专利名称：包含果胶甲酯酶和两种底物的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种组合物。具体而言，本发明涉及一种用作食料或在食料制备中使用的组合物。更具体的说，本发明涉及一种用作食料或在食料制备中使用的组合物，所述组合物包含果胶或果胶衍生物，或由果胶或果胶衍生物制备。
在现代工业中果胶是一种重要的物品。例如它可以在诸如果酱制备的食料工业中用作增稠剂或胶凝剂。
果胶是一种一般在植物细胞壁中以原果胶形式发现的结构多糖。果胶主链包括α-1-4链接的半乳糖醛酸残基，这些残基由少数1，2链接的α-L-鼠李糖单元间隔。另外，果胶包括多个具有几乎交替的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖链的高度分支区域。这些高分支区域也包含其它糖单元(诸如D-半乳糖、L-阿拉伯糖和木糖)，它们通过糖苷键连接于鼠李糖单元的C3或C4原子上，或者连接于半乳糖醛酸单元的C2或C3原子上。α-1-4链接的半乳糖醛酸残基的长链一般称为“平滑”区，而所述高度分支区一般称为“毛状区”。
酯化半乳糖醛酸残基的一些羧基(例如甲基化羧基基团)。典型的羧基酯化在半乳糖醛酸残基聚合之后发生。然而，将所有的羧基酯化(例如甲基化)是非常罕有的。通常，酯化度在0-90％之间变化。如果50％或更多的羧基酯化，那么生成的果胶称为“高酯果胶”(简称为“HE果胶”)或“高甲氧基果胶”。如果少于50％的羧基酯化，那么生成的果胶称为“低酯果胶”(简称为“LE果胶”)或“低甲氧基果胶”。如果50％的羧基酯化，那么生成的果胶称为“中酯果胶”(简称为“ME果胶”)或“中甲氧基果胶”。如果果胶不包含任何酯化的基团或仅包含少数酯化的基团，通常称其为果胶酸。
果胶结构，特别是酯化(例如甲基化)度，决定了果胶的许多所得的物理和/或化学性质。例如果胶胶凝取决于果胶的化学性质，尤其是酯化度。然而，除此之外，果胶胶凝也取决于可溶性固体的含量、pH值和钙离子浓度。关于后者，相信钙离子与游离羧基、具体的说是那些在LE果胶上的游离羧基形成络合物。
按照果胶酶攻击果胶分子的半乳糖醛酸聚糖部分的方式对其分类。Pilnik和Voragen(Food Enzymology，编辑P.F.Fox；Elsevier；(1991)；第303-337页)撰写了一些果胶酶的综述。具体而言，果胶甲酯酶(EC 3.1.1.11)，或者称为PME，使HE果胶脱酯为LE果胶或果胶酸。相反，作为实例，果胶解聚酶分裂在半乳糖醛酸基(galacturonosyl)甲酯残基之间的糖苷键。
更具体而言，PME活性产生游离羧基和游离甲醇。利用自动滴定可以很容易监测游离羧基的增加。在这方面，较早的研究显示一些PME以随机方式使果胶脱酯，在此情况下它们将在一个或一个以上的果胶链上的任何酯化(例如甲基化)的半乳糖醛酸残基脱酯。将果胶随机脱酯的PME的实例可以由诸如棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(参见WO94/25575)和日本曲霉(Aspergillus japonicus)(Ishii等1980 J Food Sci 44第611-14页)的真菌来源获得。Baron等(1980 Lebensm.Wiss.M-Technol13第330-333页)显然分离出了来自黑曲霉(Aspergillus niger)的真菌PME。据报导这种真菌PME的分子量为39000道尔顿，等电点为3.9，最适pH值为4.5，Km值(mg/ml)为3。
相反，已知一些PME以一种区段式方式将果胶脱酯，在此情况下相信它们或者在非还原末端，或者紧靠游离羧基之处攻击果胶，然后通过单链机制沿果胶分子继续攻击，从而产生非酯化的半乳糖醛酸单元(它们可以是钙敏感性的)区段。这种将果胶区段式酶促脱酯的酶的实例是植物PME。已经提出在柑桔中存在最多12种PME的同种型(Pilnik W.和Voragen A.G.J.(Food Enzymology(编辑P.F.Fox)；Elsevier；(1991)；第303-337页)。这些同种型有不同的性质。
可以通过高效离子交换层析辨别游离羧基的随机或区段式的分布状态(Schols等Food Hydrocolloids 1989 6第115-121页)。这些实验经常用来在巴氏消毒后检查柑桔汁中不希望的、残余的PME活性，因为残余PME除了在柑桔汁中产生甲醇外，还可以在橙汁中引起通常所说的“混浊损失(cloud loss)”。
诸如由天然植物源获得的果胶的PME底物，一般是DE大约为70％的高酯果胶形式。必须向包含这些高酯PME底物的提取物中加入糖，以提供足够的可溶性固体来引发胶凝。通常需要最少55％的可溶性固体。当可溶性固体百分比少于55％时，凝缩倾向于更经常发生。当确实发生凝缩时，必须使用昂贵的添加剂引发胶凝。
Versteeg等(J Food Sci 45(1980)第969-971页)显然分离了一种来自橙的PME。据报导此植物PME在多种不同性质的同种型中存在。同种型I的分子量为36000道尔顿，等电点10.0，最适pH值7.6，Km值(mg/ml)为0.083。同种型II的分子量为36200道尔顿，等电点11.0，最适pH值8.8，Km值(mg/ml)为0.0046。同种型III(HMW-PE)的分子量为54000道尔顿，等电点10.2，最适pH值8，Km值(mg/ml)为0.041。然而，至今关于这些PME的序列资料仍很有限。
根据Pilnik和Voragen(出处同上)，可以在许多其它高等植物中发现PME，诸如苹果、杏、鳄梨、香蕉、浆果、酸橙、葡萄柚、橘子、樱桃、醋栗、葡萄、芒果、番木瓜、西番莲果、桃、梨、李子、豆、胡萝卜、花椰菜、黄瓜、韭、洋葱、豌豆、马铃薯、萝卜和西红柿。然而，至今关于这些PME的序列资料同样很有限。
在WO-A-97/03574中报导了一种植物PME(其内容通过引用结合到本文中)。此PME有如下特征分子量为大约36 kD至大约64 kD；当在0.15 M NaCl中用0.5％酸橙果胶检测时，最适pH值为7-8；最适温度为至少50℃；温度稳定性范围由10℃至最少40℃；Km值为0.07％；活性最大在大约0.25 M NaCl水平；活性最大在大约0.2 M Na2SO4水平；活性最大在大约0.3 M NaNO3水平。
在WO 97/31102中报导了另一种PME(其内容通过引用结合到本文中)。
PME在工业上有重要的应用。例如，它们可以用于或用作钙离子螯合剂。在这方面，根据Pilnik和Voragen所述(出处同上)，可以在提取汁之后，通过向柑桔皮加入氢氧化钙浆液制备家畜饲料。在加入氢氧化钙之后，用高pH值和钙离子激活任何在柑桔皮中的天然PME，引起果胶快速脱酯，并发生果胶酸钙凝结。释放束缚液相，并将其轻易压出，以便仅一部分原始含水量需要通过昂贵的热干燥去除。然后使用压出液作为动物饲料。
如上所述，由棘孢曲霉得到一种PME(WO 94/25575)。显然此PME可用于提高包含果胶底物的坚固度，或将果胶脱甲基，或提高含果胶底物的粘性。
在由含果胶的水果或蔬菜原料制备的食料(诸如果酱或防腐剂)的制备中，也开始普遍使用PME。例如WO-A-94/25575进一步报导了使用得自棘孢曲霉的PME制备橙皮马末兰果酱和番茄酱。
JP-A-63/209553公开了在多价金属离予存在的情况下，通过果胶甲酯酶作用于果胶多糖得到的凝胶以及其生产方法，所述果胶多糖包含作为主要成分的高甲氧基聚α-1，4-D-半乳糖醛酸酐(galacturonide)链。
Pilnik和Voragen(出处同上)列出了内源PME的用途，包括如果果汁包含太多源自水果的果胶，则将该内源PME加入到果汁中降低果汁的粘性；将该内源PME作为果胶酶溶液加入到在柑桔类水果中的白色气体泡沫上，为了有利于从完整果汁部分中去除果皮和其它膜，将水果加热至果核温度为20℃至40℃(US-A-4284651)；以及用于保护和提高几种加工的水果和蔬菜的组织和坚固定，所述加工水果和蔬菜诸如苹果(Wiley和Lee 1970 Food Technol 24 1168-70)、罐装西红柿(Hsu等1965 J Food Sci 30第583-588页)和罐装马铃薯(Bartolome和Hoff1972 J Agric Food Chem 20第262-266页)。
Glahn和Rolin(1994 Food Ingredients Europe，Conf Proceedings第252-256页)报导了用于和酸奶饮料相互作用的工业“GENU果胶类型YM-100”的设想的应用。根本没有关于GENU果胶类型YM-100如何制备的细节。
EP-A-0664300公开了制备钙敏感性果胶的化学分级分离法。该钙敏感性果胶据说有益于食料工业。
因此，果胶和脱酯果胶，还有PME，具有工业价值。
现在我们发现，在例如食料的制备中使用PME得到的利益在某种程度上取决于使用的PME的质和量和类型，以及可能存在于用来制备食料的材料中的PME底物(具体的说是果胶)的质和量和类型。例如，如果所述底物是水果材料或蔬菜材料，那么在该物质中的天然果胶的量和/或结构将由于水果材料或蔬菜材料的类型不同而不同。这也通过在WO-A-94/25575中提供的数据、尤其是图7得到了证明，其中可清楚地看到其PME系统是不理想的。
按照本发明我们现在发现，加入另外的PME底物使人们能够从在制备例如食料时使用PME中获得甚至更多的利益。
在这方面，加入另外的PME底物将克服任何与PME底物的量和质不同有关的问题，所述PME底物可以在用于制备例如食料的材料中发现。
按照本发明的第一方面，提供一种包括果胶甲酯酶(“PME”)、第一PME底物和第二PME底物的组合物；其中不论是所述第一PME底物，还是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一种底物产生。
按照本发明的第二方面，提供一种制备组合物的方法，它包括形成一种PME、第一PME底物和第二PME底物的混合物；其中不论是所述第一PME底物，还是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一种底物产生。
按照本发明的第三方面，提供一种包括向第一PME底物中加入PME和第二PME底物的方法；其中不论是所述第一PME底物，还是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一种底物产生。
按照本发明的第四方面，提供一种包括本发明其它方面或由本发明其它方面制备或通过本发明其它方面制备的食料。
按照本发明的第五方面，也提供一种由果胶甲酯酶(“PME”)、第一PME底物和第二PME底物制成的组合物；其中不论是所述第一PME底物，还是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一种底物产生。
按照本发明的第六方面，提供一种赋予包含第一PME底物的反应介质稳定性的方法，所述方法包括至少加入PME和第二PME底物；其中不论是所述第一PME底物，还是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一种底物产生。
因此，在广泛意义上来说，本发明提供一种包括PME、第一PME底物和第二PME底物的组合物；其中不论是所述第一PME底物，还是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一种底物产生。
就本发明而言，不论是所述第一PME底物，还是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一种底物产生。所述术语“不论是所述第一PME底物，还是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一种底物产生”是指所述第一PME底物不是在原位由所述第二PME底物产生和/或所述第二PME底物不是在原位由所述第一PME底物产生。所以，就本发明来说，所述第一PME底物不是在原位由所述第二PME底物产生，反之亦然。因此，例如，本发明的组合物不仅仅包括大量第一PME底物，其中一部分该PME底物已由PME酶部分改性。相反，也一定存在第二PME底物，其中该第二PME底物不是在原位由所述第一PME底物产生。
就本发明的组合物来说，可以存在另外的、不同的PME底物。
在本发明的组合物中或用于本发明的组合物的PME底物可以由不同的来源获得和/或可以具有不同的化学组成。
同样，就本发明的组合物来说，可以存在另外的、不同的PME酶。
如果有超过一种PME存在，那么所述PME酶可以由不同的来源获得和/或可以具有不同的组成和/或可以有不同的反应性分布型(例如不同的最适pH值和/或不同的最适温度)。
就本发明来说，所述PME酶可以以随机方式或以区段式方式使PME底物脱酯。如果有超过一种的PME，则每种PME独立选自可以以随机方式使PME底物脱酯的PME或可以以区段式方式使PME底物脱酯的PME。
在一个优选实施方案中，所述(或至少一种)PME酶以区段式方式使PME底物脱酯。
如果有超过一种的PME，则每种PME独立选自对钠离子敏感(Na-敏感)的PME酶、或对钠离子不敏感(Na-不敏感)的PME酶。在一个优选的实施方案中，所述(或至少一种)PME酶是Na-敏感的PME酶。
所述PME可以得自天然源，乃至从天然源获得或可以化学合成。
例如，所述PME可以由真菌获得，作为实例诸如真菌来源的PME(即得自真菌的PME)。
另一方面，所述PME可以由细菌获得，作为实例如细菌来源的PME(即得自细菌的PME)。
另一方面，所述PME可以由植物获得，作为实例诸如植物来源的PME(即得自植物的PME)。
在一个优选实施方案中，所述PME使用重组DNA技术制备。
例如，所述PME可以是如在WO-A-97/03574中公开的重组PME，或是在或者WO-A-94/25575或者WO-A-97/31102中公开的PME，以及在那些专利申请中公开的序列的变异体、衍生物或同系物。
在一个优选实施方案中，所述PME是WO-A-97/03574(其内容通过引用结合到本文中)中的重组PME，诸如SEQ.I.D.No.1或SEQ.I.D.No.2(它们分别由SEQ.I.D.No.3和SEQ.I.D.No.4提出的核苷酸序列编码)的PME或其变异体、衍生物或同系物；和/或WO-A-94/25575(其内容通过引用结合到本文中)的PME或其变异体、衍生物或同系物。
与本发明所述重组酶有关的术语“变异体”、“同系物”或“片段”包括对所述序列的一个(或多个)氨基酸的任何置换、变异、修饰、替代、缺失或添加，只要所生成的氨基酸序列具有PME活性，优选其活性与包括SEQ I.D.No.s 1和2所示序列的任何一个或多个序列的重组酶至少相同。具体来说，只要所生成的重组酶具有PME活性，那么术语“同系物”包括与结构和/或功能有关的同源性。对于序列同源性(即相似性)来说，优选是同所附序列表所示的序列至少75％同源，更优选是至少85％同源，更优选是至少90％同源。更优选是同所附序列表所示的序列至少95％同源，更优选是至少98％同源。
与编码本发明所述重组酶的核苷酸序列有关的术语“变异体”、“同系物”或“片段”包括对所述序列的一个(或多个)氨基酸的任何置换、变异、修饰、替代、缺失或添加，只要所生成的核苷酸序列编码具有PME活性的重组酶，优选编码其活性与包括SEQ I.D.No.1和2所示序列的任何一个或多个序列的重组酶的活性至少相同的重组酶。具体来说，只要所生成的核苷酸序列编码具有PME活性的重组酶，那么术语“同系物”包括与结构和/或功能有关的同源性。对于序列同源性(即相似性)来说，优选是至少75％同源，更优选是至少85％同源，更优选是至少90％同源。更优选是至少95％同源，更优选是至少98％同源。
上述术语和所述序列的等位变异同义。
在一个优选的实施方案中，至少一种所述PME底物是果胶或是可得自果胶的底物或是由果胶衍生的底物(例如果胶衍生物)。
术语“由果胶衍生”包括衍生的果胶、降解(诸如部分降解)的果胶和改性的果胶。改性的果胶的实例是用诸如PME的酶预先处理的果胶。果胶衍生物的实例是经过化学处理(例如酰胺化)的果胶。
最好是，每种所述第一PME底物和所述第二PME底物都独立选自果胶、可得自果胶的底物或由果胶衍生的底物。
在一个优选实施方案中，每个所述第一PME底物和所述第二PME底物都是果胶。
在另一个优选实施方案中，或者所述第一PME底物，或者所述第二PME底物是改性的果胶，特别是酶改性的果胶，优选是PME处理的果胶。
在一个优选的实施方案中，所述第二PME底物是这样一种改性的果胶。
在另一个优选的实施方案中，每种所述第一PME底物和所述第二PME底物都是这样一种改性的果胶。
所述第一PME底物最好是存在于(即在原位)植物或植物材料中。所述植物可以是转基因植物，诸如经过基因工程改造以产生不同水平和/或类型的果胶的植物。另外，所述植物材料可以由转基因植物获得，诸如经过基因工程改造以产生不同水平和/或类型的果胶的植物。
所述植物或植物材料可以是蔬菜、水果或其它类型的包含或产生果胶的植物，或者可以得自它们。
所述植物料最好是蔬菜材料和/或水果材料。
所述蔬菜材料和/或水果材料最好是浆(mash)。
所述第一PME底物和/或所述第二PME底物可以是低酯果胶、中酯果胶或高酯果胶的任何一种或多种。
所述第二PME底物最好是低酯果胶、中酯果胶或高酯果胶。可以在WO-A-97/03574第58页(其内容通过引用结合到本文中)中找到检测所述PME底物酯化度的方法。为了便于参考，在实施例部分(下文)陈述了此方法。
在一个优选的实施方案中，所述第二PME底物是高酯果胶。
对于本发明来说，所述第一PME底物和所述第二PME底物独立选自对钙离子敏感(Ca-敏感)的PME底物或对钙离子不敏感(Ca-不敏感)的PME底物。可以在WO-A-97/03574第57页(其内容通过引用结合到本文中)中找到检测钙离子敏感性的方法。为了便于参考，在实施例部分(下文)陈述了此方法。
在一个优选的实施方案中，所述第二PME底物是钙敏感性的。
最好是将所述第二PME底物加入到所述第一PME底物中。在此，术语“加入到”就物理意义上讲包括将所述第二PME底物加入到所述第一PME底物中，反之亦然。
可以在加入所述第二PME底物的同时，或在加入所述第二PME底物之前，或在加入所述第二PME底物之后，加入PME。
因此，本发明至少包括以下可能性在加入所述第二PME底物的同时向所述第一PME底物中加入PME；在加入所述第一PME底物的同时向所述第二PME底物中加入PME；在加入所述第一PME底物的同时向PME中加入所述第二PME底物；同时向反应容器中加入PME和所述第一PME底物和所述第二PME底物；在加入到所述第二PME底物之前温育所述第一PME底物和PME；在加入到所述第一PME底物之前温育所述第二PME底物和PME；在加入到所述第二PME底物之前温育所述第一PME底物和PME，然后加入更多的PME(它可以和另一种PME相同或不同)；在加入到所述第一PME底物之前温育所述第二PME底物和PME，然后加入更多的PME(它可以和另一种PME相同或不同)；在加入到所述第二PME底物之前温育所述第一PME底物和PME，然后加入另外一种PME底物(它可以和所述其它的PME底物相同或不同)；在加入到所述第一PME底物之前温育所述第二PME底物和PME，然后加入另外一种PME底物(它可以和所述其它的PME底物相同或不同)；向与PME(它可以和另一种PME相同或不同)温育的所述第二PME底物中加入与PME温育的所述第一PME底物；向与PME(它可以和另一种PME相同或不同)温育后的所述第二PME底物(任选地其中所述反应已经终止-诸如通过使用加热)中加入与PME温育后的所述第一PME底物(其中所述反应可以选择性的终止-诸如通过使用加热)；以及其任何组合。
在一些实施方案中，本发明优选是包括以下任何一种或多种在加入所述第二PME底物的同时向所述第一PME底物中加入PME；在加入所述第一PME底物的同时向所述第二PME底物中加入PME；在加入所述第一PME底物的同时向PME中加入所述第二PME底物；同时向反应容器中加入PME和所述第一PME底物和所述第二PME底物；在加入到所述第二PME底物之前温育所述第一PME底物和PME；在加入到所述第一PME底物之前温育所述第二PME底物和PME；在加入到所述第二PME底物之前温育所述第一PME底物和PME，然后加入更多的PME(它可以和另一种PME相同或不同)；在加入到所述第一PME底物之前温肓所述第二PME底物和PME，然后加入更多的PME(它可以和另一种PME相同或不同)；在加入到所述第二PME底物之前温育所述第一PME底物和PME，然后加入另外一种PME底物(它可以和所述其它的PME底物相同或不同)；在加入到所述第一PME底物之前温育所述第二PME底物和PME，然后加入另外一种PME底物(它可以和所述其它的PME底物相同或不同)；向与PME(它可以和另一种PME相同或不同)温育的所述第二PME底物中加入与PME温育的所述第一PME底物。
因此，在一个实施方案中，可能制备高酯的、PME预处理的第二PME底物，然后可以将其加入到第一PME底物中。在此情况下，使用不同的PME(诸如但不限于重组、植物、真菌和细菌PME)以将所述第二PME底物改性，以便提供在组合系统中具有不同功能性的PME底物，应该是可能的。
换句话说，本发明的这个实施方案提供一种包括一种PME、第一PME底物和第二PME底物的组合物；其中不论是所述第一PME底物，还是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一种底物产生；并且其中至少所述第二PME底物已由PME预处理。
在另一个实施方案中，向高酯的、PME预处理的第一PME底物中加入PME底物是可能的。在此情况下，使用不同的PME(诸如但不限于重组、植物、真菌和细菌PME)以将所述第二PME底物改性，以便提供在组合系统中具有不同功能性的PME底物，应该是可能的。
在另一个实施方案中，制备高酯的、PME预处理的第二PME底物，然后可以将其加入到高酯的、PME预处理的第一PME底物中是可能的。在此情况下，使用不同的PME(诸如但不限于重组、植物、真菌和细菌PME)以将所述第二PME底物改性，以便提供在组合系统中具有不同功能性的PME底物，应该是可能的。
所述组合物可以包括一种或多种其它组分，诸如一种或多种合适的食物成分。典型的食物成分包括酸(诸如柠檬酸)或糖(诸如蔗糖、葡萄糖或转化糖)或水果或其它酶、防腐剂、染色剂和其它合适的组分中的任何一种或多种。
本发明的组合物可以用于制备食料。例如，它可以是食料制备中的起始剂或中间体。
另一方面，本发明的组合物可以是食料本身。
术语“食料”可以包括用于人和/或动物消耗的食物。典型的食料包括果酱、柑橘酱(marmalade)、果子冻、乳制品(诸如牛奶或干酪)、肉制品、禽制品、鱼制品和焙烤食品。所述食料甚至可以是饮料。所述饮料可以是保加利亚奶酒饮品、果汁或包含乳清蛋白的饮料。
所述(或每种类型的任何一种或多种)PME可以和其它类型的酶一起使用。
其它类型的酶的实例包括其它果胶酶、果胶解聚酶、聚半乳糖醛酸酶、果胶酸裂合酶、果胶裂合酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶、半乳聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、内-β-葡聚糖酶、阿拉伯酶、乙酰酯酶或果胶释放酶或其组合。
这些其它类型的酶可以与所述PME同一时间加入，或在加入所述PME之前或之后加入。
在一个优选的实施方案中，所述PME可以和一种或多种聚半乳糖醛酸酶一起使用，诸如内-聚-半乳糖醛酸酶(诸如WO-A-89/12648中的内-聚-半乳糖醛酸酶，其内容通过引用结合到本文中)和/或外-聚-半乳糖醛酸酶(诸如WO-A-94/14966中的外-聚-半乳糖醛酸酶，其内容通过引用结合到本文中)。此优选实施方案对果酱和柑橘酱生产有益，因为所得处理的PME底物可以达到对钙敏感性的更多控制。如上所指出，WO-A-97/03574的论述就如何通过使用重组DNA技术制备用于本发明的合适的PME提供了有用的指导。在下文列举了这些论述中的一些。
为了表达重组PME，宿主生物可以是原核或真核生物。合适的原核宿主的实例包括大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。在本领域中关于转化原核宿主的论述有许多文件记载，例如查看Sambrook等(Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，1989，冷泉港实验室出版社)。如果使用原核宿主，那么可能需要在转化之前，诸如通过除去内含子，对所述基因进行合适的修饰。
在一个实施方案中，所述宿主生物可以是曲霉属，诸如黑曲霉。可以按照下述的论述制备转基因曲霉Rambosek，J.和Leach，J.1987(在丝状真菌中的重组DNA进展和前景，CRC Crit.Rev Biotechnol.6357-393)，Davis R.W.1994(在曲霉属中的异源基因表达和蛋白质分泌，载于Martinelli S.D.，Kinghorn J.R.(编辑)Aspergillus50 years on.Progress in industrial microbiology第29卷，Elsevier Amsterdam 1994第525-560页)，Balance，D.J.1991(用于丝状真菌的转化系统和真菌基因结构的概述，在Leong，S.A.，Berka R.M.(编辑)Molecular IndustrialMycology.Systems and Applications for Filamentous Fungi.MarcelDekker Inc.纽约1991，第1-29页)和Turner G.1994(用于遗传操作的载体，载于Martinelli S.D.，Kinghorn J.R.(编辑)Aspergillus50 years on.Progress in industrial microbiology第29卷，Elsevier阿姆斯特丹1994第641-666页)。然而，下列评论提供了用于产生转基因曲霉属的那些论述的摘要。
几乎一个世纪以来，丝状真菌广泛用于许多类型的生产有机化合物和酶的工业中。
例如，传统日本酒曲和大豆发酵使用曲霉菌。此外，在本世纪黑曲霉用于生产有机酸(特别是柠檬酸)和用于生产在工业中使用的各种各样的酶。
丝状真菌在工业中为何如此广泛的使用有两个主要原因。首先，丝状真菌可以产生大量的细胞外产物，例如酶和有机化合物，诸如抗生素或有机酸。其次，丝状真菌可以在诸如谷物、糠、甜菜粕等的低成本物质上生长。同样的原因使丝状真菌成为作为用于异源表达重组PME的宿主的有吸引力的生物。
为了制备转基因曲霉，通过将必需核苷酸序列插入到为在丝状真菌中表达而设计的构成物中，而制备表达构成物。
已经研制了几种类型的用于异源表达的构成物。这些构成物可以包含一种在真菌中有效的启动子。启动子的实例包括用于高度表达细胞外酶的真菌启动子，诸如葡糖淀粉酶启动子或α-淀粉酶启动子。所述核苷酸序列可以融合于信号序列，所述信号序列指导由所述核苷酸序列编码的蛋白的分泌。通常使用来自真菌的信号序列。在真菌中的活性终止子终止所述表达系统。
开发了在真菌中另一种类型的表达系统，在该系统中所述核苷酸序列可以同较小或较大部分的编码稳定蛋白的真菌基因融合。这可以稳定由所述核苷酸序列编码的蛋白。在这个系统中，可以在真菌蛋白和由所述核苷酸序列编码的蛋白之间引入特定蛋白酶识别的切割位点，所以可以在这个位置由所述特定蛋白酶切割产生的融合蛋白，因此释放出由所述核苷酸序列编码的蛋白。作为实例，可以引入由在至少一些曲霉菌中发现的KEX-2样肽酶识别的位点。这样的融合导致在体内切割，引起对表达产物的保护，而不是保护较大的融合蛋白。
已经报导了几种编码细菌、真菌、脊椎动物和植物蛋白的基因在曲霉中的异源表达。如果所述核苷酸序列没有融合于信号序列，那么可以在细胞内沉积所述蛋白。这类蛋白将在细胞质中累积，并通常没有糖基化，这对一些细菌蛋白可能有利。如果所述核苷酸序列带有信号序列，则所述蛋白将在细胞外累积。
关于产物稳定性和宿主菌株的修饰，当一些异源蛋白分泌到真菌培养液中时，它们不是很稳定。大多数真菌产生几种降解异源蛋白的细胞外蛋白酶。为避免这个问题，用蛋白酶产生减少的特定真菌菌株作为用于异源生产的宿主。
为转化丝状真菌，开发了几种用于许多丝状真菌的转化方案(Ballance 1991，出处同上)。它们中许多是基于原生质体制备和使用PEG和Ca2+离子将DNA引入到所述原生质体中。然后再生所述转化的原生质体，并用不同的选择标记选择转化的真菌。其中用于转化的标记是许多诸如argB、trpC、niaD和pyrG的营养缺陷型的标记；诸如苯菌灵抗性、潮霉素抗性和腐草霉素抗性的抗生素抗性标记。常用的转化标记是高拷贝数的、允许真菌以丙烯酰胺作为唯一氮源生长的构巢曲霉(A.nidulans)的amdS基因。
在另一个实施方案中，所述转基因生物可以是酵母。在此情况下，酵母也已广泛用作异源基因表达的载体。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)有很长的工业应用史，包括用于异源基因表达。Goodey等(1987，Yeast Biotechnology，D R Berry等编辑，第401-429页，Allen和Unwin，伦敦)和King等(1989，Molecular and Cell Biology of Yeasts，E F Walton和G T Yarronton编辑，第107-133页，Blackie，格拉斯哥)综述了在酿酒酵母中的异源基因表达。
酿酒酵母很适合异源基因表达有几个原因。首先，它对人是非致病性的，并且不能产生某些内毒素。其次，伴随着几个世纪的用于不同目的的商业开发，它具有很长的安全使用史。这造成了公众的广泛接受。第三，致力于对生物的广泛商业应用和研究产生了大量关于酿酒酵母的遗传学和生理学以及大规模发酵特性的知识。
E Hinchcliffe E Kenny(1993，“酵母作为异源基因表达的载体”，Yeast，第5卷，Anthony H Rose和J Stuart Harrison编辑，第2版，AcademicPress Ltd.)给出了对在酿酒酵母中异源基因表达和基因产物分泌的原理的综述。
可得到几种类型的酵母载体，包括整合型载体和自主复制型质粒载体，所述整合型载体需要和用于维持它们的宿主基因组重组。
为了制备转基因酵母菌，通过将所述核苷酸序列插入到为在酵母中表达而设计的构成物中制备表达构成物。已经研制了几种类型的用于异源表达的构成物。所述构成物包括与所述核苷酸序列融合的、在酵母中有效的启动子，通常使用来自酵母的启动子，诸如GAL1启动子。通常使用来自酵母的信号序列，诸如编码SUC2信号肽的序列。一种在酵母中有效的终止子终止所述表达系统。
为了转化酵母，已开发了几种转化方案。例如，可以按照Hinnen等(1978，Proceeding of the National Academy of Sciences of the USA75，1929)；Beggs，J D(1978，Nature，伦敦，275，104)和Ito，H等(1983，J Bacteriology 153，163-168)的论述制备转基因酵母菌。
使用不同的选择标记选择转化的酵母细胞。其中用于转化的标记是许多诸如LEU2、HIS4和TRP1的营养缺陷型标记和诸如氨基糖苷抗生素标记(例如G418)的显性抗生素抗性标记。
另一种宿主生物是植物。在这方面，本领域关于制备转基因植物的文献很充分。有两个文献提供了一些关于可以使用其制备转基因植物的技术类型的背景评述，这两个文献是EP-B-0470145和CA-A-2006454，下文列出了其中的一些评述。
构建基因修饰植物的基本原理是在所述植物的基因组中插入遗传信息，以便获得对所插入的遗传物质的稳定维持。
存在几种插入遗传信息的技术，两个主要原则是通过使用载体系统直接引入遗传信息和间接引入遗传信息。可以在Potrykus(Annu RevPlant Physiol Plant Mol Biol42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech三月/四月1994 17-27)的论文中发现对一般技术的综述。
用于植物的合适的转化系统可以包含一种载体，但它可以包含两种载体。在两种载体的情况下，所述载体系统一般称为双载体系统。在Gynheung An等(1980)双载体系统，Plant Molecular Biology ManualA3，1-19中更详细地描述了双载体系统。
一个广泛使用的用于转化植物细胞、具有给定启动子或核苷酸序列或构成物的系统是基于对来自根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的Ti质粒和来自毛根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的Ri质粒的使用，这在An等(1986)，Plant Physiol.81，301-305和ButcherD.N.等(1980)Tissue Culture Methods for Plant Pathologists，编辑D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208中进行了描述。
已经构建了几种不同的Ti和Ri质粒，它们适于构建的上述植物或植物细胞。这种Ti质粒的非限制性的实例是pGV3850。
最好应当将所述核苷酸序列或构成物插入到Ti质粒T-DNA的末端序列之间或邻近T-DNA序列之处，以避免破坏紧靠在T-DNA边缘周围的序列，因为这些区域中至少一个区域似乎对将修饰的T-DNA插入到植物基因组中是必需的。
正如由上述说明可以明白的，如果所述生物是植物，那么所述载体系统最好是一个包括对感染所述植物必需的序列(例如vir区)和至少一个T-DNA序列的边缘部分的载体系统，所述边缘部分位于与遗传构成物相同的载体上。所述载体系统最好是根瘤土壤杆菌Ti质粒或毛根土壤杆菌Ri质粒或其衍生物，因为这些质粒是广为人知的，并在转基因植物的构建中广泛使用，存在许多基于这些质粒或其衍生物的载体系统。
在转基因植物的构建中，在将所述载体插入到所述植物之前，首先可以在所述载体可以在其中复制且易于操作的微生物中构建核苷酸序列。有用的微生物的实例是大肠杆菌，但也可以使用其它具有上述性质的微生物。当在大肠杆菌中构建如上定义的载体系统的载体时，如果必要，将其转移到合适的土壤杆菌菌株中，例如根瘤土壤杆菌。因此最好将带有所述核苷酸序列或构成物的Ti-质粒转移到合适的土壤杆菌菌株中，例如根瘤土壤杆菌，以便获得带有所述核苷酸序列的土壤杆菌细胞，随后将该DNA转移到待修饰的植物细胞中。
正如在CA-A-2006454中报导的，可使用大量克隆载体，它们包括在大肠杆菌中的复制系统和能够选择转化细胞的标记。所述载体包括例如pBR 322、pUC系列、M13 mp系列、pACYC 184等。
这样可以将所述核苷酸序列引入到所述载体中的合适的限制位置上。包含的质粒用于在大肠杆菌中转化。在合适的营养培养基上培养大肠杆菌细胞，然后收获并裂解细胞。然后回收所述质粒。作为分析方法，有一般使用的序列分析、限制性酶切分析、电泳和其它的生物化学-分子生物学方法。每次操作后，可以限制性酶切所使用的DNA序列，并与下一种DNA序列连接。可以在相同或不同的质粒中克隆每种序列。
在每次向植物中引入所需启动子或构成物或核苷酸后，存在和/或插入另外的DNA序列可能是必需的。例如，如果使用Ti-或Ri-质粒转化植物细胞，则可以连接位于引入的基因侧翼区域的Ti-或Ri-质粒T-DNA的至少右边界，然而经常是右边界和左边界。已经集中研究了用于转化植物细胞的T-DNA的应用，并在EP-A-120516；Hoekema，载于The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.B.，Alblasserdam，1985，第五章；Fraley等，Crit.Rev.Plant Sci.，41-46；和An等，EMEO J.(1985)4277-284中对其进行了描述。
用土壤杆菌直接感染植物组织是已经广泛使用的简单技术，在Butcher D.N.等(1980)，Tissue Culture Methods for Plant Pathologists，编辑D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208中对其进行了描述。关于这个主题的其它论述参见Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech三月/四月1994 17-27)。关于这个技术，可以在所述植物的某一部分或组织上，即在所述植物的叶、根、茎的部分或其它部分进行植物感染。
一般用具有所述启动子和/或GOI的土壤杆菌直接感染植物组织，在待感染的植物上制造创伤，例如通过用剃刀切所述植物，或用针刺破所述植物，或用研磨剂磨破所述植物。接着用土壤杆菌接种所述伤口。然后让接种的植物或植物部分在合适的培养基上生长，并让其发育成成熟植物。
当构建植物细胞时，这些细胞可以按照熟知的组织培养法生长和保持，诸如通过在合适的培养基上培养所述细胞，所述培养基提供诸如氨基酸、植物激素、维生素等的必需生长因子。可以使用已知的由细胞或组织培养物再生植物的方法，例如通过使用抗生素选择转化的苗，和通过在包含合适的营养物、植物激素等的培养基上继代培养所述苗，完成由转化细胞再生为基因修饰植物。
可以在EP-A-0449375中找到关于植物转化的其它论述。
总之，描述了适于用做食料或适于在食料制备中使用的组合物。所述组合物包括一种PME、第一PME底物和第二PME底物；其中不论是所述第一PME底物，还是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一种底物产生。
如上所指出，诸如由天然植物源获得的果胶的PME底物，一般是DE为大约70％的高酯果胶形式。必须向包含这些高酯PME底物的提取物中加入糖，以提供足够的可溶性固体引发胶凝。通常需要最少55％的可溶性固体。当可溶性固体百分比少于55％时，凝缩往往会发生得更频繁。当凝缩真的发生时，必须使用昂贵的添加剂引发胶凝。
至于本发明，我们发现，通过加入第二高酯PME底物可能使包含高酯PME底物的提取物产生胶凝是意想不到的。这些组合的高酯PME底物在可溶性固体少于50％的水平下的胶凝能力增加，完全出乎意料。先有技术一直讲高酯果胶在胶凝可以发生之前一般需要最少55％的可溶性固体含量。
因此，按照本发明该优选实施方案的最广泛的方面，我们提供一个处于固化凝胶状态的、可溶性固体含量少于50％(w/w)的令水系统；其中通过使用高酯PME底物产生胶凝。在运方面，可以通过在实施方案部分提及的步骤(在下文)测定固化凝胶状态。
本发明与WO-A-94/25575的论述的区别在于该专利申请没有公开乃至提出一种包括PME、第一PME底物和第二PME底物的组合物；更不用说提出一种组合物，其中不论是所述第一PME底物，还是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一种底物产生。对于JP-A-63/209533的论述同样如此。
也注意到在WO-A-94/25575中第12页(6-14行)的论述甚至背离了本发明。在这方面，在WO-A-94/25575中7和8行使用的术语“基于蔬菜或水果的产物”没有明确公开PME底物。而且，随后的在WO-A-94/25575中12至14行的一句话“另一方面(我们强调)，可以使用酶……对果胶的天然内容物脱甲基”明确指出WO-A-94/25575设想的反应介质只涉及一种PME底物，并没有涉及如在本发明中发现的至少两种PME底物。
现在仅通过实施方案描述本发明，其中参考附图
图1是条形图(显示PPME改性、加入的果胶和+/-钙的影响)。
图2是条形图(显示PPME处理水果和果胶(P66)的影响)。方案方案I钙敏感度指标(CF)以溶解在57.6毫克钙/克果胶溶液中的果胶的粘度除以在不加钙的溶液中正好等量的果胶的粘度测量钙敏感度。钙不敏感的果胶的CF值为1。
将4.2克果胶样品溶解在550毫升有效搅拌的热水中。将所述溶液冷却到大约20℃，并用1N HCl将其pH值调节至1.5。用水将果胶溶液调节至700毫升并搅拌。逐一将145克该溶液计量加入4个粘度玻璃杯中。在搅拌下将10毫升水加入到两个玻璃杯中(双测定)，并在搅拌下将10毫升250mM CaCl2溶液加入到另两个玻璃杯中。
在有效的磁力搅拌下，将50毫升醋酸盐缓冲液(0.5 M，pH值大约4.6)加入到所有四个粘度玻璃杯中，从而使果胶溶液的pH值升至超过4.0。移开磁力搅拌器，并将玻璃杯置于20℃过夜。在第二天用Brookfield粘度计测量粘度。如下计算钙敏感度指标
方案II酯化度(％DE)向50毫升60％异丙醇和5％ HCl的溶液中加入2.5克果胶样品，并搅拌10分钟。通过一玻璃滤器过滤果胶溶液，并将其用15毫升60％异丙醇/5％ HCl的溶液洗涤6次，接着再用60％异丙醇洗涤，直至滤液不含氯化物。所述滤液在80℃整夜干燥。
在锥形瓶中合并20.0毫升0.5 N NaOH和20.0毫升0.5 N HCl，并加入2滴酚酞(phenolphtalein)。用0.1 N NaOH对其滴定，直至出现持久的变色。所述0.5 N HCl应当稍强于所述0.5 N NaOH。加入的0.1 N NaOH的体积称为V0。
将0.5克干燥的果胶样品(所述滤液)放入锥形瓶中，并用96％的乙醇使所述样品湿润。加入100毫升新近煮沸并冷却的蒸馏水，搅拌所得的溶液，直至果胶完全溶解。然后加入5滴酚酞，并用0.1N NaOH滴定所述溶液(直至变色，并且pH值为8.5)。在此使用的0.1 N NaOH的量称为V1。加入20.0毫升0.5 N NaOH并剧烈振摇烧瓶，然后使其静置15分钟。加入20.0毫升0.5 N HCl，振摇所述烧瓶直至粉红色消失。然后加入3滴酚酞，接着将所得的溶液用0.1 N NaOH滴定。所用的0.1 N NaOH的体积称为V2。
如下计算酯化度(％DE％总羧基)%DE=V2-V0V1+(V2-V0)]]>制备食物介绍作为介绍，按照本发明的食物组合物可以包含一种或多种其它组分，诸如一种或多种食物成分。典型的食物组分包括酸(诸如柠檬酸)或糖(诸如蔗糖、葡萄糖或转化糖)或水果或酶中的任何一种或多种。
例如，水果不仅给予了凝胶味道、颜色和结构，而且给予了果胶、酸和少量固体。根据水果中天然香料和色素的水平，水果用量一般是果酱的25％至60％。普通水果的固体含量在10％ Brix左右，但也可以使用一般在65％至70％ Brix的水果浓缩物。水果的pH值随所述水果而变化很大，但多数水果的pH值在3.0和3.5之间。
果胶含量也随该水果而变化。例如，红醋栗、黑醋栗和橙的果胶含量高，可以通过只加入少量额外的果胶，得到来自这些水果的满意的凝胶。GRINDSTEDTM果胶的选择取决于该果酱的类型。例如，GRINDSTEDTM果胶SS 200用于不包含水果块的果酱或只包含很小水果块的果酱。在这种果酱中的水果分离不成问题，并因此可以使用慢凝果胶和较低的灌装温度。在包含大水果块或整个水果的果酱中使用GRINDSTEDTM果胶RS 400，所述整个水果例如樱桃或草莓。在包含整个水果的果酱中可能难以避免水果分离，所以必需使用诸如GRINDSTEDTM果胶RS 400的快凝果胶。
果胶类型的选择也取决于该容器的尺寸。当使用标准广口瓶时，灌装温度相对于果胶稳定性而言较为不重要，因为在灌装后广口瓶降温相对较快，果胶将不降解。然而，如果将果酱灌入大容器中，例如500或1000公斤的容器，则冷却时间将会很长。在这种大容器的中央，果胶尤其易遭降解，在中央的凝胶比在边缘的果胶更脆弱。因此，更慢速凝结的果胶一般用于大容器，让其在较低温度灌装，从而避免果胶降解。
因为各种诸如以下的原因将糖加入到果酱中1.为提供可溶性固体-在HE果胶胶凝前，它们可能需要最少55％的可溶性固体含量2.为提供甜味3.为提供增加的物理、化学和微生物稳定性4.为提供改善的口感5.为提供改善的颜色和光泽蔗糖是通常使用的糖，但根据需要的味道、变甜效果、结晶或结构，也可以适当地使用其它糖。价格也可以影响使用的糖的类型。
转化糖和蔗糖具有相同的变甜效果，但是葡萄糖浆、葡萄糖和山梨糖醇的变甜效果降低。高果糖玉米浆和果糖具有比蔗糖更高的变甜效果。
在某种程度上，改变糖的组成将影响凝胶的结构和强度以及胶凝温度。
由于两个原因加入酸1)部分原因是为了降低pH水平至3.0-3.2，以获得具有所述果胶的满意的凝胶，和2)部分原因是为了增强水果的香味。使用HE果胶的胶凝的最适pH值取决于该果胶的类型和固体的含量。
如果在65％-68％ Brix的果酱中使用GRINDSTEDTM果胶SS 200，则最适pH值是3.0-3.2。
如果固体含量高于65％-68％ Brix，则最适pH值是3.1-3.3。
相反，如果固体含量较低，则最适pH值是2.8-3.0。
如果使用GRINDSTEDTM果胶RS 400，则最适pH值大约比用GRINDSTEDTM果胶SS 200高0.2单位。
最常使用的酸是在50％(w/v)溶液中的柠檬酸一水合物。
可以使用其它酸(诸如苹果酸、酒石酸或磷酸)，但必须一直在溶液中。
根据法规、价格和在成品中需要的酸度甜味选择酸。
柠檬酸给予成品的酸味相对较强，但苹果酸产生较温和但更持久的味道。
酒石酸可以产生微苦的味道，而磷酸产生较甜的味道。
酶促处理的果胶可以防止在生产可溶性固体含量低的柑橘酱和果酱时可能经常发生的凝缩。具有25％ SS的低糖果酱和柑橘酱配方
*典型的水果包括草莓、苹果、樱桃、柑桔类水果和黑醋栗。**或任何其它食用酸1所述酶改性的果胶可以是WO-A-97/03574中的果胶2所述PME可以是WO-A-97/03574中的PME。步骤制备果胶溶液1.干法混合酶改性的果胶和糖
2.在热水(80℃)中溶解果胶-糖混合料，充分搅拌果酱1.混合水果、糖和水2.将水果混合料短时间煮沸，并冷却至40℃3.冷却至40℃后，加入PME溶液4.水果混合料的反应时间是1小时5.将水果混合料加热至85℃几分钟，将所述果酱蒸发至需要的可溶性固体含量6.加入果胶溶液7.加入防腐剂并调节pH值8.将所述果酱冷却至灌装温度，灌装并冷却至室温这个实施例可以通过加入至少一种其它合适的食物成分或用至少一种其它合适的食物成分取代而加以修改，和/或通过加入另一种合适的酶(诸如葡聚糖酶)而加以修改。具有50％ SS的低糖果酱和柑橘酱配方
>*典型的水果包括草莓、苹果、樱桃、柑橘类水果和黑醋栗。**或任何其它食用酸1所述酶改性的果胶可以是WO-A-97/03574中的果胶2所述PME可以是WO-A-97/03574中的PME。步骤果胶溶液的制备1.干法混合酶改性的果胶和糖2.在热水(80℃)中溶解果胶-糖混合料，充分搅拌果酱1.混合水果和水2.将水果混合料短时间煮沸，并冷却至40℃3.冷却至40℃后，加入PME溶液4.水果混合料的反应时间是1小时5.将所述水果混合料加热至85℃几分钟6.加入余下的糖和果胶溶液，将所述果酱蒸发至需要的可溶性固体含量7.将所述果酱冷却至灌装温度，灌装并冷却至室温这个实施例可以通过加入至少一种其它合适的食物成分或用至少一种其它合适的食物成分取代而加以修改，和/或通过加入另一种合适的酶(诸如葡聚糖酶)而加以修改。
对本发明的修改对于本领域那些技术人员来说是显而易见的。例如，正如以上实施例指出的，另外的实施例将包括使用PME和葡聚糖酶二者，以获得具有较低酯化度的果胶(例如慢凝果胶)。制备植物PME改性的桔浆(orange mash)步骤I在搅拌器中将桔子片匀浆并煮沸15分钟，以灭活任何内源酶。冷冻/融化后，加入20％(w/w)糖，并用预加热的(95-100℃)去离子水将桔浆1∶1稀释。将所述浆转移至玻璃烧杯中，分别将其pH值和温度调节至7.0(使用10％ NaOH)和40℃。
以113μl/200g桔浆的浓度将纯化的植物PME(300μmol/min/ml)和所述桔浆于40℃温育15分钟，之后使用柠檬酸(50％ w/v)将其pH值调节至3.2(+/-0.6)。为灭活加入的植物PME，将所述桔浆于85℃热处理3分钟。虽然植物PME活性一般需要加入NaCl来确保活性，但制备该酶改性的桔浆不需要任何加入的外源性NaCl，因为存在足够的内源性NaCl(24ppm)确保PME活性。
于5℃将植物PME处理的桔浆(大约90克)储存在结晶皿(直径60毫米，高度35毫米)中。所有的果胶胶凝测量均在处理的三天内进行，并产生可重现的结果。步骤II-选择、制备和加入果胶底物选择选择要使用的三种果胶底物。所有三种底物，GRINDSTEDTM果胶SS200、P66和P60底物的酯化度(％DE)均高。它们的酯化度分别为65％、66％和60％。P60和P66都通过植物PME预处理GRINDSTEDTM超快速凝结(URS)果胶产生，而GRINDSTEDTM果胶SS200未处理。所述三种底物中的两种，P60和P66，是钙敏感性的，而GRINDSTEDTM果胶SS200是钙非敏感性的。所述底物中只有一种，GRINDSTEDTM果胶SS200，是市售的。
制备通过下述步骤，用植物PME预处理GRINDSTEDTMURS果胶，产生P66和P60在0.15 M NaCl中溶解GRINDSTEDTMURS果胶，并用植物PME于40℃在pH 7.0下将其处理几小时。在将pH值调节至3.0后，将溶解的果胶加热至100℃ 5-10分钟，以使存在的任何PME失活，在此之后用异丙醇沉淀溶解的果胶，并在使用前干燥。将所有三种果胶底物制备成8％的溶液，并用磁力搅拌器使其在预加热(80℃)的去离子水中完全溶解。
加入在将每种果胶底物加入到植物PME酶改性的桔浆中时使用高速磁力搅拌器，以确保溶液均一。步骤III-制备和加入柠檬酸钙在高温下通过加入或者作为浆液或者作为水合物的钙，可以引发果胶胶凝。向混合物中加入终浓度为5mM的的柠檬酸钙(C12H10Ca3O144H2O)。步骤IV-测量凝胶强度使用结构分析仪(Texture Analyser)，通过抗压试验，测定果胶胶凝的程度/凝胶强度。在“The Chemistry and Technology of Pectin”编辑Reginald H Walker；Academic Press；(1991)第240页(其内容通过引用结合到本文中)中描述了该方法。
在SMS TA-XT2结构分析仪(Reciproter)上使用冷藏(5℃)的探针(P25/L)，以2.0毫米/秒的速度和30％的穿透率，对由加压产生的粘度进行测量。样品温度是5℃。在压力曲线上的压力峰值表示以牛顿单位计的凝胶强度。步骤V-测试凝缩和凝固凝缩的定义是果胶凝胶不能形成固体。如果凝胶在包含它的反应器中翻转后不能保持完整，那么就认为其显示凝缩。如果凝胶在包含它的反应器中翻转后能保持完整，那么就认为其显示凝固。完整的凝胶与不完整的凝胶相比显示很平坦的表面。结果植物PME处理的桔浆的表征植物PME处理桔浆产生具有55.2％的平均酯化度(％DE)的高酯果胶(按照方案II测定％DE)。表I.钙(0.096/克柠檬酸钙/100/克桔浆)和/或植物PME处理对桔浆凝胶强度的影响
<p>通过或者用植物PME处理，或者加入钙，稍微改变提取的桔浆的凝胶强度(表I)。然而，用植物PME连续处理桔浆，接着加入钙，没有对获得的凝胶强度产生协同作用。目视检查所述凝胶表明它们全部是液体形式。
这些结果证明，尽管在其酯化度(55.2％的％ DE)和其对低水平内源钙的响应方面，植物PME处理桔浆产生更均一的产物，但在钙胶凝或增加的凝胶强度方面，酶改性的桔浆对外源加入的钙没有反应。
这些结果也证明，植物PME处理的桔浆与或者内源，或者外源加入的钙离子反应，不足以满足对凝胶强度产生令人满意的增加。
在钙存在或不存在时，向植物PME改性的桔浆中加入诸如P66或P60的第二果胶底物，与未处理的桔浆对照相比，凝胶强度产生显著的增加(表II；图1)。具体地说，P66和P60果胶底物，在钙存在时将每种底物加入到植物PME改性的桔浆中以后，它们分别对凝胶强度产生3倍和5倍的增加。凝胶强度增加的倍数略低于宣布的两种果胶底物在没有钙时在反应混合物中产生的增加倍数。
向植物PME改性的桔浆中加入GRINDSTEDTM果胶SS200底物，没有使凝胶强度产生成倍的增加，因为GRINDSTEDTM果胶SS200底物不是PME预处理的，因此证明组合的底物不可能胶凝。
表II.组合果胶底物和钙对获得的凝胶强度的影响<
<p>在钙存在而不是在其不存在时，将P66果胶底物和植物PME改性的桔浆混合后获得凝固的凝胶。相反，或者在钙存在或者在钙不存在时，将P60果胶底物和植物PME改性的桔浆混合后产生凝固的凝胶。
图2图解说明了PME处理和存在钙这二者对果胶胶凝的相加作用。该图提出了当在钙存在和不存在时，将P66果胶底物加入到或者未处理的，或者PME处理的桔浆中时，观察到的凝胶强度(或硬度)的相对增长百分比。在每个条柱的后面列出了凝胶强度(N)的精确值，而在每个条柱的顶部列出了凝胶强度的相对增长百分比。从左至右看图，条柱1指出了未处理的桔浆的凝胶强度低，目测检查它是液体形式。当将诸如P66的第二果胶底物在没有钙的情况下加入到未处理的桔浆中时，对得到的凝胶强度没有影响(条柱2)。然而，如果将P66加入到植物PME处理的桔浆中，会观察到果胶粘度增加(条柱3)。在钙存在时通过将P66和未处理的桔浆混合，观察到果胶粘度相似的增长(条柱4)。最后，如果在钙存在时将P66加入到植物PME处理的桔浆中，则获得凝固的凝胶(条柱5)。获得的结果与进行生了底物的混合和PME处理的顺序无关。因此，如果GRINDSTEDTMURS果胶底物和桔浆制备物混合，并在存在钙的情况下进行PME处理，或者如果在存在钙的情况下将GRINDSTEDTMURS果胶底物和桔浆制备物分别用PME预处理，然后将它们混合，则获得凝固的凝胶。
重复在图1和图2中描述的实验，并在表III中列出了结果。目测由这些实验产生的凝胶证实了较早的发现(i)单独的桔浆或用植物PME和钙或者单独或者组合处理后的桔浆，将不引发凝胶强度的增加。
(ii)单独将钙加入到GRINDSTEDTMURS果胶中不改变果胶的功能性。同样，如果没有用植物PME处理GRINDSTEDTMURS果胶，则当它和植物PME处理的桔浆在或者存在钙或者不存在钙下混合时，观察到粘度增加，但不凝固。
(iii)用植物PME处理GRINDSTEDTMURS果胶产生P66，在钙存在的情况下当它同植物PME处理的桔浆混合时，使果胶功能性更强。在凝胶样品中引发凝固表明这种增加的功能性。
(iv)用植物PME处理两种果胶底物，诸如桔浆和GRINDSTEDTMURS果胶，产生功能性更强的高酯果胶，它在钙存在时能够引发低固体果酱凝固。
表III. 组合果胶底物和钙对观察到的凝胶强度的影响
*是GRINDSTEDTMURS果胶。讨论当由桔浆匀浆制备低可溶性固体果酱时，即使在植物PME处理或加入外源钙后，也没有观察到胶凝。而且，如果将诸如P66的第二高酯果胶加入到未处理的桔浆制备物中，即使用植物PME酶预处理第二果胶底物使其更具功能性，也没有影响其胶凝能力。然而，如果诸如P66的第二高酯果胶底物在钙存在下与未处理的桔浆混合，将观察到凝胶粘度增加。如果相同的高酯果胶底物(P66)同植物PME处理的桔浆在没有钙时混合，则在凝胶粘度的增加方面观察到相似的效果。
这些结果指出，或者通过在桔浆和诸如P66的高酯果胶底物混合前用植物PME处理桔浆，或者通过在钙存在时将未处理的桔浆和P66混合，可以引发凝胶粘度增加。所述结果也指出，在钙存在时P66和植物PME处理的桔浆混合将造成凝胶凝固。获得该效果与进行混合和用PME处理底物的顺序无关。因此，或者通过在混合前用PME预处理果胶底物，或者通过在钙存在时PME处理混合底物，将观察到凝胶凝固。总结当由桔浆制备低可溶性固体果酱时，即使在用植物PME处理桔浆后或加入外源钙后，也没有观察到胶凝。
如果将第二高酯果胶底物加入到未处理的桔浆中，即使在加入前用植物PME酶预处理使其更具功能性，对其凝胶能力也无影响。
将植物PME处理的桔浆同PME预处理的高酯果胶底物混合，在钙存在或不存在时，将产生凝胶强度显著增加和功能性提高的凝胶。因此，在钙存在时PME处理或者单独或者组合的果胶底物，通过使所述果胶底物作为高酯底物更具功能性而提高它们的胶凝能力。序列SEQ.I.D.NO.1MIKNMTDTDM MIMRTSNNRK LIEETSTVDG WPAWLSTGDR RLLQSSSVTP 50NVVVAADGSG NFKTVAAAVA AAPQGGTKRY IIRIKAGVYR ENVEVTKKHK100NIMFIGDGRT RTIITGSRNV VDGSTTFKSA TVAVVGEGFL ARDITFQNTA150GFSKHQAVAL RVGADLSAFY NCDMLAYQDT LYVHSNRQFF VNCLIAGTVD200FIFGNAAAVL QNCDIHARKP NSGQKNMVTA QGRADPNQNT GIVIQKSRIG250ATSDLKPVQG SFPTYLGRPW DEYSRTVIMQ SSITDVIHPA GWHEWDGNFA300LNTLFYGEHQ NAGAGAGTSG RVKWKGFRVI TSATEAQAFT PGSFIAGSSW350LGSTGFPFSL GL 362SEQ.I.D.NO.2MTRIKEFFTK LSESSTNQNI SNIPKKKKKL FLALFATLLV VAAVIGIVAG 50VNSRKNSGDN GNEPHHAILK SSCSSTRYPD LCFSAIAAVP EASKKVTSQK100DVIEMSLNIT TTAVEHNYFG IQKLLKRTNL TKREKVALHD CLETIDETLD150ELHKAVEDLE EYPNKKSLSQ HADDLKTLMS AAMTNQGTCL DGFSHDDANK200HVRDALSDGQ VHVEKMCSNA LAMIKNMTDT DMMIMRTSNN RKLIEETSTV250DGWPAWLSTG DRRLLQSSSV TPNVVVAADG SGNFKTVAAS VAAAPQGGTK300RYIIRIKAGV YRENVEVTKK HKNIMFIGDG RTRTIITGSR NVVDGSTTFK350SATVAVVGEG FLARDITFQN TAGPSKHQAV ALRVGADLSA FYNCDMLAYQ400DTLYVHSNRQ FFVNCLIAGT VDFIFGNAAA VLQNCDIHAR KPNSGQKNMV450TAQGRADPNQ NTGIVIQKSR IGATSDLKPV QGSFPTYLGR PWKEYSRTVI500MQSSITDVIH PAGWHEWDGN FALNTLFYGE HQNAGAGAGT SGRVKWKGFR550VITSATEAQA FTPGSFIAGS SWIGSTGFPF SLGL 584SEQ.I.D.NO.3GTAGCAATGC GCTTGCTATG ATCAAGAACA TGACTGACAC CGACATGATG 50ATCATGAGGA CTTCAAACAA CAGGAAGCTG ATAGAGGAGA CCAGTACGGT100TGATGGGTGG CCGGCGTGGC TGTCCACCGG AGACAGGAGG CTGTTGCAGT150CCTCGTCGGT GACACCGAAC GTGGTGGTGG CAGCAGATGG CAGCGGAAAC200TTTAAGACGG TGGCGGCAGC GGTGGCGGCG GCTCCTCAGG GAGGCACTAA250GCGGTATATT ATTAGGATTA AAGCCGGTGT TTATCGGGAA AATGTTGAGG 300TGACAAAGAA GCATAAAAAT ATAATGTTCA TCGGTGACGG GAGGACTAGA 350ACTATCATCA CAGGAAGTAG AAATGTGGTT GATGGAAGCA CAACTTTCAA 400GTCTGCTACA GTTGCTGTTG TTGGTGAAGG ATTCTTGGCC CGAGACATTA 450CATTCCAAAA CACAGCCGGC CCCTCAAAGC ACCAGGCGGT GGCACTACGA 500GTGGGAGCTG ACCTTTCAGC ATTTTACAAT TGCGATATGT TAGCTTACCA 550AGACACACTC TACGTCCACT CGAACCGCCA GTTCTTTGTG AACTGCTTAA 600TTGCTGGCAC GGTTGATTTT ATTTTTGGTA ACGCTGCAGC CGTGTTACAA 650AATTGTGACA TCCATGCACG AAAGCCCAAT TCCGGCCAAA AAAATATGGT 700CACAGCCCAA GGCAGGGCTG ACCCTAACCA AAACACCGGC ATTGTCATTC 750AAAAATCTAG GATTGGTGCC ACCTCCGATT TAAAACCGGT TCAGGGTAGT 800TTCCCGACGT ACCTCGGCAG GCCCTGGAAG GAGTACTCGA GGACGGTGAT 850CATGCAGTCA TCGATTACTG ACGTGATCCA CCCTGCCGGG TGGCACGAGT 900GGGATGGTAA CTTCGCGTTG AACACATTGT TTTACGGAGA GCATCAGAAC 950GCCGGAGCCG GTGCCGGAAC TTCAGGGAGA GTGAAATGGA AGGGATTTAG 1000GGTTATTACA AGTGCTACCG AGGCTCAAGC TTTTACTCCT GGAAGCTTCA 1050TTGCTGGTAG TAGCTGGCTG GGCTCCACTG GTTTCCCATT CTCCCTTGGT 1100TTGTAATATT CACTAGGAGT TTTAATTAAT ATGTTTTGTA TTAGTGGATC 1150CATAGGTCTC TGGTCTTTCA ATTTGTAATA TTTGATTGAG CGTGTCTTAT 1200TCGTGGCTTC GATTTCACAA ATACTATTGT GTGATTAACA AGAAATAAAA 1250TAGCATGGGA AGAATAATAA TTTCCGGCTT CTTTAAAAAA AAAAAAAAAA 1300AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA 1323SEQ.I.D.NO.4CTTTTGTTCT CTCTTATCGA GAAAAAAAAT GACCCGCATA AAAGAATTCT 50TCACAAAACT TTCTGAATCT TCTACCAACC AAAACATTTC CAATATTCCC 100AAGAAAAAAA AGAAACTATT CTTAGCTCTT TTTGCAACGC TACTCGTTGT 150CGCTGCCGTA ATCGGCATTG TCGCCGGAGT GAACTCAAGA AAAAACTCCG 200GCGACAACGG CAACGAGCCT CATCATGCTA TCCTCAAATC ATCATGCAGC 250AGCACAAGGT ACCCGGACTT ATGCTTTTCG GCTATTGCTG CCGTTCCAGA 300GGCCTCCAAA AAGGTGACAA GCCAAAAGGA CGTTATTGAG ATGTCCTTAA 350ACATCACAAC AACAGCCGTG GAACACAACT ACTTCGGGAT TCAGAAGCTC 400TTGAAGAGAA CGAATCTCAC CAAACGGGAA AAGGTTGCTC TCCATGACTG 450TCTTGAGACG ATCGATGAGA CTCTTGATGA GTTACACAAA GCCGTCGAGG 500ATCTTGAGGA GTACCCGAAC AAGAAATCTT TATCACAGCA TGCGGATGAT 550CTCAAAACCC TAATGAGTGC CGCGATGACC AATCAGGGGA CGTGTCTTGA 600TGGGTTCTCT CATGATGATG CTAATAAGCA CGTGCGGGAT GCGTTGTCAG 650ACGGCCAGGT TCATGTTGAG AAGATGTGTA GCAATGCGCT TGCTATGATC 700AAGAACATGA CTGACACTGA CATGATGATC ATGAGGACTT CAAACAACAG 750GAAGCTGATA GAGGAGACCA GTACGGTTGA TGGGTGGCCG GCGTGGCTGT 800CCACCGGAGA CAGGAGGCTG TTGCAGTCCT CGTCGGTGAC ACCGAACGTG 850GTGGTGGCAG CAGATGGCAG CGGAAACTTT AAGACGGTGG CGGCATCGGT 900GGCGGCGGCT CCTCAGGGAG GCACTAAGCG GTATATTATT AGGATTAAAG 950CCGGTGTTTA TCGGGAAAAT GTTGAGGTGA CAAAGAAGCA TAAAAATATA1000ATGTTCATCG GTGACGGGAG GACTAGAACT ATCATCACAG GGAGTAGAAA1050TGTGGTTGAT GGAAGCACAA CTTTCAAGTC TGCTACAGTT GCTGTTGTTG1100GTGAAGGATT CTTGGCCCGA GACATTACAT TCCAAAACAC AGCCGGCCCC1150TCAAAGCACC AGGCGGTGGC ACTACGAGTG GGAGCTGACC TTTCAGCATT1200TTACAATTGC GATATGTTAG CTTACCAAGA CACACTCTAC GTCCACTCGA1250ACCGCCAGTT CTTTGTGAAC TGCTTAATTG CTGGCACGGT TGATTTTATT1300TTTGGTAACG CTGCAGCCGT GTTACAAAAT TGTGACATCC ATGCACGAAA1350GCCCAATTCC GGCCAAAAAA ATATGGTCAC AGCCCAAGGC AGGGCTGACC1400CTAACCAAAA CACCGGCATT GTCATTCAAA AATCTAGGAT TGGTGCCACC1450TCCGATTTAA AACCGGTTCA GGGTAGTTTC CCGACGTACC TCGGCAGGCC1500CTGGAAGGAG TACTCGAGGA CGGTGATCAT GCAGTCATCG ATTACTGACG1550TGATCCACCC TGCCGGGTGG CACGAGTGGG ATGGTAACTT CGCGTTGAAC1600ACATTGTTTT ACGGAGAGCA TCAGAACGCC GGAGCCGGTG CCGGAACTTC1650AGGGAGAGTT AAATGGAAGG GATTTAGGGT TATTACAAGT GCTAACGAGG1700CTCAAGCTTT TACTCCTGGA AGCTTCATTG CTGGTAGTAG CTGGCTGGGC1750TCCACTGGTT TCCCATTCTC CCTTGGTTTG TAATATTCAC TAGGAGTTTT1800AATTAATATG TTTTGTATTA GTGGATCCAT AGGTCTCTGG TCTTTCAATT1850TGTAATATTT GATTGAGCGT GTCTTATTCG TGGCTTCGAT TTCACAAATA1900CTATTGTGTG ATTAACAAGA AATAAAAATG CATGGGAAGA ATAATAATTT1950CCGGCTTCTT TAAATTAAAA AAAAA 197
权利要求
1.包含果胶甲酯酶(“PME”)、第一PME底物和第二PME底物的组合物；其中无论是所述第一PME底物，还是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一种底物产生。
2.按照权利要求1的组合物，其中所述PME利用重组DNA技术制备。
3.按照权利要求1或权利要求2的组合物，其中至少一种所述PME底物是果胶，或是可得自果胶的底物，或是由果胶衍生的底物。
4.按照权利要求3的组合物，其中所述第一PME底物和所述第二PME底物每种都独立选自果胶，或是可得自果胶的底物，或是由果胶衍生的底物。
5.按照前述权利要求中任一项的组合物，其中所述第一PME底物存在于植物和/或植物材料中。
6.按照权利要求5的组合物，其中所述植物或植物材料是蔬菜、蔬菜材料、水果或水果材料中的任何一种或多种。
7.按照权利要求5和权利要求6的组合物，其中所述第一PME底物存在于蔬菜材料和/或水果材料中。
8.按照前述权利要求中任一项的组合物，其中所述蔬菜材料和或所述水果材料是浆料。
9.按照前述权利要求中任一项的组合物，其中所述组合物是食料或用于制备食料。
10.按照前述权利要求中任一项的组合物，其中将所述第二PME底物加入到所述第一PME底物中。
11.制备组合物的方法，所述方法包括形成PME、第一PME底物和第二PME底物的混合物；其中无论是所述第一PME底物，还是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一种底物产生。
12.按照权利要求11的方法，其中所述PME由前述权利要求中任一项所定义。
13.按照权利要求11或权利要求12的方法，其中所述第一PME底物由前述权利要求中任一项所定义。
14.按照权利要求11至13中任一项的方法，其中所述第二PME底物由前述权利要求中任一项所定义。
15.按照权利要求11至14中任一项的方法，其中所述方法用于制备食料。
16.包括向第一PME底物加入PME和第二PME底物的工艺；其中无论是所述第一PME底物，还是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一种底物产生。
17.赋予包含第一PME底物的反应介质稳定性的工艺，所述方法包括至少加入PME和第二PME底物；其中无论是所述第一PME底物，还是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一种底物产生。
18.按照权利要求17的工艺，其中所述反应介质是食料或用于制备食料。
19.由PME、第一PME底物和第二PME底物制备的组合物；其中无论是所述第一PME底物，还是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一种底物产生。
20.处于凝固凝胶状态的含水系统，它的可溶性固体含量低于50％(w/w)；其中所述胶凝利用高酯PME底物产生。
21.包含PME、第一PME底物和第二PME底物的组合物；其中无论是所述第一PME底物，还是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一种底物产生；并且其中至少所述第二PME底物经PME预处理。
22.包括按照任一前述权利要求或按照任一前述权利要求由本发明或通过本发明制备的食料。
23.大致如本文所述的组合物或工艺或方法或食料。
全文摘要
描述了一种适于用作食料或在食料制备中使用的组合物。所述组合物包含果胶甲酯酶(“PME”)、第一PME底物和第二PME底物,其中无论是所述第一PME底物,还是所述第二PME底物,都不是在原位由所述另一种底物产生。
文档编号A23L1/03GK1260687SQ98806280
公开日2000年7月19日 申请日期1998年4月24日 优先权日1997年4月24日
发明者J·D·克赖贝格, T·M·I·E·克里斯藤森, S·希特尔 申请人:丹尼斯科有限公司