示分别来自如SEQ ID NO1，SEQ ID NO2和SEQID NO3所示的序列的启动子pMy，pGv和pGo中的推测启动子元件。
实施本发明的最佳方案和其它方案下面缩写在整个本说明书中使用。
ER 内质网GFP 水母Aequorea victoria的绿色荧光蛋白GUS 大肠杆菌的β-葡萄醛酸酶MO 4-甲基伞形酮MUG 4-甲基伞形酰基-β-D-葡糖苷酸Nos 根瘤农杆菌的胭脂碱合酶终止子p35S 花椰菜花叶病毒35S启动子PCR 聚合酶链反应pCv 符合SEQ ID NO2序列的启动子区域PEG 聚乙二醇pGo 符合SEQ ID NO3序列的启动子区域pMy 符合SEQ ID NO1序列的启动子区域pUbi 玉米遍在蛋白启动子ScBV 甘蔗杆状badnavims为了使整个本说明书中所用的术语有明确和一致的意义，提供以下定义Badnavirus杆状DNA病毒编码序列编码功能性RNA转录物的核酸序列，可以或可以不随后翻译成多肽。
组成型启动子在生物的大多数细胞中有活性的启动子，使用术语几乎组成型是指启动子在植物发育过程中、在所有细胞类型中、大多数情况下有活性，但在植物发育的不同阶段在不同细胞类型中可能有不同比例的活性。
同系物来自另一生物或病毒分离物、与SEQ ID NO1的核苷酸1538-2105、SEQ ID NO2的核苷酸850-1322或SEQ ID NO3的核苷酸859-1297的序列有60％或更多序列相同性(或同源性)的核酸序列或者大于200bp并具有与对应于SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的DNA序列基本相同的功能的其部分。优选地，同系物具有至少70％或更优选地75％的序列相同性。
植物基因组来源的变体存在于植物基因组中并且与SEQ ID NO1(核苷酸1538-2105)、SEQ ID NO2(核苷酸850-1322)或SEQID NO3(核苷酸859-1297)的序列有60％或更多序列相同性(同源性)的DNA或者其大于200bp的片段。优选地，植物基因组来源的变体具有至少70％或更优选地75％的序列相同性。
启动子在基因编码序列5’端侧翼的DNA序列，包含参与编码序列转录的元件。
DNA中代表核苷酸的单字母与生物化学杂志219345-373(1984)中所述的IUPAC-IUB标准一致。除非另有说明，实施例中的百分比以重量/体积(w/v)给出。
本发明人已在对来自载培品种Mysore，Williams和Goldfinger的侵染澳大利亚香蕉的badnavirus病毒基因组进行PCR扩增得到的cDNA序列中鉴定到三个启动子序列。
这些启动子以及来自侵染香蕉的badnavirus的同系物和植物基因组来源的变体可以单独或与适当编码序列结合使用以制备能以适当水平表达目的基因的转基因植物。
根据本发明，可以通过从badnavirus基因组如来自栽培品种Mysore、Williams和Goldfinger的侵染澳大利亚香蕉的badnavirus分离物克隆病毒DNA，得到包含三个启动子的DNA。从感染的澳大利亚香蕉植株(栽培品种Mysore、Williams和Goldfinger)分离的BadnavirusDNA可以用限制性酶切割成片段，并且将片段亚克隆入能在宿主细胞如大肠杆菌中繁殖的质粒中。选择性地，启动子序列可以通过基因组DNA的直接聚合酶链反应(PCR)扩增来制备。所需引物可以从SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的序列资料设计。制备具有诸如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3中表示的那些序列的序列的启动子的另一方法是通过DNA合成。在具体情况下，如果较大启动子序列的启动子活性部分是所需的，那么10-100核苷酸的寡核苷酸可以方便地得到合成。可以合成互补寡核苷酸以形成具有所需核苷酸序列的双链分子。
如上所示，本发明不仅包括具有SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的序列的启动子，而且包括SEQ ID NO1、SEQ IDNO2或SEQ ID NO3的来自侵染香蕉的badnavirus的同系物和植物基因组来源的变体(如植物基因组整合的badnavirus或反转录转座子)。本发明进一步包括在严格条件下分别与包含SEQ ID NO1、SEQID NO2或SEQ ID NO3的核苷酸1538-2105、核苷酸850-1322或SEQ ID NO859-1297的DNA杂交的DNA。同系物和植物基因组来源的变体可能与SEQ ID NO1(核苷酸1528-2105)或SEQ ID NO2(核苷酸850-1322)或SEQ ID NO3(核苷酸859-1297)的DNA序列有最低约60％的相同性。根据本发明所述的启动子与SEQ ID NO1(核苷酸1538-2105)或SEQ ID NO2(核苷酸850-1322)或SEQID NO3(核苷酸859-1297)的DNA序列杂交的严格条件可以定义如下洗膜溶液-0.1x SSPE，0.1％SDS洗膜温度-65℃洗膜次数-二次(1x SSPE是180mM NaCl，10mM NaH2PO4，1mM EDTA(pH7.4))本发明优选的启动子序列的启动子活性部分是SEQ ID NO1的核苷酸1538-2105，SEQ ID NO2的核苷酸850-1322和SEQ ID NO3的核苷酸859-1297。甚至更优选的是SEQ ID NO1的核苷酸1806-2105，SEQ ID NO2的核苷酸1023-1322和SEQ ID NO3的核苷酸998-1297。
根据第二和第三实施方案所述的DNA构建体可以包含一个以上与编码序列可操作连接的启动子。这些启动子可以是相同启动子、相同启动子的衍生物或异源启动子。另外，可操作连接的调控元件如增强子或沉默子可以包含在DNA构建体中。
在第二和第三实施方案的DNA构建体中，与启动子可操作连接的编码序列可以编码作用为反义RNA、核酶或结构成分的RNA或翻译成作用为酶、结构成分或具有其它生理活性的多肽。编码序列可编码一个以上RNA或一个以上多肽。而且，编码序列可以编码至少一个RNA和至少一个多肽的组合。使用根据本发明所述的启动子在转基因植物中有效表达的转基因产物的例子是那些帮助(1)得到针对侵染植物的病毒、细菌、真菌或线虫的抗性或耐受性，(2)得到针对食植动物的抗性，(3)得到针对除草剂、重金属和选择性标记试剂的抗性，(4)赋予针对非生物因子(如风、盐、寒冷和无氧条件)的抗性，(5)进行基因和基因产物的功能性分析研究、(6)使基因和基因产物沉默或加强(基因表达的调节)，(7)修饰大分子和次生代谢物的组成(如提高营养价值或改变结构组成)，(8)修饰植物发育，或(9)改进水果或农作物品质(如收获后保存期或抗病性)的产物。
关于本发明的第三实施方案，DNA构建体的第一个基因包括含有第二实施方案的DNA构建体的基因的所有变异和选择。DNA构建体的第二个基因可以有(1)互补或增强第一个基因表达产物的效应，(2)中和第一个基因的表达产物，或(3)修饰第一个基因启动子活性的表达产物。
这些选择通过将第二个基因与由第一个基因启动子介导的强表达连锁来确保基因表达的高水平调控。
从发明概述可注意到，本发明包括转基因植物细胞，它带有含有第二和第三实施方案的DNA构建体的遗传工程基因组。这些DNA构建体也可以包含在植物细胞中稳定或瞬间表达的、带有一个或多个目的编码序列的重组病毒序列中。选择性地，可以从可用于转化植物细胞的这些构建体制备RNA转录物。
将DNA导入植物基因组的技术在本领域众所周知并且例如由Sagi等。描述[生物/技术13，481-485(1995)；May等，生物/技术13，485-192(1995)；Zhong等，植物生理学110，1097-1107(1996)]。
使用包括农杆菌介导的转化、用DNA包裹的钨或金颗粒biolistic轰击、电穿孔或聚乙二醇(PEG)介导的原生质体DNA转化、真空渗透和其它机械DNA转移技术在内的各种方法将根据本发明所述的DNA构建体有效地导入靶植物细胞的基因组。含有本发明的核苷酸的转基因植物细胞可以使用对特定植物适当的条件进行繁殖。相似地，可以使用已知方法和条件从原始转基因细胞制备完整植物或植物的繁殖材料。
根据本发明所述的启动子可用于单子叶和双子叶植物以及裸子植物和蕨类。例如，启动子在以下单子叶植物物种中有活性甘蔗、香蕉、玉米、小米、高梁。本发明启动子在其中有活性的双子叶植物物种包括烟草、canola、Tipu树和Nicotiana benthamiana。本发明启动子在其中有活性裸子植物和蕨类植物分别包括辐射松(radiata pine)和鱼骨蕨(fishbone fern)。
为了使本发明可以得到更好的理解，下面描述几个非限制性实施例。基本方法使用已知方法进行DNA操作，如Sambrook等所述的那些方法[分子克隆实验指南，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港NY(1989)，本文全文引其内容作为互相参考]。试剂和其它物质来自商业来源或如特别指出的。实施例1新型启动子的克隆从香蕉载培品种Mysore(Musa组AAB)和来自湿热带农业中心，South Johnstore，North Queensland，Australia的Williams(Musa组AAA)以及来自Deeral，North Queensland，Australia田间的Goldfinger得到感染的叶材料，从感染的叶材料得到Badnavirus分离物。
使用修饰的用于纯化椰树肿枝badnavirus的方法从载培品种Myscore分离Badnavirus的病毒粒子[Lot等，普通病毒学杂志72，1735-1739(1991)]。通过在6倍体积的抽提缓冲液[含有5mM二乙基二硫代氨基甲酸(DIECA)、0.2％硫代甘油、0.5聚乙二醇(PEG)6000和0.5％(v/v)celluclast(Novo Industries)的50mM NaH2PO4/NaHPO4缓冲液(pH 6.1)]中混合将薄片组织匀浆。加入另外2体积抽提缓冲液并将制品于室温、100rpm摇动5小时并于4℃放置过夜。将匀浆物通过4层粗棉布过滤并将滤液在SW HS4转子(sorvall)中于10℃、3,950rpm(3000xg)离心20分钟。向上清加入NaCl至0.2M和PEG6000至9.5％，搅拌15分钟，然后在室温放置3小时。通过在SW HS4转子中于10℃、7,000rpm(10,000xg)离心20分钟沉淀PEG沉淀。将沉淀重新悬浮于1/30原始抽提体积的重新悬浮缓冲液(50mM NaH2PO4/Na2HPO4，PH6.8，含有0.2M NaCl，0.1％Na2SO3和5mM EDTA)中。通过在SS34转子(Sorvall)中于8,180rpm(8,000xg)离心使悬浮液澄清，保留上清液并将沉淀再次重新悬浮于1/30原始抽提体积的重新悬浮缓冲液中。重复离心、收集上清并除去最后的沉淀。将Celite(硅藻土的商品名，每30g起始材料2g)加入上清中，混合并通过布氏漏斗在轻微吸力下过滤。向滤液加入NaCl至0.2M和PEG6000至7％并将混合物转到4cm Celite柱上。在2cm直径的30ml针筒中制备柱并用重新悬浮缓冲液平衡。用逐步添加的含有5％、3％、1％然后0％PEG6000的25ml等分重新悬浮缓冲液在轻微吸力下洗脱病毒。将从每步洗脱的洗脱液在SA 600转子(sorvall)中于10℃、6,950rpm(7,000xg)离心10分钟并将上清在70Ti转子(Beckman)中于50,000rpm(25,500xg)离心50分钟。将沉淀重新悬浮于100μl 50mM柠檬酸三钠缓冲液(pH7.0)中，用相同体积2％磷钨酸钾负染对等分样品染色，并通过电子显微镜检查病毒的存在。
汇集含有病毒的组分并铺在柠檬酸缓冲液中的10-40％蔗糖浓度梯度上，并且在SW 41转子(Beckman)中于35,000rpm(16,500xg)离心。使用ISCO分馏器分级分离梯度，监测254nm处的吸光度并取出0.5ml组分。汇集吸光度峰下的组分，在柠檬酸缓冲液中稀释，并且通过在75Ti转子(Beckman)中于4℃、53,000rpm(29,000xg)离心30分钟沉淀。将沉淀重新悬浮于50μl柠檬酸缓冲液中，用等体积2％磷钨酸钾溶液对等分样品染色并通过电子显微镜检察病毒浓度和纯度。
使用总核酸提取方法[Lot等，J.Gen.Virol.72，1735-1739(1991)]制备病毒DNA。用XhoII将其部分切成片段并亚克隆入事先用BamHI切割并去磷酸化的pBluescriptIISK+(stratagene)中。从这些克隆得到的序列用作设计引物L2838-正向的基础，引物L2838-正向与简并badnaT引物结合使用(见参考文献Lockhart和Olszewski，培育对疾病和害虫有抗性的香蕉和车前草，105-113页，J.Ganry编，Montpellier，France，CIRAD/INIBAP，1993)用于PCR扩增。引物序列如下L2838-forward(SEQ ID NO)5′-CCC AGG AAT AAA CAC GAT TAT CAG TC-3′badnaT(SEQ ID NO5)5′-CAC CCC CGG G(A/C)(C/T)(A/C)(A/T)(A/C/G/T)GCT CTG ATA CCA-3′将PCR混合物[含有2.5μl 10x PCR缓冲液(Gibco BRL)，0.625μl50mM MgCl2溶液，1.125μl 20μM L2838-正向引物，2.5μl 4μM badnaT引物，0.5μl 10mM dNTPs，0.2μl Taq DNA聚合酶(Gibco BRL)，16.55μlH2O和1μl纯化badnavirus DNA的1∶200稀释液]在Hybaid OmniGene热循环仪(Stratagene)中按照厂商说明用程序性条件(94℃ 2分钟；35个循环，每循环94℃0.5分钟，62℃0.5分钟，72℃2分钟)温育。在经电泳与其它PCR产物分开之后，按照厂商说明将2kb产物亚克隆入pCR-Script SK+(stratagene)中。此克隆称为pCRBSV2。
使用修饰的Ahlawat等，植物病害80，590-592(1996)的小量病毒粒子浓缩方法制备来自Cavendish型栽培品种Williams和Goldfirger的Badnavirus粒子。用研钵和杵在液氮中研磨薄片组织。加入2倍体积小量抽提缓冲液(0.2M KH2PO4/K2HPO4，pH7.0，含有15mM EDTA，2％PVP，2％PEG 6000和0.4％Na2SO3)。再次研磨后，将抽提物通过四层粗棉布过滤。然后将滤液SW HS4转子(sorvall)中于4℃、7,000rpm(10,000xg)离心15分钟并收集上清。向上清中加入1/15体积的33％(v/v)Triton X-100，将上清轻轻摇动，然后在70Ti转子(Beckman)中于4℃、45,000rpm(24,000xg)离心45分钟通过0.2M KH2PO4/K2HPO4缓冲液(pH7.0)中的5ml 30％蔗糖垫底。用蒸馏水轻轻洗沉淀并重新悬浮于100μl 0.1M KH2PO4/K2HPO4缓冲液(pH7.0)中。向悬浮液加入30μl体积氯仿，通过混合乳化并将乳浊液在台式微量离心机中于13,000rpm离心5分钟。取出上清，用等体积2％磷钨酸钾溶液对等分样品染色并通过电子显微镜检测。
在用25μl 50mM碳酸钠缓冲液(pH9.6)中的1μg/ml甘蔗杆状病毒(ScBV)抗体(Agdia)覆盖的0.6ml薄壁PCR试管中进行免疫捕获PCR。于室温温育3小时(对于Goldfinger分离物是4小时)后，通过用PBST[137mM NaCl，6.4mM Na2HPO4×2H2O，1.4mM KH2PO4，PH7.4，含有0.1％Tween 20(sigma)]转洗三次(对于Goldfinger分离物是二次)洗涤试管。加入25μl浓缩的病毒提取物之后，将试管于室温温育3小时(对于Goldfinger分离物是于4℃过夜)，然后用PBST洗二次，用H2O洗一次，在进行PCR之前除去水。使用简并引物badnaT和badna3(Lockhart和Olszewski，同上)进行PCR扩增。badna3的序列如下badna3(SEQ ID NO6)5′-AAT AGC GGC CGC AT(A/C/T)AT(A/C/T)AT(A/C/T)GA(A/G)AC(A/C/G/T)GA-3′将PCR混合物[对于Williams分离物，含有5μl缓冲液A(GibcoBRL)，5μl缓冲液B，5μl 4μM badna3引物，5μl 4μM badnaT引物，2.5μl1mM dNTPs，2l Elongase(Gibco BRL)和25.5μl H2O；而对于Goldfinger分离物，含有2.5μl 10x PCR缓冲液(Gibco BRL)，0.75μl50mM MgCl2，2.5μl 4μM badna 3引物，2.5μl 4μM badnaT引物，1.25μl1mM dNTPs 0.4μl Taq DNA聚合酶(Gibco BRL，5单位/μl)和5.1μl H2O]加入含有免疫捕获的病毒粒子的试管中，用20μl矿物油覆盖，在HybaidOmniGene热循环仪(Stratagene)中按照厂商说明用程序性条件(4个循环，94℃0.5分钟37℃0.5分钟，72℃2分钟；30个循环，每循环94℃0.5分钟，55℃0.5分钟，72℃2分钟)温育。在经电泳与其它PCR产物分开之后，按照厂商说明将1.3kb产物亚克隆入pCR2.1(Invitrogen)中。这些克隆称为pCRBSVCv(Willams分离物)和pCRGF2(Goldfinger分离物)。
首先使用引物进行测序，引物位点存在于载体以及随后得到的序列中，测序使用FS Terminator Premix(PRISM备好反应染料双脱氧终止循环测序试剂盒，Applied Biosytems)和自动DNA测序仪(AppliedBiosystems)。得到所有三个PCR产物的全长序列并使用澳大利亚国家基因组信息服务(ANGIS)软件包鉴定为badnaviurs序列。PCR产物的全长序列在SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3中表示。所有三个序列包含badnavirus ORF3 3’端部分的编码区(分别为核苷酸1-1537、1-849和1-858)和5’端非编码区(分别为核苷酸1538-2105、850-1322和859-1297)。在下面实施例5中将详细描述对非编码区3’端启动子序列元件的进一步分析。实施例2嵌合基因的构建如图1中所示，使用上述PCR产物作为启动子与编码GUS或GFP的报告基因连接制备几个构建体。
使用pUbiGUS作为基础构建启动子-报告基因表达元件盒以进行采用biolistic或PEG介导的转化技术的植物细胞转化(图1A)。pUbiGUS含有玉米遍在蛋白启动子[Christensen等，植物分子生物学18，675-689(1992)；Christensen和Quail，转基因研究5，213-218(1996)]、GUS报告基因[Jefferson等，EMBO J.6，3901-3907(1987)]和pUC118中来自根瘤农杆菌的胭脂碱合酶(nos)终止子序列。
pMyGUS含有来自Mysore的badnavirus PCR片段(3’端BadnaT引物)，代替了玉米遍在蛋白启动子(图1B)。它通过将来自pCRBSV2的BamHI/NotI切出的补平末端的2kb片段连入pUbiGUS的BamHI/HindIII切出的补平末端并去磷化的4.8kb片段而得到构建。
pCvGUS含有来自Williams的badnavirus PCR产物(3’端BadnaT引物)，代替了玉米遍在蛋白启动子(图1C)。它通过将来自pCRBSVCv的BamHI/NotI切出的补平末端的1.3kb片段连入pUbiGUS的BamHI/HindIII切开的补平末端并去磷化的4.8kb片段而得到构建。
另外，使用pUbiGFP作为基础构建启动子-报告基因表达元件盒以进行采用biolistic或PEG介导的转化技术的植物细胞转化(图1D)。pUbiGFP含有玉米遍在蛋白启动子、修饰的GFP报告基因[sGFP(S65T)；Chiu等，Current Biol. 6，325-330(1996)]和胭脂碱合酶(nos)终止子序列。
pMyGFP含有来自Mysore的badnavirus PCR片段(3’端BadnaT引物)，代替了玉米遍在蛋白启动子(图1E)。它通过将来自pCRBSV2的BamHI切出的补平末端的2kb片段连入pUbiGFP的XbaI切开的补平末端并去磷化的4.2kb片段而得到构建。
pCvGFP含有来自Williams的badnavirus PCR产物(3’端BadnaT引物)，代替了玉米遍在蛋白启动子(图1F)。它通过将来自pCRBSVCv的XbaI/BamHI切出的1.3kb片段连入pUbiGFP的XbaI/BamHI切开的去磷化的4.8kb片段而得到构建。
pGoGFP含有来自Goldfinger的badnavirus PCR产物(3’端BadnaT引物)，代替了玉米遍在蛋白启动子(图1G)。它通过将来自pCRGF2的EcoRV/bamHI切出的1.3kb片段连入pCvGFP的EcoRV/BamHI切开的4.8kb片段而得到构建。
而且，使用pBIN-mGFP5-ER和pArt27/35S GUS作为基础构建用于农杆菌介导的植物转化的启动子-报告基因表达元件盒(分别为1H和图1I)。pBIN-mgfp50-ER(Dr J.Haseloff，MRC分子生物学实验室，Addenbrookes Hospital，Cambridge，UK赠予)含有花椰菜花叶病毒35S启动子、GFP报告基因的ER靶向突变形式mgfp5-ER和nos终止子。pArt27/35SGUS含有花叶菜花叶病毒35S启动子[Odell等，自然313，810-812(1985)]、GUS报告基因和pArt27中的nos终止子[Gleare，植物分子生物学20，1203-1207(1992)]。pArtUbiGUS含有玉米遍在蛋白启动子，代替了pArt37/35S GUS的35S启动子(图1J)。
pArtMyGUS含有来自Mysore的badnavirus PCR片段(3’端BadnaT引物)，代替了35S启动子或玉米遍在蛋白启动子(图1K)。它通过将来自pMyGFP的HindIII/BamHI切出的1.6kb片段连入pArtUbiGUS的HindIII切开而BamHI部分切割的13kb片段而得到构建。
pCvmGFP5-ER含有来自Williams的badnavirus PCR片段(3’端BadnaT引物)，代替了35S启动子(图IL)。它通过将来自pCvGFP的EcoRV/BamHI切出的1.3kb片段连入pBIN-mgfp5-ER的HindIII(补平末端)/BamHI切开的13kb片段而得到构建。
使用Qiaprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)从大肠杆菌制备所有质粒DNA。
发现嵌合基因可用于估评启动子活性，使用发展并优化用于此目的的体内瞬间和稳定表达系统。实施例3在瞬间条件下在植物细胞中分析启动子活性几种体外测试系统可用于在瞬间条件下分析实施例2的启动子-报告基因构建体。这些系统是(1)使用GUS分析，对单子叶植物物种(香蕉、玉米、小米、高梁)，双子叶植物物种(烟草、canola，Nicotiana benthamiana，Tipnanatipu)，裸子植物物种[辐射松(Pinus radiata)]和蕨类植物(Nephrolepiscordifolia)的叶和其它植物器官的biolistic基因转移。
(2)使用GFP分析，对玉米叶和甘蔗愈伤组织的biolistic基因转移；以及(3)使用与内部标准的比较GUS分析，对玉米叶的biolistic基因转移。
对上述第一种测试系统使用下述方法。
从温室培养植物切下玉米(甜玉米载培品种Iochief Improved)、香蕉(载培品种Williams)、小米、高粱和N.benthamiana的叶并分成3-4cm长小块。将它们在轻微振荡下于氯溶液(0.1％NaOCl.0.1％Tween20)中表面消毒30分钟。随后用无菌去离子水冲洗并将其背轴面朝上放在含无菌“高盐MS”培养基的培养皿上[MS培养基按照Murashige和Skoog，植物生理学75，473-497(1962)，含有0.2M甘露醇和0.2M山梨醇)5小时以降低细胞膨压。
对于微粒轰击，将叶块背轴面朝上转移到不含甘露醇和山梨醇的上述MS培养基上。使用直径1.6μm的金颗粒作为DNA载体。它们通过在70％乙醇中洗、振荡3分钟、放置15分钟并在30秒离心后除去液体来制备。重复下述步骤三次将颗粒重新悬浮于无菌去离子水中、振荡1分钟、放置1分钟并通过在微量离心机中离心30秒沉淀。然后，以60mg/ml浓度将金颗粒重新悬浮于无菌50％(v/v)甘油中并在使用前振荡5分钟。
对于每种所用的质粒构建体(pMyGUS、pCvGUS和pUbiGUS；实施例2)，制备一套四份DNA载体将50μl金颗粒悬浮液转移到1.5ml无菌离心管中并且再次充分振荡2.5分钟。在连续振荡试管的情况下，按以下顺序加入10μl DNA(0.5μg/μl)、50μl 2.5M CaCl2无菌溶液和20μl0.1M亚精胺溶液(无菌并在使用前以20μl小份保存在-70℃)。将混合物再振荡2分钟、放置1分钟并通过离心10秒沉淀。在不搅动沉淀的情况下，在140μl 70％乙醇中和140μl 100％乙醇中洗，沉淀并将其重新小心悬浮于50μl 100％乙醇中，然后将10μl小份分在无菌载体膜上，随后在干燥器中干燥。在用于DNA转移的PDS-1000/He Biolistic颗粒转移系统(BioRad中，将载体膜放在离可裂膜4cm处并将叶块放在离载体膜8cm处，按照Sandford等，酶学方法217483-509(1993)和Heiser，BioRad US/EG Bulletin 1688(1993)所述的方法使用900psi和1550psi之间的压力。
从在Queensland大学，St.Lucia，Australia的温室、培养箱和观赏植物花园中生长的植物新鲜切下烟草(载培品种Xanthi)、Canola、tipu树(Tipuana tipu)、松树(辐射松)和鱼骨蕨(Nephrolepis cordifolia)的叶和其它植物器官。将所有植物材料背轴面朝上放在装有预湿的圆滤纸的培养皿上。
使用定制的Helium压力驱动颗粒轰击枪，按照修饰的Finer等[植物细胞报告11323-328(1992)]的方法进行金颗粒的制备、将DNA包裹在金颗粒上以及微粒轰击将60mg金颗粒重新悬浮于1ml 70％乙醇中2分钟，随后通过在微量离心机中离心10秒并重新悬浮于无离子水中来洗涤。贮备液(室温下保存6-8周)通过离心10秒并将金颗粒重新悬浮于500μl 50％(v/v)甘油溶液中而得到制备。对于每种用于微粒轰击的构建体，将金颗粒重新剧烈悬浮并取出50μl至干净试管中并再振荡1分钟。在振荡过程中，加入作为混合物的新鲜制备的质粒DNA(QiaprepMini离心试剂盒)，混合物中含有5μl GUS构建体(0.25μg/μl)，50μl 2.5MCaCl2溶液和20μl 0.1M亚精胺溶液。再振荡一分钟后，将颗粒放置5-10分钟，然后离心5秒钟。除去多余上清并将颗粒重新悬浮于20μl上清中。在振荡过程中，每次轰击取出3μl并放在3mm Swinney塑料针筒滤膜器(Gelman sciences)的中央。使用容器内7巴(100psi)的Helium驱动压和-0.85巴(-85kPa)负压以18cm距离轰击植物材料。
轰击后，将所有植物材料在培养箱(25℃，16小时光照)中放置48小时，然后转移到X-Gluc溶液[溶于50ml/l DMSO中的1.25g/l 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D葡糖醛酸，5mM铁氰化物，5mM亚铁氰化物，0.3(v/v)Triton X-100，10％(v/v)甲醇，10mM EDTA(pH8.0)，0.1M磷酸钠缓冲液(pP7.0)]中，于37℃温育12小时。
根据蓝点的数目和大小测定的GUS活性用作启动子活性的指标。蓝点在附图中提供的相片的黑白拷贝中呈黑点。几套实验各使用启动子-报告基因构建体pMyGUS和pCvGUS。为了比较，加上pUbiGUS用于单子叶植物，并且加上pBI221(常用的植物转化载体，含有CaMV 35S启动子、GUS报告基因和nos启动子，Stratagene)用于双子叶植物、裸子植物和蕨类植物材料。
使用所有三个启动子(pMy、pCv和pUbi)用于单子叶植物瞬间转化实验，在玉米，香蕉、小米和高粱叶中的GUS分析表现明显的启动子活性，而使用无启动子GUS构建体或无DNA的对照实验不表现活性。作为例子，图2表示以1550psi压力用pMyGUS(图2A)、pCvGUS(图2B)和pUbiGUS(图2C)轰击玉米叶的典型结果。用于双子叶植物、裸子植物和蕨类植物物种瞬间转化实验的所有三个启动子(pMy、pCv和p35S)对于测试的植物器官表现明显启动子活性。测试的植物器官是烟草、Nbenthaminana、tipu树和鱼骨蕨的叶，Canola的叶和茎以及辐射松的茎和雄花序花瓣。作为例子，图3表示用pMyGUS(分别为图3A、图3D和图3G)、pGvGUS(分别为图3B、3E和图3H)以及pBI221(分别为图3C、图3F和图3I)轰击双子叶植物Canola、烟草和tipu树的叶块的典型结果。图4表示用pMyGUS(分别为图4A和图4D)、pGvGUS(分别为图4B和4E)以及pBI221(分别为图4C和图4F)轰击辐射松雄花序的花瓣和鱼骨蕨的叶块的典型结果。通过用构建体pMyGUS和pCvGUS转化产生的蓝点的数目和密度证明SEQ ID NO1和SEQ ID NO2在所有测试物种中表明明显的启动子活性。
对于上述第二种测试系统，使用下面方法。
使用上述微粒轰击枪，用pGoGFP微粒轰击玉米。轰击后24小时，使用装有带GFP Plus滤膜器的发荧光组件的Leiza MZ6立体显微镜(Leica显微镜和科学仪器，瑞士)对GFP表达进行肉眼观察。绿色发荧光细胞的检测结果用作启动子活性的指标。绿色发荧光细胞在相片的黑白拷贝中呈白色。图2D中所示的结果证明SEQ ID NO3在瞬间表达条件下在玉米叶中有启动子活性。
从正好在顶端分生组织上的10cm区域取幼叶组织，并从其诱导甘蔗胚发生愈伤[Taylor等，植物细胞、组织、器官培养28，69-78(1992)]。愈伤诱导培养基(MSC3)含有MS盐和维生素(Sigma)、0.5g/l酪蛋白水解物(Gibco蛋白胨140)、20g/L蔗糖、10％(v/v)椰汁、3ml/l 2，4-D，pH6.0并用0.8％琼脂(J级，Davis)固化。在30℃、黑暗条件下每14天有规律地传代诱导愈伤并需要6周选择性传代。
使用微粒轰击枪[Finer等，植物细胞报告11，323-328(1992)]。用2,100 kPa气输出压、28mmHg真空和0.5毫秒输出间隔进行微粒轰击。将质粒DNA沉淀在钨颗粒(M10，Sylvania Chemicals)上，在上述渗压剂培养基上进行7cm2中心区域内5-10mm直径单个愈伤组织的轰击[Bower等，分子育种2，239-249(1996)]。
在与5μg pEmuKN[Chamberlain等，澳大利亚植物生理学杂志21，95-112(1994)]的混合物中各使用5μg量的pMyGFP、pCvGFP或pUbiGFP(实施例2)用于微粒轰击以评估甘蔗愈伤组织中的启动子活性并使转基因在卡那霉素选择下再生(见实施例4)。在轰击后2和7天以及2和12个月使用上述荧光显微镜肉眼观察甘蔗组织中的GFP表达(稳定表达的结果在实施例4中)。
图5表示在轰击后2天荧光显微镜下拍摄的用pMyGFP(图5A)、pCvGFP(图5B)和pUbiGFP(图5C)轰击的甘蔗愈伤相片。所有三个构建体pMyGFP和pCvGFP和pUbiGFP的荧光点的数目和强度证明，两个新启动子(pMy和pCv)在甘蔗愈伤组织中表现瞬间启动子活性。
下述方法用于上述第三种测试系统。
在瞬间转化条件下，在玉米叶上进行pMy和pCv与四个其它已知启动子的比较，在微粒轰击过程中使用构建体pUbiGTP作为内部标准。内部标准的使用可监测每次轰击的效率并作为常常在瞬间基因表达分析中观察到的高可变性的补充。
制备玉米叶(甜玉米，载培品种IoChief Improved)并用于上述微粒轰击。用于比较的四个启动子-GUS构建体是pBI221、pMG221、pUbiGUS和pACT1-D，它们分别含有来自花椰菜花叶病毒的35S启动子[Mitsuhara等，植物细胞生理学3749-29(1996)]、用来自玉米shrunken-1基因的3’外显子/内含子插入片段加强的35S启动子[Maas等，植物分子生物学16199-207(1991)]、玉米遍在蛋白启动子(Christensen和Quail，1996，同上)和水稻肌动蛋白1基因启动子[McElroy等，植物细胞2163-171(1990)]，并与uidA基因和nos终止子融合。对于每个实验，按上述制备每种构建体pBI221、pMG221、pUbiGUS、pACT1-D、pMyGUS和pCvGUS的一套4份DNA载体，除了将0.5μl(0.25μg/μl)pUbiGFP包含在内作为内部标准的变化。48小时后，在荧光立体显微镜下测定对于每种构建体所有叶块的产生GFP的细胞数。随后，按上述将所有叶片在X-gluc染色溶液中温育并测定每种构建体产生GUS点的数目。通过将产GUS点的数目除以产GFP的细胞数而得到标准化的活性值(图6)。以用pBI221得到的数值将所有数值标准化。总结于图6中的结果表明在瞬间条件下玉米叶中得到的pMy和pCv活性在以前已用于单子叶植物中高水平基因表达的启动子范围内pMy产生比p35S高1.5倍的瞬间活性和几乎pUbi一半的活性；而pCv产生比p35S高3倍的活性和与pUbi几乎相同的活性。
实验例3的结果表明，SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ IDNO3中所示的序列分别在体内作用为活性启动子。结果进一步证明SEQID NO1和SEQ ID NO2的启动子在瞬间条件下强表达，它们提供用于植物中基因表达和遗传工程的有利工具。实施例4在稳定条件下分析植物细胞中的启动子活性几种体外测试系统可用于在植物细胞中稳定表达条件下分析实施例2的启动子-报告基因构建体。这些系统是(1)对甘蔗和烟草愈伤组织进行biolistic基因转移，在30天或更长时间后使用GFP分析；(2)转化和再生植株(香蕉、甘蔗)的GUS和GFP分析；(3)转基因甘蔗中GFP合成的半定量比较Western印迹分析；以及(4)对转基因香蕉植株的不同器官进行定量比较GUS活性分析。
使用上述系统(1)，以现在描述的方式使用实施例3中所述的甘蔗转化方法。
轰击后，将愈伤组织放在含有40μg/L遗传霉素(Sigme)的选择性愈伤诱导培养基(MSC3)上。使用实施例3中所述的方法在轰击后2个月监测GFP活性。绿色荧光在相片的黑白拷贝中呈灰或白色。
图7表示在轰击后2个月在荧光显微镜下拍摄的用pMyGFP(图7A)、pCvGFP(图7B)和pUbiGFP(图8C)轰击的甘蔗愈伤相片。两个构建体pMyGPF和pCvGPF的发荧光愈伤的强度与由pUbiGFP产生的发荧光愈伤的强度相同，证明两个新启动子在甘蔗愈伤组织中表现与玉米遍在蛋白启动子相似的稳定活性。
使用上述测试系统(1)，按照Ellis等[EMBO J.611-16(1987)]所述的方法，使用含有双元载体pBIN-mgfp5-ER、pArtMyGUS或pCvmGFP5-ER的根瘤农杆菌菌株LBA4404制备转基因愈伤和小植株。使用荧光显微镜分析用pBIN-mgfp5-ER和pCvmGFP5-ER转化的转基因形成芽的愈伤和根。图8表示用pCvmGFP5-ER(分别为图8A和图8C)和pBIN-mgfp5-EP(图8B和图8D)转化以及未转化的愈伤的结果(图8E)。尽管没有得到烟草植物中启动子活性的定量，但是结果表明pCv可能对转化单子叶植物有用。
使用上述测试系统(2)，制备含有与报告基因融合的启动子pMy、pCv和pUbi的转基因甘蔗和香蕉植株。
使用来自六次上述轰击的40块用pMyGFP转化的独立甘蔗愈伤再生出分为21个独立株系的125株甘蔗植株，使用来自五次轰击的72块用pCvGFP转化的独立甘蔗愈伤再生出分为18个独立株系的109株甘蔗植株。为了比较，使用来自12次轰击的40块用pUbiGFP转化的独立甘蔗愈伤再生出来源于16个独立株系的37株甘蔗植株。使用GFP荧光鉴定转基因细胞并确定它们的独立状态。将植株转移到温室的盆中并使之生长直至植株高达70-120cm(转化后12个月)。为证明与GFP报告基因融合的pMy和pCv的存在，选择几种用pMyGFP和pCvGFP转化的植株进行DNA提取和PCR分析，PCR分析使用覆盖启动子区域和GFP报告基因的一部分的引物。按照Chang等，植物分子生物学报告9389-410(1993)的方法从甘蔗叶(各200mg)分离植物总DNA。使用用于扩增约650bp片段的引物MyA(SEQ ID NO75’-AGAGGCGCCCCTGGTATTGG-3’)和GFP-B(SEQ ID NO8；5’-AGATGGTGCGCTCCGGGACG-3’)对来自用pMyGFP转化的植物的叶提取物进行PCR从而证实与GFP报告基因融合的pMy启动子的存在。使用用于扩增约550bp片段的引物CvA(SEQ ID NO9；5’-CCTAAC GAT GCG GGA AGC CG-3’)和GFP-B对来自用pCvGFP转化的植物的叶提取物进行PCR从而证实与GFP报告基因融合的pCv启动子的存在。来自未转化植株的提取物作为负对照。所有引物用PacmcOligos，Lismore，Australia合成。所有分析的植物的PCR产物在DNA凝胶电泳中表现预期的条带大小，而负对照没有条带(资料未显示)。
为了评估GFP合成，按上述在立体荧光显微镜下分析每种转基因甘蔗的几株植株的最新鲜叶片。采用分为0-5的相对数字(0是没有可检测到的GFP存在，而5是GFP合成的最高水平)对叶中GFP的量进行评级。另外，分析来自所选植物的根材料(资料未显示)。用pMyGFP转化的植物的相对数是0-2，而用pCvGFP或pUbiGFP转化的植物表现在叶中存在高得多的GFP，相对数为0-5。图9表示在荧光显微镜下拍摄的用pMyGFP(分别为图9A和9D)、pCvGFP(分别为图9B和图9E)、pUbiGFP(图9C，只有叶)转化的甘蔗植株叶和根以及未转化对照植物叶(图9F)的相片的复制。用pMyGFP转化的植株常常在叶维管组织周围表现最强的表达，用pCvGFP或pUbiGFP转化的甘蔗植株的叶一般在所有分析的细胞中表现组成型表达。通过用金属刺(45/cm2)使用pMyGFP、pCvGFP和pUbiGFP转化的甘蔗植株和未转化植株的叶受伤来测试启动子的创伤诱导性。48小时后进行GFP荧光分析，在用pCvGFP和pUbiGFP转化的叶损伤区域周围表现GFP合成增加，而对用pMyGFP转化的叶或未转化的叶没有观察到荧光增加。图9I表示损伤48小时后，用pGvGFP转化的甘蔗植株叶的一部分。
使用带有Biorad MRC 600光源和于488nm激发的适当滤膜的聚焦显微镜(Zeiss)于509nm测量发射进行更详细的不同叶细胞层的研究。图10表示对用pMyGFP(图10A)、pCvGFP(图10B)和pUbiGFP(图10C)转化的植物和未转化植物的背轴面朝上的甘蔗叶以9μm距离9次系列扫描的叠加Z系列的数字图象。观察到所有共质体的细胞类型表现GFP的存在，表明所测启动子的几乎组成型表达。正如以前观察到的，在用pGvGFP转化的甘蔗叶中可以观察到最强的GFP荧光，然后是pUbiGFP和pMyGFP，后者在除了维管组织周围的那些细胞以外的细胞中产生更低表达(图10)。图11表示图10B中所示的用pCvGFP转化的叶的Z系列的三个重叠图像中的二套。图11A覆盖了大部分上层细胞，包括表皮；而图11B表示通过维管束及其周围细胞的截面。对一些细胞可观察到核中GFP的积累。
按照Sagi等(1995，同上)所述的方法，在组织培养物中制备转基因香蕉植株(栽培品种Three Hand Planty)。在将含有pMyGUS和pCvGUS的pAct-neo嵌合基因一起轰击入香蕉胚发生细胞培养物之后，已分别再生出65和61株遗传霉素抗性植株。随后在体外用微繁殖法(micropropagation)繁殖植物。
为证实与GUS报告基因融合的pMy和pCv的存在，选择表现GUS表达的用pMyGUS和pCvGUS转化的几株香蕉植物进行DNA提取和PCR分析，PCR分析使用既覆盖引物区域又覆盖报告基因的一部分的引物。按照Dellaporta等的方法[植物分子生物学报告119-21(1983)]从香蕉叶分离植物总DNA。简言之，将30-100mg叶或根组织在1.5ml微量离心管中用500μl抽提缓冲液(100mM Tris-HCl，pH8.0；50mMEDTA，pH8.0；500mM NaCl；10mM β-巯基乙醇；2％聚乙烯吡咯烷酮，MW＝10,000)研磨。在加入33μl 20％SDS之后，振荡混合并于65℃温育10分钟。随后加入100μl 5M乙酸钾溶液(pH5.2)，振荡试管并在微量离心机中于13,000rpm离心10分钟。将无碎片上清转移到干净试管中之后，通过加入等体积异丙醇、振荡并于13,000rpm离心10分钟沉淀DNA。在70％(v/v)乙醇中小心洗沉淀并且打开管面对轻气流使之空气干燥20-25分钟，之后重新悬浮于20μl无菌去离子水中。
使用引物MyA(SEQ ID NO7)和引物GUS1R(SEQ ID NO10；5’-CTT GTA ACG CGC TTT CCC ACC-3’)对来自用pCvGUS转化的植物的叶提物进行PCR以扩增450bp片段从而证实与GUS报告基因融合的pMy启动子的存在。使用引物CvA(SEQ ID NO9)和GUS1R对来自用pCvGUS转化的植物的叶提取物进行PCR以扩增约350bp片段从而证实与GFP报告基因融合的pCv启动子的存在。所有引物用Eurogentec(Seraing，Belgium)合成。来自未转化植株的提取物作用为负对照。所有分析的植物的PCR产生在DNA凝电泳中表现预期的条带大小，而负对照没有条带(资料未显示)。
随机选择用pMyGUS转化的25个转基因株系和用pCvGUS转化的30个植物株系并通过GUS染色对其进行筛选。GUS染色在相片的黑白拷贝中呈黑色区域。基于这些结果，选择15和20个单独株系进行更详细的GUS分析以测定器官和组织特异表达。结果总结如下。一般地，对两种构建体，发现两组香蕉植株具有相似组织特异性的“弱表达者”和“高表达者”。在强表达者中，在X-Gluc染色[100mM Tris-HCl，pH8.0；10mM EDTA，pH8.0；0.5mM K-铁氰化物；0.5mM K-亚铁氰化物；1％抗坏血酸，0.1％X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D葡糖苷酸)；0.2％SDS]20-30分钟时反应变得可见；而在弱表达者中，开始出现着色的时间延迟(2-3小时)，并且染色强度几乎不能达到高表达者的水平。用pMyGUS转化的15个株系中，约60％可认为是高表达者，而用pGvGUS转化的12个株系的30％表现强GUS染色。图12和图13表示分别用pMyGUS或pCvGUS转化的香蕉植株以及对照植物的不同X-gluc染色组织类型的横和纵截面(图13G、图13H和图13I)。两个构建体产生相似组织特异性。染色强度在芽(图12D和图13D)和顶端分生组织(图12F和图13E)中，并且尤其在根的维管组织(图12F和图13E)、根茎(图12E、图12F和图13E)以及叶柄和假茎(图12B、图12C、图13B和图13C)中最强。在叶上层部分的染色强度一般更弱(图12A和图13A)，并在一些情况下表现斑驳的染色模式，这种模式看来不是由染色过程中差异底物吸收导致。对两种启动子，可在香蕉植株中观察到组成型表达，一些株系也表现更不规则的染色模式，可能是由于基因沉默。事先按照Sagi等(1995，同上)的方法用pAHC27(含有pUbi、GUS报告基因和nos终止子的质粒；Christensen和Quail，同上)转化的对照植物表现相似的几乎组成型染色模式(资料未显示)。在X-Gluc染色溶液中放置24小时的未转化香蕉株的叶、假茎和芽分生组织没有表现GUS活性(分别为图13G、图13H和图13I)。这种浅褐色在相片的黑白拷贝中呈灰色。
使用上述测试系统(3)，对上述转基因甘蔗植株的叶提取物进行半定量Western印迹分析。此方法以转基因植物叶中产生的GFP的定量为基础，允许可靠的启动子分析。根据上述用荧光显微镜的分析，选择在叶中表现最强GFP合成的5个独立植物株系用于每个构建体pMyGFP，pCvGFP和pUbiGFP。通过在1.5ml含有50mM Hepes-KOH、10mMMgCl2、1mM EDTA、5mM DTT、1mM PMSF、1mM苯甲酰胺、1mM苯甲脒、5mM E-氨基癸酸、2μM亮抑蛋白酶肽、2μM抗蛋白酶、0.1％(v/v)Triton X-100、2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮，pH7.5和约0.1g酸洗沙的冰冷抽提缓冲液中研磨150mg叶，得到来自每个这15个株系的最新鲜叶的蛋白提取物。按照Grof等在甘蔗对有效和可维持的生产的研究(J.R.Wilson，D.M.Hogarth，J.A.Campbell和A.L.Garside编辑)124-126页；CSIRO热带作物和牧草部，Brisbane(1996)]中所述的方法进行Western印迹分析。含有针对GFP产生的两种小鼠单克隆抗体混合物的商业抗体制品可从Boehringer Mannheim(目录号1814 460)得到。图13表示使用用pMyGFP和pCvGFP(图14A)，pMyGFP和pUbiGFP(图14B)以及pCvGFP和pUbiGFP(图14C)转化五个独立植物株系的叶提取物进行的比较免疫印迹。每次免疫印迹的第一泳道和最后一个泳道分别含有以kDa表示的预染色全能大小标记(Biorad)和来自未转化植物的叶提取物。在某些情况下可检测到双条带。这是由于前体的部分断裂或不完全变性。图14中所示的所有条带的相对比较表明用pCvGFP转化的甘蔗植物强度最高，然后是用pUbiGFP转化的植物和用pMyGFP转化的植物。这些结果与上述用荧光显微镜得到的结果一致，证明pCv是适于在转基因甘蔗植株中强表达的启动子。尽管pMy产生更弱的表达，但是它在甘蔗植株中有活性。
使用上述测试系统(4)，按照修饰的Jefferson(植物分子生物学报告5387-405 )的方法，使用荧光GUS分析对转基因香蕉植株的不同器官中的GUS进行定量。简言之，在微量离心管中，用无菌洗过的沙在400μl GUS抽提缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液，pH7.0；10mMEDTA，pH8.0；10mM β-巯基乙醇；0.1％十二烷基肌氨酸钠；0.1％Triton X-100；2％聚乙烯吡咯烷酮，MW＝10,000)中研磨200-300mg植物组织，然后将其转移到冰中并于10,000rpm离心10分钟。将上清小心转移到干净离心管中。通过Bradford分析法(BioRad Laboratories)测定蛋白浓度。通过将50μl预保温(37℃)的蛋白提取物加入200μl预保温(37℃)的MUG分析缓冲液[含有20％(v/v)甲醇的GUS抽提缓冲液中的1mM 4-甲基伞形酰基-β-D-葡糖苷酸]中，对每个样品进行荧光GUS酶分析。于37℃温育120分钟后，将10μl系列稀释液(2-80倍)加入微量滴定板中的190μl 0.2M Na2CO3溶液中以终止反应。在Luminescence Spectrofluorometer(LS 50B，Perkin Elmer)上于365nm激发后在455nm测定光密度。未转化植物的蛋白提取物用作零样品，而GUS抽提缓冲液中10μM-60μM浓度的4-甲基伞形酮(MU，Sigma或Duchefa)溶液用作标准。图15总结了对用pMyGUS转化的三个株系(MY1，MY2和MY3)、用pCvGUS转化的2个株系(CV1和CV2)以及用pAHC27转化的两个株系(UBI，表示平均数)的叶和假茎/根茎提取物得到的结果(以nmol MU/小时和mg蛋白表示，用标准偏差误差柱从至少三个测量结果平均)。表达pMyGUS的植物在叶中产生比用pAHC27转化的对照植物高5-29倍的GUS活性，在假茎/根茎中产生相似的活性。表达pCvGUS的植物在叶子产生比用pAHC27转化的对照植物高4-5倍的GUS活性，在假茎/根茎中产生高相似的活性。未转化香蕉植株(NEG)不表现活性。
实施例4的结果表明在稳定条件下，SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中所示的序列在转基因植物中都有作为启动子的活性，结果进一步证明，在稳定条件下两个启动子也在转基因甘蔗和香蕉中以比玉米遍在蛋白启动子更高的比例强表达。结果证实SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的启动子给在植物表达基因和遗传工程提供有利工具。实施例5推测启动子元件的鉴定使用ANGIS软件包TFSEARCH[Heinemeyer等，核酸研究26，364-370(1998)]并通过与在其它caulimo-或badnavirus亚群植物病毒基因组启动子序列中得到鉴定的推测启动子元件[例如Chen等，病毒学杂志70，8411-8412(1996)；Verdaguer等，植物分子生物学31，1129-1139(1996)；Yin和Beachy，植物杂志7，969-980(1995)]比较来鉴定推测启动子元件。
图16、图17和图18表示分别在SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的DNA序列中鉴定的核心启动子区域中的推测启动子元件。这些元件包含由G/C富集区包围的TATA元件盒[TATA；Breathnach和Chambon，Ann.Rev.Biochem.50，349-383(1981)；Bucher，分子生物学杂志212563-578(1990)]、起始子[INI；转录起始位点；O’Shea-Greenfield和Smale，生物化学杂志267，1391-1402(1992)，Bucher(1990)，同上]，病毒C/EBP(CCAAT/增强子结合蛋白)位点[C/EBP；Graves等，细胞44，565-576(1986)；Bakker和Parker，核酸研究19，1213-1217(1991)，Grange等，核酸研究19，131-139(1991)]，GATA结合因子1[GATA-1；Merika和Orkin，分子细胞生物学133999-4010(1993)和活化转录因子(ATF；Rooney等，分子细胞生物学10，5138-5149(1990)]。
本领域技术人将理解在不背离本发明广泛限制和范围的情况下，可以对上述举例说明的启动子和含启动子的构建体进行许多变化。
序列表(1)基本信息(i)申请人(A)名称COOPERATIVE RESEARCH CENTRE FORTROPICAL PLANT PATHOLOGY(B)街道The University of Queensland(C)城市St Lucia(E)国家Australia(F)邮政编号(Zip)4067(i)申请人(A)名称Katholieke Universiteit Leuven(B)街道Naamestraat 22(C)城市Leuven(E)国家Belgium(F)邮政编号(Zip)B-3000(ii)发明名称植物和病毒启动子(iii)序列数10(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPO)(vi)在先申请资料(A)申请号AU PO7593(B)递交日1997年6月26日(2)关于SEQ ID NO1的信息(i)序列特征
(A)长度2106个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型cDNA(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物未命名badnavirus(B)单独分离物Mysore(xi)序列描述SEQ ID NO1CCCAGGAATA AACACGATTA TCAGTCGAAT TGGAAATGCC AAAGTTTATT CAAAATTCGA 60CTTAAAAAGT GGTTTCCATC AAGTAGCCAT GGATCCTGAA TCCATCCCAT GGACGGCTTT 120CCTGGCTAAC AATGAGCTCT ATGAGTGGCT TGTCATGCCC TTCGGTCTGA AGAATGCTCC 180AGCAATATTC CAACGAAAGA TGGACACCTG TTTTAAAGGT ACTGAAGCCT TCATTGCTGT 240TTATATAGAT GATATTTTAG TATTTTCTGA GACCGAACAA TTGCATAGAG ACCACTTAAG 300AAAATTCCTG GAAATCAGTA AGGCCAATGG GCTCATATTA AGCCCAACCA AGATGAAAAT 360AGGGGTCAAA ACTATTGACT TCCTAGGAGC CTCTATAGGA AACTCCAAGA TCAAGCTTCA 420GCCTCATATT ATCAAGAAAA TAGCTGACTT CGACGATCAT AGGCTGAAAG AAACAAAAGG 480TTTGAGGGCA TGGCTTGGGA TATTAAACTA TGCAAGAAAC TACATCCCAA ACTTAGGAAA 540AACTCTAGGC CCTCTTTACT CTAAGATATC ACCAAATGGG GAGAAAAGAA TGAACGCTCA 600GGATTGGGCA CTAGTCACTC AGGTTAAAAG ACAAGTCCAG AACCTACCAG AGCTGGAATT 660ACCCCCAGAA AAATGTAAAA TGGTGATAGA AACGGACGGC TGCATGGAAG GTTGGGGCGG 720CGTCTGTAAG TGGACTACTG TCGGCAAGGC ACAAGAAAAA GTATGCGCCT ATGCCAGTGG 780AAAGTTTACC CCCATCAAAA GCACTATTGA TGCGGAGGTA CAGGCTGTAA TTAACAGCCT 840TGATAAGTTC AAAATATACT ATTTGGACAA GAAGGAGTTA TTGATCAGAA CAGACTGTGA 900AGCTATAGTC AGGTTCTATA AAAGCACAGC TCAGAACAAA CCCTCCCGGG TTAGATGGCT 960CATGCTGACC GACTTCATCT CGGGTACGGG TCTAGAAATA AAATTTGAGC ATATTAATGG 1020CTGCGAGAAT ATATTGGCAG ACTCCCTCTC TAGACTAGTC CAAACACTGT TACAAGGATG 1080GCAGCATCAA CACCTAAATG GAATCCTACT GGCTCTAGAA GAATTGTATC AAAAGCCCAA 1140CCCAGAAGTT GCGAAGAAAA TCGGGCAGAT CATTATGAAA GTTCTGGAGA AGCCAGCTGG 1200AATACAGATA AATATGATCA CTGAAGGACC TAAACTTCGG TGCGCATGTG GAAAAGATGC 1260TGAGATAGCT GTCTCCCACA CTTCGAGAAA TCCTGACCGA CCCTTTTACA AATGCCAAAG 1320AAATCTGTGC CACATTTGGA TATGGAAAAA CTTAGTGGAT GACTACTTTC AAAACTTAAC 1380GGCGTGGAAC AGAATCTCTG AAGAACACAG AAGGGAAATG GCTCGTGAAG AAGGTCAGAA 1440TCTGGAAGAA GAAGACTACT GGGAGAATGT ATTCAATGAG GTTTTCGACC ACGAAGAAAT 1500CACGGAGTTC TACCCTGACG GAGGAGATCC CGGTTAGAAA CAAGGAAGCG TGAAGAGGAC 1560CCATTACAGC TGTGATCGCA CCCACAAGCT GTGTCAGAAA GAAAGGTATG GTGCAGGGCG 1620GCTAGCGCTC AATTATCTTG CTTTTCAGTT TTCAATTCTG TAAATGGCAG ACAGAGTGAG 1680GTGTCAAAGG ACGATGGGGC CCAATGAGTA CCCGCTTTGA CTACTTTACA ATCTGAAAGC 1740TATGCTTTTA TTTTGTTAAG CTGATCCTGA GCCTCGGGGA GCCGGATCTA GCATAGTAAA 1800ACCAGAGGCG CCCCTGGTAT TGGCGCTGCG GTTTTAAGCC CACGGTTTTC GGACTCCATG 1860AGTTTTGAAA TCCGACGGCT TTAGTCTGAG AAGGCTCAGC CTTTCTCTAT ATAAGGGTTT 1920GTAACCCCTC GTTGCAAGCA GAGTCGGAAA TACCAGACTG CTTACTTCGA GTTTTGAAAT 1980CCCAATAAGA ATCCTCAGTT TTCTTCATCC TTCTTTCGGT TCACTTCCTG AAATTGGGCA 2040AGCCCCATAG TAAGGAAAGA TCCATTTGGT GTAATTCCGC TTCACTCCTG GTATCAGAGC 2100CATGT 2105(2)关于SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度1325个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型cDNA(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源(A)生物未命名badnavirus(B)单独分离物Williams(xi)序列描述SEQ ID NO2ATAATAATAG AGACAGATGG TTGCATGGAA GGTTGGGGAG GAGTTTGTAA ATGGAAAGAA 60CAATCAGGAC AACCAAGATG GTCAGAGAAG ATTTGTGCTT ATGCGAGTGG AAAGTTTAAT 120CCGATCAAGA GCACAATTGA TGCAGAAATT CAAGCAGTCA TCAACAGCTT GGATAAATTC 180AAGATATATT ATCTTGATAA AAAGGAGTTG ATCATCAGGA CGGATAGTCA AGCGATAGTC 240AGTTTCTACA AGAAGAGTAG TGACCACAAA CCCTCAAGGG TAAGATGGTT AGCTTTCACT 300GACTATATCA CTGGAACAGG ATTGGATGTG AAGTTTGAGC ATATTGACGG CAAGGATAAT 360GTGCTAGCAG ACACTCTGTC AAGGCTAGTA AAAATCATAT GCCACAAGGA GAAACATCCA 420TCAGAAACAA TATTGATCAA CGTTGCAGAA GAAATACTTC AGAAAGGAAG TATTGGAGCA 480AAAAGAAAGT TGGGAGAAAT GATAAGTGGA TATGAAGCTT GGATGACAAG AATCCAAGAA 540CACAAAATCA AGACACTAAC ACTTATCGAA AAACCAGTTT TTAAATGTGG TTGCAGGAAA 600CCTGCTAGGC TTCACACGTC CAGGACATCA AGAAATCCGG GAAGAGAATT TTACTCATGT 660GAAAATAAAG CATGTTTCAC TTGGGTATGG AAGGATCAGA TTGATGAATA CGTTCAAGAA 720GTGATGACGT GGAACGACCA AGTAAGCCAG TTGCCAGAAG AACCAGAAGG CTACAATGAA 780GGATGCACGA TTGAAGACGC ATTCGATCTG CTAGACGTCA GCAATGACGA TCAATGGGCA 840AGGTCGTAAG CCATGACGTA GCGGAAGTGA TGGACCCCAT ACCACTGGAT GGCACTAACC 900AGTGTGACAA GGATACGAGA TGCCAAGTGA GCTGGATAGC ACTCACTTTA TGTAAAGAGT 960GGTCTGCGTA CCAACTCCAC TATAGTCTGT CTGAGGTGCG ATGCTGTGTC ACGCACAAAG 1020ACTTTAGATT CCTTTGCGTG AGATGTACGC AAAGCAGTGT GTCCAGAGTG TGCTGTGACG 1080CGTCCCTTGC ATTATTGGTG GGTGCACCTA ACGATGCGGG AAGCCGAACT CCCTCTATAA 1140ATAGGACCCC GTGTATTCAG TTGCAAGCAC GCAACACAAC GCGAGCTTAC TTCTGAGAAG 1200AAATAAGAAC AATTTGTGCT TGAAATACAC CTTGTGTCAA GAGTGTGAGT AGAGCGCAAG 1260ATCCGTGTTG GGAAATCCGT GCCGTTCTGG AAATCCGTGC CGTTCTGGTA TCAGAGCTTT 1320GT 1322(2)关于SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度1297个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型cDNA(iii)假设否(iii)反义否(vi)原始来源
(A)生物未命名badnavirus(B)单独分离物Goldfinger(xi)序列描述SEQ ID NO3ATAATCATTG AGACGGACGG ATGTATGGAT GGTTGGGGTG GCATTTGCAA ATGGAAGTTA 60AACAAAGGGG AACCCCGATC CGCTGAAAAG ATCTGTGCTT ATGCAAGTGG ACGTTTCAAC 120CCCATCAAAG GAGCTATTGA CGCTGAAATA CAGGCTGTTA TCTACAGTCT AGAAAAATTT 180AAGATTTACT ATCTCGACAA AAAGGAGCTT ATTTTAAGGA CTGACAGCAA GGCAATTGTC 240AGGTTCTACG AGAAATGTTC AGAACACAAA CCCTCTCGTG TCCGATGGAT GACTCTAACT 300GACTACATCT CGGGATGCGG AGTTAAGGTA TATTTTGAAC ACATTGATGG AAAAGATAAT 360ACACTTGCAG ACGAACTATC ACGACTTGTT CAAGCAATTC TCATCAACAA AGAAGAATCT 420CCTACAATAC TATCTCTAAT CAAAGCAACA ACGGAGGTAT TACAAAAGGA AAATCCTATT 480TCCAGGAGTA GATTAGCTCT ATGCATTTCC AGAGCACTGG GTAACAAATA TCAAGTCAAT 540TTCATAACTT GGGAACAACC CCAGCTGAAG TGTGCCTGTG GAGAAAATGC CGTACTCCTT 600ACTTCACATA CCAGCCGAAA TCCAGGACGG AGATTTTATA GATGCGGTAC CAACACTTGC 660CATGTATGGT ACTGGGCTGA TCTAATCGAA GATTATATTG CGCAACTTAG CAATCTTCAG 720AATCTTGACT CAGGACAAGC AGATGATGAA GGATGGGCCT ATCAAACAGA AGATCTGATC 780AACCCAGAAG ATCTGGCCAA CTCCGACATA GACGACCCTC CAGAAGACTC AGGACTATTC 840CACCGACATG ATGACTAAGG CGGACGTGGT GGACCCAGCA ATAATGAAGG AATCCAATTC 900CTTACTTCAC CGGGTTCATT ATTAAAGAGC CTTTACAGCT CATACCCTTA TTAATAATGT 960TAGTGCTTGT ACTATTGTGC TTTGCCAGCA CATACTGGCG TGTAAAGGCA TCTGGTTGTC 1020CCCAGAAGGC CTAAAGTTAG TGCGTTCCAA CGCACATCTG TGTGTAAAGG TATCTGGCTG 1080TTTCCAGACG CTACCTCCCT CTTTTCTCCT CCCGTCCATA TAAGGAGGCA GAACCTAAGT 1140GTTTCAGGCA TCGAGGGAAA TACCCATCTG CCTAATCCAC TTCCAGTGTT TTCCAAAGCA 1200GCTGAAGTTT TCAGTCTGTG AGTAGAAAGC AAGATCCTTG TAAGAATTTT TGAGAAGTTT 1260ATATTTGATT TCTCCCCATC TGGTATCAGA GCGATAT1297(2)关于SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度26个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“DNA引物”(iii)假设否(iii)反义否(xi)序列描述SEQ ID NO4CCCAGGAATA AACACGATTA TCAGTC 26(2)关于SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“间并DNA引物”(iii)假设否(iii)反义否(xi)序列描述SEQ ID NO5CACCCCCGGG MYMWNGCTCT GATACCA 27(2)关于SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝间并DNA引物”(iii)假设否(iii)反义否(xi)序列描述SEQ ID NO6AATAGCGGCC GCATHATHAT HGARACNGA29(2)关于SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“DNA引物”(iii)假设否(iii)反义否(xi)序列描述SEQ ID NO7AGAGGCGCCC CTGGTATTGG 20(2)关于SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“DNA引物”(iii)假设否(iii)反义否(xi)序列描述SEQ ID NO8AGATGGTGCG CTCCTGGACG 20(2)关于SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“DNA引物”(iii)假设否(iii)反义否(xi)序列描述SEQ ID NO9CCTAACGATG CGGGAAGCCG 20(2)关于SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“DNA引物”(iii)假设否(iii)反义否(xi)序列描述SEQ ID NO10CTTGTAACGC GCTTTCCCAC C2权利要求
1.在植物细胞中起作用的启动子，所述启动子包含(1)来自badnavirus、具有由SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3所定义的序列的分离DNA；(2)作为(1)的DNA的病毒同系物或植物基因组来源的变体的分离DNA；(3) (1)或(2)的分离DNA的启动子活性部分；(4)在严格条件下与(1)或(2)的DNA杂交的分离DNA；或者(5)(4)的分离DNA的启动子活性部分。
2.根据权利要求1所述的启动子，包括SEQ ID NO1的核苷酸1538-2105，SEQ ID NO2的核苷酸850-1322或SEQID NO3的核苷酸859-1297。
3.根据权利要求1所述的启动子，包括SEQ ID NO1的核苷酸1806-2105，SEQ ID NO2的核苷酸1032-1322或SEQID NO3的核苷酸988-1297。
4.一种DNA构建体，包含至少一个含有与编码序列可操作连接的至少一个根据权利要求1所述的启动子的基因。
5.根据权利要求4所述的DNA构建体，其中所述的至少一个启动子包括SEQ ID NO1的核苷酸1538-2105，SEQ IDNO2的核苷酸850-1322或SEQ ID NO3的核苷酸859-1297。
6.根据权利要求4所述的DNA构建体，其中所述的至少一个启动子包括SEQ ID NO1的核苷酸1806-2105，SEQ IDNO2的核苷酸1023-1322或SEQ ID NO3的核苷酸998-1297。
7.根据权利要求4所述的DNA构建体，其中所述的编码序列编码RNA或多肽。
8.一种DNA构建体，包含(1)含有与编码序列可操作连接的至少一个根据权利要求1所述的启动子的第一个基因；以及(2)含有与编码序列可操作连接的启动子的第二个基因，其中所述第二个基因编码序列的表达产物调节所述第一个基因编码序列的表达产物的活性。
9.根据权利要求8所述的DNA构建体，其中所述的第一个基因启动子包括SEQ ID NO1的核苷酸1538-2105，SEQ IDNO2的核苷酸850-1322或SEQ ID NO3的核苷酸859-1297。
10.根据权利要求8所述的DNA构建体，其中所述的第一个基因启动子包括SEQ ID NO1的核苷酸1806-2105，SEQ IDNO2的核苷酸1023-1322或SEQ ID NO3的核苷酸998-1297。
11.根据权利要求8所述的DNA构建体，其中所述的第一个基因编码RNA或多肽。
12.在植物细胞中表达产物的方法，所述方法包括将根据权利要求4所述的DNA构建体或所述构建体的RNA转录物导入植物细胞，其中DNA构建体或RNA转录物编码序列编码所述产物。
13.一种植物细胞，其中所述植物细胞的基因组包含根据权利要求4或权利要求8所述的DNA构建体。
14.根据权利要求13所述的植物细胞，其中所述植物是单子叶植物、双子叶植物、被子植物或蕨类植物。
15.根据权利要求14所述的植物细胞，其中所述单子叶植物是选自甘蔗、香蕉、烟草、小米或高粱的物种。
16.根据权利要求14所述的植物细胞，其中所述双子叶植物是选自烟草、canola、Tipu树或Nicotiana benthamiana的物种。
17.根据权利要求14所述的植物细胞，其中所述被子植物物种是辐射松。
18.一种植物、植物组织或植物繁殖材料，其中所述植物、植物组织或植物繁殖材料包含根据权利要求13所述的细胞。
全文摘要
本发明提供可用于赋予转基因植物高水平基因表达的植物和病毒启动子。代表性启动子可以从来自栽培品种Mysore、Williams和Goldfinger的侵染澳大利亚香蕉的badnavirus分离。本发明进一步提供在植物细胞中表达基因产物的方法、在其基因组内带有DNA构建体的植物细胞和含有转基因细胞的植物。
文档编号C12R1/94GK1261402SQ98806572
公开日2000年7月26日 申请日期1998年6月26日 优先权日1997年6月26日
发明者P·M·P·申克, L·萨基, S·雷米, R·L·斯温南, R·G·戴茨根, A·D·W·吉苓, L·A·麦克米歇尔, J·E·托马斯, C·P·L·格罗弗, A·R·艾略特 申请人:联邦科学和工业研究组织, 初级产业部代表的昆士兰州, 昆士兰大学, 糖实验基地局, 昆士兰技术大学, 勒芬天主教大学