专利名称：抗微生物肽的制作方法
背景技术：
本发明涉及新的人类防卫素肽。具体地说，本发明提供了编码人类抗微生物肽的分离的核酸分子。本发明也提供了抗微生物肽以及载体、宿主细胞和产生该肽、载体、宿主细胞的重组方法。本发明还提供了用于检测与免疫系统有关的病症的诊断方法和用于治疗这些病症的方法。
发明所属技术领域相关技术呼吸上皮在哺乳动物中的关键作用之一是形成防止可能有害的环境威胁的屏障。已经确定其防卫机制是保护呼吸道免受据认为与空气传播途径疾病有关的空中传播物质(如传染性物质、煤气和微粒)的侵害。(Newhouse等，″呼吸道防卫机理″，肺病教科书，Little Brown和Co.(1989))。最近对得自各种物种的抗微生物肽的鉴定和表征揭示了动物宿主防卫系统的一个新成员，并且据认为它参与抗可能微生物病原体的防卫。这些新近确定的抗微生物肽家族包括杀菌肽、爪蟾抗菌肽和防卫素。杀菌肽是结构上相关的抗微生物多肽的第一个完全鉴定出的家族，并且发现其存在于广泛分布的昆虫中。(Bowman等，微生物学年鉴41103(1987))。在脊椎动物中，抗微生物肽的爪蟾抗菌肽家族已自有爪蟾蜍的皮肤和胃肠道腺体中分离得到，并且认为它们形成了抗感染的两栖动物粘膜表面的防卫系统的基础。(Soravia等，FEBS Lett.228337(1988)；Zasloff等，美国国家科学院院报，845449(1987))。防卫素是在分离自几种哺乳动物物种(包括人)的噬菌细胞中发现的抗微生物肽，人们可以通过其序列中的八个不变残基来表征它。(Gabay等，Curr.Opin.Immunol.136(1988)；Gabay等，美国国家科学院院报，865610(1989)；Ganz等，传染免疫，55568(1987)；Ganz等，免疫学杂志，1431358(1989)；Ganz等，临床研究杂志，761427(1985))。
诸如防卫素之类的肽的抗微生物活性的机理经由导致特征性广谱的抗生素活性的选择性膜破裂来形成。(Bowman，免疫学年鉴1361(1995))。防卫素的抗微生物谱包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、分技杆菌、苍白密螺旋体、许多真菌、一些有包膜病毒。(Bowman，免疫学年鉴1361(1995))。防卫素具有抗多个正常和恶性靶的非特异性细胞毒性活性，包括抗TNF-α和NK-细胞溶解因子的细胞抗性。它们似乎经由普通机理来杀害哺乳动物靶细胞和微生物，这些机理包括与带负电的靶细胞表面分子之间的初始静电作用，其后插入至它们可渗透的细胞膜中，形成电压调节通道。(Lehrer等，免疫学年鉴11105(1993))。除它们的抗微生物与细胞毒性性质之外，一些防卫素充当调理素，而另一些则抑制蛋白激酶C、特异性地结合ACTH受体以及封阻类固醇生成或充当单核细胞的选择性趋化素。防卫素新近被描述为效应分子家族，对人类来说，其对于宿主细胞防卫、发炎和细胞毒性的贡献可能是巨大的。(Lehrer等，免疫学年鉴11105(1993))。防卫素是碱性肽，其具有30-34个氨基酸，有三个二硫键。已知的并且已鉴定出的骨髓和非骨髓组织的防卫素都具有属于该家族的高度保守的氨基酸残基，其包括6个不变的半胱氨酸。最近的研究发现；类似的抗微生物肽也由某些上皮细胞制造，这表明它们在粘膜表面的防卫中起着附加的作用。(Diamond等，美国国家科学院院报，905496(1993)；Diamond等，美国国家科学院院报，883952(1991)；Eisenhauer等，传染免疫，603556(1992)；Jones等，生物化学杂志，26723216(1992)；Schonwetter等，科学2671645(1995)；Selsted等，细胞生物学杂志，118929(1992))。
气管抗微生物肽(TAP)是具有38个氨基酸的肽，其分离自牛呼吸道粘膜，并且是现在已被认为属于比较大的抗微生物肽家族(β-防卫素)的第一个成员，该家族的所有成员在体外都具有广谱的抗微生物活性。(Diamond等，美国国家科学院院报，883952(1991))。前不久，自牛舌头分离得到上皮细胞源的第二类β-防卫素(即舌抗微生物肽(LAP))。(Schonwetter等，科学2671645(1995)；Selsted等，细胞生物学杂志，118929(1992))。
因此，需要具有如抗微生物或免疫调节剂一样的功能的多肽，因为在与传染病有关的病症、发炎以及免疫紊乱中可能涉及这种调节的障碍。
发明概述本发明公开了分离的核酸分子，该核酸分子包含编码抗微生物多肽的多核苷酸，该抗微生物多肽具有SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列或者为cDNA克隆所编码的氨基酸序列，该cDNA克隆于1997年4月14日以保藏号97982保藏在美国典型培养物保藏中心专利保藏处，10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209。
本发明也涉及重组载体，该重组载体包含本发明的分离的核酸分子，以及涉及包含重组载体的宿主细胞，并且还涉及制造这样的载体和宿主细胞的方法和利用它们由重组技术来产生抗微生物多肽或肽的方法。
本发明还公开了分离的人抗微生物多肽，该抗微生物多肽具有由本文描述的多核苷酸编码的氨基酸序列。
本发明公开了一种在免疫系统紊乱的诊断期间有用的诊断方法。
本发明还涉及治疗需要增加体内抗微生物肽活性水平的个体的方法，该方法包括向这样的个体施用包含治疗上有效量的本发明分离的抗微生物肽或其兴奋剂的组合物。
本发明还涉及治疗需要减少体内抗微生物肽活性水平的个体的方法，该方法包括向这样的个体施用包含治疗上有效量的抗微生物肽拮抗剂的组合物。
附图概述
图1显示核苷酸(SEQ ID NO1)和人类抗微生物肽的推定的氨基酸(SEQ ID NO2)序列。蛋白质含有具有大约23个氨基酸残基(有下划线)的前导序列和推定的大约7.3kDa分子量。图1中的带下划线的氨基酸残基(即前23个氨基酸)对应于SEQ ID NO2中的氨基酸-23至-1。图1中的其后41个氨基酸(无下划线)对应于SEQ ID NO2中的氨基酸1至41。
图2显示抗微生物肽蛋白质与牛气管抗微生物肽(SEQ ID NO3)的氨基酸序列之间的相似性区。
图3显示抗微生物肽氨基酸序列的分析结果。α、β、回转和螺旋区，亲水性、疏水性和两亲性区，柔性区，抗原指数以及表面可能性都得到了显示。在“抗原指数-Jameson-Wolf”图中，图1中的大约42至大约50以及大约54至大约64的氨基酸残基对应于所显示的抗微生物肽蛋白质的高抗原区。图1中的这些高抗原片段分别对应于下列片段SEQ ID NO2中的大约19至大约27以及大约31至大约41的氨基酸残基。
图4显示pHE4a表达载体(SEQ ID NO4)的示意性表达。其中指出了卡那霉素抗性标记基因、多克隆位点连接区、oriC序列以及lacIq编码序列的位置。
图5显示pHE4a启动子(SEQ ID NO5)的调节元件的核苷酸序列。两种lac操纵基因序列、Shine-Delgarno序列(S/D)和末端HindIII与NdeI限制酶切位点(斜体)得到了说明。
发明详述本发明公开了分离的核酸分子，该核酸分子包含编码具有SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列的抗微生物肽的多核苷酸，该多核苷酸通过测序克隆的cDNA得到确定。本发明的抗微生物肽与牛气管抗微生物肽(图2)(SEQID NO3)具有序列同源性。SEQ ID NO1所示的核苷酸序列通过测序cDNA克隆(HLJB175)得到，该cDNA克隆于1997年4月14日以保藏号97982保藏在美国典型培养物保藏中心专利保藏处，10801 UniversityBoulevard Manassas，VA 20110-2209。利用SalI/NotI限制性内切核酸酶切割位点将所保藏的克隆插入pCMVSport1中。核酸分子除非额外说明，本文中所有通过测序DNA分子确定的核苷酸序列都是利用自动DNA测序仪(如Applied Biosystem，Inc.的Model 373)确定的，并且本文所确定的由DNA分子编码的多肽的所有氨基酸序列都是通过翻译如上所确定的DNA序列来确定的。因此，正如本领域所熟知的用这种自动化方法确定的DNA序列一样，本文所确定的任何核苷酸序列可能含有一些误差。自动测序所确定的核苷酸序列典型地是与所测序的DNA分子的实际核苷酸序列有至少大约90％同源性，更典型地为至少大约95％至至少大约99.9％同源性。实际序列可由其它方法更精确地确定，这些方法包括本领域所熟知的手工DNA测序方法。正如本领域所知的，与实际序列相比，在确定出的核苷酸序列中的单一插入或者缺失在核苷酸序列的翻译中将造成读框移位，以致自插入或缺失点开始，预测出来的由所确定的核苷酸序列编码的氨基酸序列完全不同于由所测序的DNA分子实际编码的氨基酸序列。
利用本文所公开的信息，如SEQ ID NO1中的核苷酸序列，可以利用标准克隆和筛选过程(如那些利用mRNA作为起始材料来克隆cDNA的方法)获得编码抗微生物肽多肽的本发明核酸分子。对于本发明来说，SEQ IDNO1中所描述的核酸分子发现于得自肺组织的cDNA文库中。所确定的SEQ ID NO1的抗微生物肽cDNA的核苷酸序列包含编码具有大约64个氨基酸残基的蛋白质的开放读框、所预测的具有大约23个氨基酸残基的前导序列和推定的大约7.3kDa的分子量。SEQ ID NO2中所显示的抗微生物肽与牛气管抗微生物肽之间具有44％同源性和大约63％相似性(图2)。
本发明也公开了本发明的抗微生物肽蛋白质的成熟形式。按照信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号或者分泌前导序列，其中一旦不断增长的穿过糙面内质网的蛋白质链的输出开始，该前导序列就自成熟蛋白质上切割下来。大多数哺乳动物细胞甚至昆虫细胞都以相同的特异性切割所分泌的蛋白质。然而，在某些情况下，所分泌的蛋白质的切割并不完全一致，这就产生了蛋白质的两个或多个成熟物种。进一步地说，人们长期以来一直知道，所分泌的蛋白质的切割特异性最终由完全蛋白质的一级结构决定，即它是多肽的氨基酸序列所固有的。因此，本发明提供了编码成熟抗微生物肽多肽的核苷酸序列，该多肽具有由cDNA克隆所编码的氨基酸序列，该cDNA克隆包含在与ATCC保藏号97982相同的宿主中并且如SEQ ID NO2所示。具有由包含在与ATCC保藏号97982相同的宿主中的cDNA克隆编码的氨基酸序列的成熟抗微生物肽意指成熟形式的抗微生物肽，该抗微生物肽由在具有完全开放读框的哺乳动物细胞(如COS细胞，如下所述)中的表达来产生，该完全开放读框由包含在保藏宿主的载体中的克隆的人DNA序列编码。如下所述，具有由包含在ATCC保藏号97982中的cDNA克隆编码的氨基酸序列的成熟抗微生物肽可以也可以不必不同于所预测的SEQ ID NO2(大约1至大约23氨基酸)中所显示的″成熟″抗微生物肽，这取决于基于计算机分析的预测切割位点的准确度。
用于预测蛋白质是否存在用于前导序列的分泌前导区和切割点的方法是可以利用的。例如，可以利用McGeoch(病毒研究，3271-286(1985))和von Heinje(核酸研究，144683-4690(1986))的方法。这些方法之每一个预测已知的哺乳动物分泌蛋白质的切割点的准确度范围为75-80％。von Heinje(同上)。然而，对于给定的蛋白质，这两种方法并非总是产生相同的预测切割点。
在本发明情况下，本发明的完全抗微生物肽多肽的预测的氨基酸序列是由计算机程序(″PSORT″)(K.Nakai和M.Kanehisa，基因组，14897-911(1992))分析的，该程序是一个用于基于氨基酸序列预测蛋白质的细胞位置的专家系统。作为这个定位计算预测的一部分，McGeoch和vonHeinje的方法合并使用。在SEQ ID NO2中，PSORT程序的分析预测切割位点位于氨基酸-1和1之间。此后，采用简单形式的von Heinje(同上)(-1，-3)规则，由目视检测进一步分析完全的氨基酸序列。这样，预测出微生物肽蛋白质的前导序列由SEQ ID NO2中的大约-23至大约-1氨基酸残基组成，而预测出成熟抗微生物肽蛋白质则由SEQ ID NO2中的大约1至大约41位氨基酸残基组成。
正如普通技术人员将会注意到的，由于测序误差的可能性以及在不同的已知蛋白质中的前导序列的切割位点的可变性，所预测的、由保藏的cDNA编码的抗微生物肽多肽包含大约64个氨基酸，但是其范围不论在何地都可能变化于55-75个氨基酸；同时所预测的这一蛋白质的前导序列包含大约23个氨基酸，但在长度上可能是20、21、22、24或25个氨基酸。
正如所表明的，本发明的核酸分子可以是RNA形式的(如mRNA)或者DNA形式的(包括，例如由克隆获得或合成产生的cDNA和基因组DNA)。DNA可以是双链或单链的。单链DNA或RNA可以是编码链(也称为有义链)，或者它可能是非编码链(也称作反义链)。
″分离的″核酸分子意指从其天然环境中移出的核酸分子、DNA或RNA。例如就本发明来说，认为包含在载体中的重组DNA分子就是“分离的”。分离的DNA分子的另外的例子包括以溶液状态保持在异源宿主细胞或(部分或基本上)纯化的DNA分子中的重组DNA分子。分离的RNA分子包括本发明的DNA分子的体内或体外RNA转录物。按照本发明的分离的核酸分子还包括这样合成产生的分子。
本发明的分离的核酸分子包括包含SEQ ID NO1中所显示的开放读框(ORF)的DNA分子；包含成熟抗微生物肽蛋白质的编码序列的DNA分子；和包含与上述明显不同的序列，但由于其遗传密码的简并而仍然编码抗微生物肽蛋白质的DNA分子。当然，遗传密码是本领域所熟知的。因此，对于本领域技术人员来说，进行常规操作就可产生这样的简并变体。
另一方面，本发明提供了编码抗微生物肽多肽的分离的核酸分子，其中该抗微生物肽多肽具有由cDNA克隆(包含在1997年4月4日以ATCC保藏号97982保藏的质粒中)所编码的氨基酸序列。在另一实施方案中，提供了编码成熟抗微生物肽多肽或缺乏N端甲硫氨酸的全长抗微生物肽多肽的核酸分子。本发明也提供了分离的核酸分子(具有SEQ ID NO1中所显示的核苷酸序列)或包含在上述保藏的克隆中的抗微生物肽cDNA的核苷酸序列或者核酸分子(具有上述序列之一的互补序列)。这样的分离分子，尤其是DNA分子，可通过与染色体的原位杂交来用作为基因作图的探针，并且可用来检测人体组织中的抗微生物肽基因的表达，例如利用Northern印迹分析。
本发明还涉及本文描述的分离的核酸分子的片段。分离的核酸分子(具有保藏的cDNA的核苷酸序列或图1(SEQ ID NO1)所显示的核苷酸序列)的片段意指长度为至少大约15nt(优选为至少大约20nt，更优选为至少大约30nt，更为优选为至少40nt)的、可用作为如本文所述的诊断探针和引物的片段。当然，按照本发明，如同与保藏的cDNA的或SEQID NO1中所显示的大多数(如果不是所有)核苷酸序列相对应的片段一样，长度为50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300或323nt的更大片段也是有用的。例如，长度至少为20nt的片段意指包含20或更多个得自保藏cDNA的核苷酸序列或SEQ ID NO1中所显示的核苷酸序列的邻接碱基的片段。
本发明的优选的核酸片段包括编码抗微生物肽蛋白质的携带表位部分的核酸分子。尤其是，本发明的这样的核酸片段包括编码下列物质的核酸分子包含在SEQ ID NO2中的大约19至大约27位氨基酸残基的多肽；和包含在SEQ ID NO2中的大约31至大约41位氨基酸残基的多肽。本发明的发明人已经测定出上述多肽片段是抗微生物肽蛋白质的抗原区。下面将详尽描述用于确定抗微生物肽蛋白质的其它的这样携带表位部分的方法。
另一方面，本发明提供了分离的核酸分子，该核酸分子包含在严格杂交条件下与本发明的上述核酸分子中的部分多核苷酸杂交的多核苷酸，例如，包含在ATCC 97982保藏物中的cDNA克隆。″严格杂交条件″意指在包含下列物质的溶液中在42℃下培养过夜50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH 7.6)，5×Denhardt的溶液，10％葡聚糖硫酸酯和20g/ml变性的、剪切的鲑精DNA；其后在大约65℃下用0.1×SSC洗涤滤器。
与″部分″多核苷酸杂交的多核苷酸意指与至少大约15个核苷酸(nt)(优选为至少大约20nt，更优选为至少大约30nt，更优选为大约30-70nt)的参照多核苷酸杂交的多核苷酸(DNA或RNA)。这些多核苷酸可用作为如上所述并且下面将更详细地加以讨论的诊断探针和引物。
例如，″长度至少20nt″的部分多核苷酸意指20或者更多个得自参照多核苷酸的核苷酸序列(例如保藏的cDNA或SEQ ID NO1所显示的核苷酸序列)的邻接核苷酸。当然，只与聚A序列(如SEQ ID NO1所显示的抗微生物肽cDNA的3′末端聚(A)段)杂交或者只与T(或U)残基的互补序列段杂交的多核苷酸将不包括在用来杂交部分本发明的核酸的本发明多核苷酸中，因为这样的多核苷酸将与任何包含聚(A)段或其互补段的核酸分子杂交(例如，实践上为任何双链cDNA克隆)。
正如所表明的，编码抗微生物肽多肽的本发明核酸分子可以包括但不限于那些自身编码成熟多肽的氨基酸序列的核酸分子；成熟多肽的编码序列和附加序列，如那些编码大约23个氨基酸的前导序列或分泌序列(如前蛋白质或原蛋白质或者前原蛋白质序列)的核酸分子；成熟多肽的、有或无上述附加编码序列的、与附加的非编码序列(包括例如但不限于内含子和非编码5’和3’序列，如在转录(mRNA加工)中起作用的、包含剪接和聚腺苷酸化信号(如mRNA的核糖体结合和稳定性)的、转录的非翻译序列)结合在一起的编码序列；编码附加的氨基酸(如那些提供附加功能的氨基酸)的、附加的编码序列。因此，编码多肽的序列可以与标记序列融合，如编码有利于所融合的多肽的纯化的肽的序列。在本发明的这一方面的一些优选实施方案中，标记氨基酸序列是六组氨酸肽，如在pQE载体(Qiagen公司)中提供的标记，在其它方面，大多数标记氨基酸序列是市售的。例如，如Gentz等(Gentz等，美国国家科学院院报，86821-824(1989))所描述的，六组氨酸便于融合蛋白质的纯化。″HA″标记是在纯化中有用的另一种肽，其与得自流感血凝素蛋白质的表位相对应，这已由Wilson等(Wilson等，细胞37767(1984))描述过。正如以下所讨论的，这样的其它融合蛋白质包括在N或者C端与Fc融合的抗微生物肽。
本发明还涉及本发明的核酸分子的变体，其编码抗微生物肽蛋白质的部分、类似物或衍生物。变体可以天然产生，如天然的等位基因变体。″等位基因变体″意指在有机体的染色体上占据给定基因座的基因的几种可选形式之一。基因II，Lewin，B.编著，John Wiley和Sons，纽约(1985)。可以利用本领域所熟知的诱变技术来产生非天然存在的变体。
这样的变体包括那些由核苷酸取代、缺失或添加产生的变体，所说的取代、缺失或添加可以涉及一个或多个核苷酸。变体可以在编码区、非编码区或两区发生改变。在编码区的改变可以产生保守或非保守的氨基酸取代，缺失或添加。其中特别优选的是沉默取代、添加和缺失，这并不改变抗微生物肽蛋白质或其部分的性质和活性。同时，在这一点上尤其优选的是保守取代。
本发明的实施方案还包括分离的核酸分子，该核酸分子包含具有核苷酸序列的多核苷酸，该核苷酸序列与下列物质有至少95％、96％、97％、98％或99％的同源性(a)编码具有SEQ ID NO2所显示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)编码具有SEQ ID NO2所显示的氨基酸序列但缺乏N端甲硫氨酸的多肽的核苷酸序列；(c)编码具有SEQ ID NO2所显示的大约1至大约41位的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(d)编码具有由cDNA克隆(包含在ATCC保藏号97982中)编码的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(e)编码具有由cDNA克隆(包含在ATCC保藏号97982中)编码的氨基酸序列的成熟抗微生物肽多肽的核苷酸序列；或者(f)与(a)、(b)、(c)、(d)或(e)之任一核苷酸序列互补的核苷酸序列。
例如，具有与编码抗微生物肽的参照核苷酸序列有至少95％″同源性″的核苷酸序列的多核苷酸意指除了多核苷酸序列的每100个编码抗微生物肽多肽的参照核苷酸序列可以包含多达五点突变外，多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相同。换句话说，为了获得具有与参照核苷酸序列有至少95％同源性的核苷酸序列的多核苷酸，参照序列中的多达5％的核苷酸可以缺失或者由另一个核苷酸取代，或者参照序列中的全部核苷酸的多达5％核苷酸可以插入到参照序列中。参照序列的这些突变可以发生在参照核苷酸序列的5’或3’末端位置或者在这两末端位置之间的任一点，或个别地散布在参照序列的核苷酸中间或者散布于参照序列内的一个或多个邻接基团中。
实际上，任何具体核酸分子与例如SEQ ID NO1所显示的核苷酸序列或保藏cDNA克隆的核苷酸序列是否有至少95％、96％、97％、98％或99％同源性通常可以利用诸如Bestfit程序(Wisconsin序列分析包，基于Unix的版本8，遗传学计算机小组，University Research Park，575 ScienceDrive，Madison，WI 53711)之类的已知计算机程序来确定。Bestfit利用Smith和Waterman的局部同源性算法(应用数学进展，2482-489(1981))，找到两种序列之间的同源性最好的节段。当利用Bestfit或任何其它序列对比来确定具体序列与例如按照本发明的参照序列是否有95％同源性时，当然要调整参数以便在参照核苷酸序列的全长上计算同源性的百分比，以及允许在参照序列的核苷酸总数的同源性方面存在高达5％的缺口。
本申请涉及与SEQ ID NO1中所显示的核酸序列或保藏cDNA的核酸序列有至少95％、96％、97％、98％或者99％同源性，而与它们是否编码具有抗微生物肽活性的多肽无关的核酸分子。这是因为即使具体核酸分子不编码有抗微生物肽活性的多肽，本领域技术人员仍然会知道如何将该核酸分子用作为例如杂交探针或聚合酶链反应(PCR)引物。本发明的不编码具有抗微生物肽活性的多肽的核酸分子的用途尤其包括(1)分离出cDNA文库中的抗微生物肽基因或者等位基因变体；(2)正如Verma等(Verma等，人染色体基本技术手册，Pergamon出版社，纽约(1988))所描述的，与提供抗微生物肽基因的精确染色体位置的中期染色体涂布板原位杂交(例如“FISH”)；以及用于检测抗微生物肽mRNA在特定组织中的表达的Northern印迹分析。
然而，优选的是核酸分子具有与SEQ ID NO1所显示的核酸序列或保藏cDNA的核酸序列(事实上其编码具有抗微生物肽蛋白质活性的多肽)有至少95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列。″具有抗微生物肽活性的多肽″意指在具体的生物测定中显示出抗微生物肽活性的多肽。例如，可以利用例如由Diamond等(美国国家科学院院报，883952(1991))描述的抗微生物测定来测定抗微生物肽活性。简言之，将候选抗微生物肽的浓缩试样点滴在大肠杆菌菌苔上并在37℃下培养一夜。利用由Soravia等(FEBS Lett.228337-340(1988))描述的方法的改进测定肽的最小抑制性浓度。简言之，在37℃下在静态96孔微量滴定平板中随着肽浓度的不断增加培养2.5×104细菌一夜。由在600nm的光密度测定来评估细菌生长。用缺少肽的对照培养和缺少细菌的对照培养设定基底值。
当然，由于遗传密码的简并性，本领域普通技术人员将立即认识到具有与保藏cDNA的核酸序列或SEQ ID NO1显示的核酸序列有至少95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列的大量核酸分子将编码″具有抗微生物肽蛋白质活性″的多肽。事实上，由于这些核苷酸序列的所有简并变体都编码相同的多肽，因此技术人员即使没有进行上述比较测定也很清楚这一情况。本领域技术人员将进一步认识到对于不是简并变体的这样的核酸分子，合理数量的它们也将编码具有抗微生物肽蛋白质活性的多肽。这是因为技术人员完全了解氨基酸取代不太可能或不可能显著地影响蛋白质功能(例如以第二种脂肪族氨基酸取代第一种脂肪族氨基酸)。
例如，有关如何进行表型沉默氨基酸取代的指导公开在下列文献中Bowie J.U.等，″译解蛋白质序列中的信息对氨基酸取代的耐受性″，科学2471306-1310(1990)，其中作者指出蛋白质惊人地耐受氨基酸取代。载体和宿主细胞本发明也涉及包括本发明的分离DNA分子的载体、利用重组载体由基因工程构建的宿主细胞以及利用重组技术生产抗微生物肽多肽或者其片段。
多核苷酸可以结合在宿主中包含用于增殖的选择性标记的载体。一般地，将质粒载体引入沉淀(如磷酸钙沉淀)中或充满脂质的复合物中。如果载体是病毒，它可以利用适当的包装细胞系来进行体外包装，然后转导进入宿主细胞。
DNA插入序列应该可操作地连接到适当的启动子(如噬菌体λPL启动子，大肠杆菌lac、trp和tac启动子，SV40早期和晚期启动子和逆转录病毒LTRs的启动子)上，以给一些物质命名。其它的合适启动子将是技术人员所知的。表达构建体还包含转录起始的位点，转录终止的位点和在转录区中的翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录物的编码部分优选包括开始时的翻译起点和适当地位于所要翻译的多肽的末端的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。
正如所表明的，表达载体优选包括至少一个选择性标记。这样的标记包括用于真核细胞培养物中的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，和用于在大肠杆菌和其它细菌中培养的四环素或氨苄青霉素抗性基因。适当宿主的代表性例子包括但不限于细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌属和鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞，如酵母细胞；昆虫细胞，如果蝇属S2和夜蛾属Sf9细胞；动物细胞，如CHO、COS和Bowes黑素瘤细胞；以及植物细胞。上述宿主细胞的合适培养基和条件是本领域所知的。
除在本发明实践中利用表达载体外，本发明还包括包含操纵基因和可操作地与编码感兴趣蛋白质的核苷酸序列连接的启动子元件的新表达载体。这样载体的一个例子是如下详尽描述的pHE4a。
正如图4和5所总结的那样，pHE4a载体(SEQ ID NO4)的组分包括1)作为选择标记的新霉素磷酸转移酶基因，2)大肠杆菌复制起点，3)T5噬菌体启动子序列，4)两种lac操纵基因序列，5)Shine-Delgarno序列，6)乳糖操纵子阻抑基因(lacIq)和7)多克隆位点接头区。复制起点(oriC)得自pUC19(LT1，Gaithersburg，MD)。启动子序列与操纵基因序列是合成制得的。核酸序列的合成产生是本领域所熟知的。CLONTECH 95/96目录，页码215-216，CLONTECH，1020 East Meadow Circle，Palo Alto，CA 94303。pHE4a载体于1998年2月25日以209645保藏号保藏在ATCC中。
通过用NdeI和XbaI、BamHI、XhoI或Asp718之任一限制载体，以及分离凝胶上的较大片段(多克隆位点区是大约310个核苷酸)，可以可操作地使编码抗微生物多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO1)与pHE4a的启动子和操纵基因连接。例如，按照实施例1中描述的PCR方案，利用具有Ndel(作为5’引物)和XbaI、BamHI、XhoI或Asp718(作为3’引物)之任一的限制酶切位点的PCR引物，产生编码抗微生物多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO1)(具有适当的限制酶切位点)。凝胶纯化PCR插入序列，并以相容性酶限制之。按照标准方案连接插入序列和载体。
如上所述，pHE4a载体含有lacIq基因。lacIq是使lac操纵基因紧密调节的lacI基因的等位基因。Amann，E.等，基因，69301-315(1988)；Stark，M.，基因，51255-267(1987)。lacIq基因编码连接lac操纵基因序列和封阻下游(即3’)序列的转录的阻抑蛋白。然而，当存在乳糖或某些乳糖类似物(如异丙基B-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG))时，lacIq基因产物与lac操纵基因解离。因此，在包含pHE4a载体的未诱导的宿主细胞中并不产生可观数量的抗微生物多肽。然而，通过加入如IPTG的药剂对这些宿主细胞的诱导导致抗微生物多肽编码序列的表达。
pHE4a载体的启动子/操纵基因序列(SEQ ID NO5)包含T5噬菌体启动子和两种lac操纵基因序列。一种操纵基因定位于相对于转录开始位点的5’位置，而另一种则定位于相对于同一位点的3’位置。这些操纵基因，当与lacIq基因产物结合起来时，在缺少lac操纵子诱导物(如IPTG)的情况下使下游序列受到紧密阻抑。可以通过加入lac操纵子诱导物，如IPTG，来诱导位于lac操纵基因下游的、可操作地连接的序列的表达。lac诱导物与lacIq蛋白质的连接导致它们从lac操纵基因序列中释放出来和可操作地连接的序列的转录起始。基因表达的lac操纵子调节描述在下列文献中Devlin T.，TEXTBOOK OF BIOCHEMISTRY WITH CLINICALCORRELATIONS，第4版(1997)，页码802-807。
载体的pHE4系列包含除抗微生物多肽编码序列之外的pHE4a载体的所有组分。pHE4a载体的特征包括优化的合成T5噬菌体启动子、lac操纵基因和Shine-Delagarno序列。此外，这些序列也具有理想的间隙，以便插入基因的表达能够得到紧密调节，并可诱导产生高水平的表达。
在适合用于产生本发明的蛋白质的已知细菌启动子中，包括大肠杆菌lacI和lacZ启动子、T3和T7启动子、gpt启动子、λPR和PL启动子以及trp启动子。合适的真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、逆转录病毒LTRs(如那些Rous肉瘤病毒(RSV))的启动子以及金属硫蛋白启动子(如小鼠金属硫蛋白-I启动子)。
pHE4a载体也包含AUG起始密码子5’侧的Shine-Delgarno序列。Shine-Delgarno序列是一般定位于距AUG起始密码子上游(即5’)大约10个核苷酸的短序列。这些序列本质上使原核核糖体定向AUG起始密码子。因此，本发明也涉及有用于本发明的蛋白质的产生的表达载体。本发明的这一方面以pHE4a载体(SEQ ID NO4)示例说明。
在优选用于细菌的载体中，包括得自Qiagen的pQE70、pQE60和pQE-9；得自Stratagene的pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A；和得自Pharmacia的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。在优选的真核载体中，包括得自Stratagene的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；和得自Pharmacia的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。其它合适载体是技术人员熟知的。
可以由磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔法、转导、感染或其它方法，实现构建体向宿主细胞的引入。这样的方法描述在许多标准实验室手册中，如Davis等，分子生物学基本方法(1986)。
可以以修饰形式(如融合蛋白质)表达多肽，并且多肽不仅可以包括分泌信号，而且也可以包括附加的异源功能区。例如，附加氨基酸的区，尤其是带电荷的氨基酸，可以加入至多肽的N-端以改善宿主细胞在纯化期间或尔后的处理和存储期间的稳定性和持续性。此外，肽组分可以加入至多肽中以有利于纯化。在多肽的最后制备之前可以除去这样的区。与其它方面一样，在多肽中加入肽组分以引起分泌或排泄、改善稳定性和有利于纯化都是本领域熟知的和常用的技术。优选的融合蛋白质包含得自有用于溶解蛋白质的免疫球蛋白的异源区。例如，EP-A-0 464 533(加拿大对应号2045869)公开了包含与另一人体蛋白质或其部分结合在一起的免疫球蛋白分子的恒定区的各部分的融合蛋白质。在许多情况下，融合蛋白质的Fc部分在治疗和诊断应用方面是十分有利的，并因此产生例如改善的药物动力学性质(EP-A 0232262)。另一方面，就某些用途来说，需要在融合蛋白质以描述的有利方式表达、检测和纯化之后能够缺失Fc部分。当证明Fc部分成为治疗和诊断应用的障碍时，例如当融合蛋白质将要用作为免疫的抗原时情况就是这样。在药物开发中，例如人蛋白质(如hIL5-受体)已与Fc部分融合，目的是进行高流通量筛选测定以鉴定hIL-5的拮抗剂。参见，D.Bennett等，分子识别杂志，8卷52-58(1995)和K.Johanson等，生物化学杂志，270卷，16期9459-9471(1995)。
可以由熟知的方法(包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽提、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析)，从重组细胞培养物中回收和纯化抗微生物肽。最优选的是，利用高效液相层析(“HPLC”)进行纯化。本发明的多肽包括天然纯化的产物、化学合成过程的产品以及由重组技术从原核或真核宿主(包括，例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生的产物。取决于重组生产方法中所使用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的或者可以是非糖基化的。此外，本发明的多肽也可以包括初始修饰的甲硫氨酸残基，这在某些情况下是宿主介导过程的结果。人抗微生物多肽和片段本发明还提供了分离的抗微生物肽(具有由保藏cDNA编码的氨基酸序列或SEQ ID NO2的氨基酸序列)或包含部分上述多肽的肽或多肽。
本领域有关人员将认识到抗微生物肽的一些氨基酸序列可以变化而不严重影响蛋白质的结构或功能。如果考虑这样的序列差异，就应该记住在蛋白质上具有决定活性的关键性区域。
因此，本发明还包括抗微生物肽的变体，这些变体显示出明显的抗微生物肽活性或包括抗微生物肽的区(如以下讨论的蛋白质部分)。这样的突变体包括缺失、插入、倒位、重复和模式取代。正如以上所表明的，有关氨基酸变化很有可能是表型沉默的解释出现在如下文献中Bowie J.U.等，″译解蛋白质序列中的信息对氨基酸取代的耐受性″，科学，2471306-1310(1990)。
因此，SEQ ID NO2的或由保藏的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物可以是(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选为保守氨基酸残基)所取代并且这样取代的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的氨基酸残基的上述片段、衍生物或类似物，或者(ii)其中一个或多个氨基酸残基包括取代基团的上述片段、衍生物或类似物，或者(iii)其中成熟多肽与另一化合物融合，该另一化合物如增加多肽的半寿期的化合物(例如聚乙二醇)的上述片段、衍生物或类似物，或者(iv)其中附加的氨基酸与成熟多肽融合，该成熟多肽如IgG Fc融合区肽或前导或分泌序列或用来纯化成熟多肽的序列或原蛋白序列的上述片段、衍生物或类似物。据认为这样的片段、衍生物和类似物属于本文涉及的领域的技术人员所知的范围之内。
尤其感兴趣的是由另一带电荷氨基酸和中性或带负电荷氨基酸取代带电荷氨基酸。后者随着阳性电荷减少而产生蛋白质以改善抗微生物肽的特征。聚集作用的预防是十分需要的。蛋白质的聚集作用不仅导致活性的丧失，而且也可能在制备药物制剂时出现问题，因为它们可能是免疫原性的。(Pinckard等，临床免疫试验，2331-340(1967)；Robbins等，糖尿病，36838-845(1987)；Cleland等，治疗性药物载体系统的评论性综述10307-377(1993))。
正如所表明的，变化优选的是具有次要性质，如并不严重影响蛋白质的折叠或活性的保守氨基酸取代(参见表1)。表1.保守氨基酸取代
当然，技术人员所做出的氨基酸取代的数目取决于许多因素，包括以上描述的那些因素。一般地说，对于任一给定的抗微生物多肽，氨基酸取代的数目将不超过50、40、30、20、10、5或3。
在本发明抗微生物肽中的、具有十分重要功能的氨基酸可以用本领域所知方法来鉴定，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变方法(Cunningham和Wells，科学，2441081-1085(1989))。后一种方法在分子的每个残基上引入单一丙氨酸突变。然后检验所产生的突变分子的生物活性，如受体结合或者体外或体内增殖活性。对于配体-受体结合关键性的位点也可以通过结构分析来确定，这些结构分析如结晶作用、核磁共振或光亲和标记(Smith等，分子生物学杂志，224899-904(1992)和de Vos等，科学，255306-312(1992))。
本发明的多肽优选以分离的形式提供。″分离的多肽″意指从其天然环境中移出的多肽。因此，就本发明的目的来说，一般认为产生和/或包含在重组宿主细胞之内的多肽是分离的。″分离的多肽″也意指从重组宿主细胞中部分或基本上纯化出来的多肽。例如，可以由Smith和Johnson(基因，6731-40(1988))描述的一步法基本上纯化得到重组产生的抗微生物肽多肽模型。
本发明的多肽包括由包含前导序列的保藏的cDNA编码的多肽，由没有前导序列的保藏的cDNA编码的成熟多肽(即成熟蛋白质)，包含SEQ IDNO2中的大约-23至大约41位氨基酸的多肽；包含SEQ ID NO2中的大约-22至大约41位氨基酸的多肽；包含SEQ ID NO2中的大约1至大约41位氨基酸的多肽；和与上述的那些多肽有至少95％(优选为至少96％、97％、98％或99％)同源性的、并且也包括具有至少30个氨基酸(优选为至少50个氨基酸)的这样多肽的部分的多肽。
具有与抗微生物肽的参照氨基酸序列有例如至少95％″同源性″的氨基酸序列的多肽意指除多肽序列的每100个抗微生物肽的参照氨基酸可以包括多达5个氨基酸的改变之外多肽的氨基酸序列与参照序列相同。换句话说，为了获得具有与参照氨基酸序列有至少95％同源性的氨基酸序列的多肽，参照序列中多达5％的氨基酸残基可以缺失或由另一氨基酸取代，或者在参照序列的全部氨基酸残基中，多达5％的氨基酸残基可以插入到参照序列中。参照序列的这些改变可以发生在参照氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或者这些末端位置之间的任一点，个别地散布在参照序列的残基中间或者散布在参照序列内部的一个或多个邻接基团中。
实际上，任一具体多肽是否与例如SEQ ID NO2中显示的氨基酸序列或由保藏的cDNA克隆编码的氨基酸序列有至少95％、96％、97％、98％或99％同源性通常可以利用诸如Bestfit程序(Wisconsin序列分析包，基于Unix的版本8，遗传学计算机小组，University Research Park，575Science Drive，Madison，WI 53711)之类的已知计算机程序来确定。当利用Bestfit或任何其它序列对比程序来确定具体序列与按照本发明的参照序列是否有例如95％同源性时，当然要调整参数以便在参照氨基酸序列的全长上计算同源性的百分比，以及允许在参照序列的氨基酸残基总数的同源性方面存在多达5％的缺口。
在利用本领域技术人员熟知方法的SDS-PAGE凝胶或者分子筛凝胶过滤柱上，本发明的多肽可以用作为分子量标记。
另一方面，本发明提供了包含本发明多肽的携带表位部分的肽或多肽。这一多肽部分的表位是本文描述的多肽的免疫原性或抗原表位。″免疫原性表位″定义为蛋白质的一部分，当整个蛋白质是免疫原时，其引起抗体应答。另一方面，抗体可以与之结合的蛋白质分子的区定义为″抗原表位″。蛋白质的免疫原性表位的数量一般比抗原表位的数量少。参见，例如，Geysen等，美国国家科学院院报，813998-4002(1983)。
至于携带抗原表位(即包含抗体可以与之结合的蛋白质分子的区)的肽或多肽的选择，本领域技术人员熟知模拟蛋白质序列的一部分的比较短的合成肽通常能够产生与部分模拟蛋白质反应的抗血清。参见，例如，Sutcliffe，J.G.，Shinnick，T.M.，Green，N.和Learner，R.A.(1983)，与蛋白质上的预定位点反应的抗体。科学，219660-666。能够产生蛋白质反应性血清的肽通常在蛋白质的一级序列中阐述，其可以由一套简单的化学规则表征，并且既不限于完整蛋白质的优势免疫区(即免疫原性表位)也不限于氨基或羧基末端。
因此本发明的携带抗原表位的肽和多肽有用于产生特异性结合本发明多肽的抗体(包括单克隆抗体)。参见，例如，Wilson等，细胞，37767-778(1984)，777页。
本发明的携带抗原表位的肽和多肽优选包含具有至少七个(优选为至少九个，最优选为至少大约15至大约30个)氨基酸(包含在本发明的多肽的氨基酸序列之内)的序列。
可以用来产生抗微生物肽特异性抗体的抗原多肽或肽的非限定性例子包括包含SEQ ID NO2中的大约19至大约27位氨基酸残基的多肽；和包含SEQ ID NO2中的大约31至大约41位氨基酸残基的多肽。正如以上所表明的，本发明的发明人已测定出上述多肽片段是抗微生物肽蛋白质的抗原区。
本发明的携带表位的肽和多肽可以由任一常规方法产生。Houghten，R.A.(1985)，用于大量肽的迅速固相合成的一般方法个体氨基酸水平的抗原-抗体相互作用的特异性，美国国家科学院院报，825131-5135。″同时的多个肽合成(SMPS)″方法还描述在授予Houghten等的美国专利号4,631,211(1986)中。
正如本领域技术人员所注意到的，本发明的上述抗微生物肽多肽和其携带表位的片段可以与免疫球蛋白(IgG)的部分恒定区结合，结果产生嵌合多肽。这些融合蛋白质有利于纯化，并且显示出增加的体内半寿期。例如，对于由人CD4-多肽的前两个结构域和哺乳动物免疫球蛋白的重或轻链的恒定区的各个结构域组成的嵌合蛋白质来说已经表明了这一点(EPA 394,827；Traunecker等，自然，33184-86(1988))。由于IgG部分而具有二硫化物连接的二聚体结构的融合蛋白质也可以比单独的单体抗微生物肽蛋白质或蛋白质片段更有效地结合和中和其它分子(Fountoulakis等，生物化学杂志，270，3958-3964(1995))。诊断本发明的发明人发现本发明的抗微生物肽在肺淋巴结和角膜组织中得到表达。据认为对于一些与免疫系统有关的疾病来说，相对于″标准的″抗微生物肽基因表达水平(即在得自不具有免疫系统紊乱的个体的免疫系统组织或体液中的抗微生物肽表达水平)，可以在免疫系统组织或其它细胞或体液(如血清、血浆、尿、滑液或脊髓液)(得自具有这样的疾病的个体)中检测到显著改变(增加或减少)的水平的抗微生物肽基因表达。因此，本发明提供了在免疫系统紊乱的诊断期间有用的诊断方法，这包括在免疫系统组织或其它细胞或体液(得自个体)中测量编码抗微生物肽蛋白质的基因的表达水平，并将测得的基因表达水平与标准的抗微生物肽基因表达水平相比较，其中基因表达水平与标准相比所呈现出的增加或者减少是免疫系统紊乱的指示。
尤其是，据认为当与对应的″标准的″水平比较时，在患有肺淋巴结或角膜癌的哺乳动物中的一些组织表达明显提高或降低水平的抗微生物肽蛋白质和编码抗微生物肽蛋白质的mRNA。此外，据认为当与得自未患有癌症的相同物种的哺乳动物的血清相比时，在得自患有这样的癌症的哺乳动物的一些体液(如血清、血浆、尿和脊髓液)中可以检测到提高水平的抗微生物肽蛋白质。
因此，本发明提供了在免疫系统紊乱(包括这一系统的癌症)的诊断期间有用的诊断方法，该方法包括在得自个体的免疫系统组织或其它细胞或体液中测量编码抗微生物肽蛋白质的基因的表达水平，并把测得的基因表达水平与标准的抗微生物肽基因表达水平相比较，其中基因表达水平与标准相比所呈现出的增加或减少是免疫系统紊乱的指示。
当已经按照常规方法诊断出免疫系统紊乱时，本发明可用作为预后指示物，其中显示出降低的抗微生物肽基因表达的患者与在邻近标准的水平上表达基因的患者相比将经历更坏的临床结果。
″测定编码抗微生物肽的基因的表达水平″意指在第一种生物样品中直接(例如通过确定或估计绝对的蛋白质水平或mRNA水平)或相对(例如通过与第二种生物样品中的抗微生物肽水平或mRNA水平比较)定性或定量测定或估计抗微生物肽水平或编码抗微生物肽的mRNA水平。优选地，在第一种生物样品中的抗微生物肽蛋白质水平或者mRNA水平得到测量或估计以及与标准的抗微生物肽蛋白质水平或者mRNA水平相比较，标准得自第二种生物样品(得自未患有疾病的个体)或者通过平均得自未患有免疫系统紊乱的个体的人群的表达水平来确定。正如本领域技术人员所注意到的，一旦标准的抗微生物肽水平或者mRNA水平已知，那么就可以重复地使用它作为标准来进行比较。
″生物样品″意指得自包含抗微生物肽蛋白质或者mRNA的个体、体液、细胞系、组织培养物或其它源的任一生物样品。正如所表明的，生物样品包括体液(如血清、血浆、尿、滑液和脊髓液)(含有自由抗微生物肽)、免疫系统组织和发现表达完全或成熟抗微生物肽或抗微生物肽受体的其它组织源。用于从哺乳动物中获得组织活检物和体液的方法是本领域所熟知的。当生物样品欲包括mRNA时，组织活检物是优选的源。
本发明有用于诊断或治疗哺乳动物(优选为人类)的各种与免疫系统有关的疾病。这样的疾病包含炎性和传染性病症以及任何免疫细胞功能失调。
可以利用任何合适的技术，如Chomczynski和Sacchi(生物化学分析，162156-159(1987))描述的单步硫氰酸胍-酚-三氯甲烷方法，从生物样品中分离总的细胞RNA。然后利用任何合适的方法测定编码抗微生物肽的mRNA的水平。这些方法包括Northern印迹分析、S1核酸酶作图、聚合酶链反应(PCR)、与聚合酶链反应结合的逆转录(RT-PCR)以及与连接酶链反应结合的逆转录(RT-LCR)。
可以利用基于抗体的技术测定生物样品中的抗微生物肽水平。例如，可以由经典免疫组织学方法(Jalkanen，M.等，细胞生物学杂志，101976-985(1985)；Jalkanen，M.等，细胞生物学杂志，1053087-3096(1987))研究抗微生物肽在组织中的表达。用来检测抗微生物肽基因表达的其它基于抗体的方法包括免疫测定，如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。合适的抗体测定标记是本领域所知的，并且包括酶标记(如葡萄糖氧化酶)和放射性同位素(如碘(125I，121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(112In)和锝(99mTc))以及荧光标记(如荧光素和罗丹明以及生物素)。
除测定得自个体的生物样品中的抗微生物肽水平之外，也可以通过成像来体内检测抗微生物肽。抗微生物肽的体内成像的抗体标记物或标记包括那些可由X射线照相、NMR或ESR检测的抗体标记物或标记。对于X射线照相，合适的标记包括放射可检测的辐射但不对患者构成明显危害的放射性同位素，如钡或铯。NMR和ESR的合适标记包括那些可以通过标记有关杂交瘤的营养物来掺入抗体的、具有可检测的特征自旋的标记，如氘。
将已经用适当的可检测成像组分(如放射性同位素(如131I、112In、99mTc)、放射性不透明物质或核磁共振可检测的材料)标记的抗微生物肽特异性抗体或抗体片段(例如肠胃外、皮下或腹膜内)引入哺乳动物以检查其免疫系统紊乱。本领域技术人员将明白受检对象的大小和所利用的成像系统将确定需要产生诊断图象的成像组分的量。在放射性同位素组分的情况下，对于人作为受检对象来说，注入的放射性的量通常变化于大约5至20毫居里99mTc之间。然后，标记的抗体或抗体片段将优先积聚在包含抗微生物肽的细胞位置上。体内肿瘤成像描述在下列文献中S.W.Burchiel等，″放射性标记的抗体及其片段的免疫药物动力学″(肿瘤成像的第13章癌的放射性化学检测，S.W.，Burchiel和B.A.Rhodes编著，Masson出版公司，(1982))。治疗剂本发明的抗微生物肽可以用作为治疗真菌或细菌感染的抗微生物剂。本发明的肽可以以痤疮治疗药、烧伤治疗药、眼睛感染治疗药、漱口药、除臭剂或局部杀真菌剂的局部或系统制剂来用于这样的治疗中。此外，利用基于β-防卫素的治疗药物或与现有药物结合的药物，可以在有关个体中更有效地控制对几种β-防卫素极端敏感的白假丝酵母(艾滋病患者的粘膜皮肤真菌疾病的常见致因)。施用方式人们将注意到可以通过施用抗微生物肽来治疗个体中的抗微生物肽活性的标准或者正常水平的下降所造成的病症。因此，本发明还提供了治疗需要增加抗微生物肽活性水平的个体的方法，该方法包括向这样的个体施用包含有效量的本发明分离的抗微生物肽，尤其是成熟形式的抗微生物肽的药物组合物，以有效地提高这样的个体中的抗微生物肽活性水平。
一般建议，每剂量肠胃外施用的总的药学上有效量的抗微生物肽变化于每kg患者体重大约1μg/天至10mg/天之间，虽然如此，但正如以上所述的，这将易受治疗判断力的影响。更优选地，这一剂量是至少0.01mg/kg/天，对人来说，最优选为大约0.01和1mg/kg/天之间的激素。如果持续施用，抗微生物肽的典型施用剂量比率为大约1μg/kg/小时至大约50μg/kg/小时，每天1-4次注射或连续的皮下注射(例如利用小型泵)。也可以使用静脉内袋溶液。
包含本发明抗微生物肽的药物组合物可以经口、直肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹膜内、局部(以粉末、软膏、滴液或透皮膜片)、颊施用或者作为口或鼻喷剂施用。″药学上可接受的载体″意指无毒固体、半固体或液体填充物、稀释剂、包膜材料或任何类型的成型辅剂。本文所使用的术语″肠胃外″意指包含静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注的施用方式。染色体测定本发明的核酸分子对于染色体鉴定来说也是有价值的。序列特异性定向于和能够杂交个体人染色体上的具体位置。DNAs对按照本发明的染色体的作图是使这些序列和与疾病有关的基因关联的重要的第一步骤。
在一些基于这一考虑的优选实施方案中，这里公开的cDNA用来克隆抗微生物肽基因的基因组DNA。利用各种熟知的技术和文库(一般都有市售的)可以实现这一步。然后，利用这一方面的熟知技术将基因组DNA用于原位染色体作图。
此外，在某些情况下，通过制备得自cDNA的PCR引物(优选为15-25bp)，序列可以作图到染色体上。基因的3’非翻译区的计算机分析用来迅速选择在基因组DNA中不跨越超过一个外显子的引物，因此使扩增过程变得复杂。然后这些引物用于包含个体人类染色体的体细胞杂交体的PCR筛选。
指向中期染色体涂布的cDNA克隆的荧光原位杂交(″FISH″)可以用来在一个步骤中提供精确的染色体位置。这一技术可以与由得自短达50或者60bp的cDNA的探针一起使用。对于这一技术的综述，参见，Verma等，人染色体基本技术手册，Pergamon出版社，纽约(1988)。
一旦序列作图到精确的染色体位置上，序列在染色体上的物理位置可以与遗传学图谱的数据关联。可以在有关文献中找到这样的数据，例如V.McKusick，人的孟德尔遗传，可通过约翰霍普金斯大学，Welch医学图书馆联机获得。然后，已经作图在相同染色体区的基因和疾病之间的关系可以通过连锁分析(物理上邻近的基因的共遗传)来确定。
其次，需要确定受影响和未受影响的个体之间的cDNA或基因组序列的差别。如果在一些或所有受影响的个体中观察到突变而在任何正常个体中没有观测到突变，那么突变很有可能是疾病的病原体。
已经一般地描述了本发明，但是通过参照下列实施例将更容易理解本发明，所提供的这些实施例目的是说明而不有意限制本发明。
实施例实施例1抗微生物肽在大肠杆菌中的表达和纯化在这一例子中细菌表达载体pQE60用于细菌表达。(QIAGEN公司，Eton大街9259号，Chatsworth，CA，91311)。pQE60编码氨苄青霉素抗生素抗性(″Amp″)并包含细菌的复制起点(″ori″)、IPTG诱导型启动子、核糖体结合位点(″RBS″)、六个编码组氨酸残基的密码子(其可以用QIAGEN公司(同上)出售的镍-次氮基-三乙酸(″Ni-NTA″)亲和性树脂进行亲和性纯化)和合适的单限制酶切位点。这些元件安排为以便编码多肽的插入的DNA片段可以表达具有六个与多肽的羧基末端共价连接的组氨酸残基(即″6X组氨酸标记″)的多肽。
编码缺乏疏水前导序列的人类抗微生物肽的所需部分的DNA序列利用PCR寡核苷酸引物由保藏的cDNA克隆扩增，其中寡核苷酸引物退火至人类抗微生物肽的所需部分的氨基末端序列和保藏的构建体3’至cDNA编码序列的序列。将包含有利于在pQE60载体中克隆的限制酶切位点的附加核苷酸分别加至5’和3’序列上。
对于克隆成熟蛋白质来说，5’引物具有包含带下划线的后跟20个核苷酸(互补于图1中的成熟人类抗微生物肽序列的氨基末端编码序列)的NcoI限制酶切位点的序列5’GACTCCATGGGTGTTTTTGGTGGTATAGGC3’(SEQ IDNO6)。当然，本领域普通技术人员将注意到在蛋白质编码序列中的5’引物开始的位点可以变化，从而扩增编码比成熟形式短或长的完全蛋白质的任何所需部分的DNA节段。3’引物具有包含带下划线的后跟20个核苷酸(互补于在图1的人类抗微生物肽DNA序列中的、恰好在终止密码子之前的编码序列的3’末端)的BglII限制酶切位点的序列5’GACTAGATCTTGGCTTTTTGCAGCATTTTG3’(SEQ ID NO7)，其中排列编码序列与限制酶切位点以便保持其具有含有六个组氨酸密码子(在pQE60载体中)的序列的读框。
用NcoI和BglII消化所扩增的人类抗微生物肽DNA片段和载体pQE60，然后将所消化的DNAs连接在一起。插入人类抗微生物肽DNA至受限制的pQE60载体中使人类抗微生物肽蛋白质编码区位于IPTG诱导性启动子的下游并且符合具有起始AUG和六个组氨酸密码子的读框。
利用如那些由Sambrook等(分子克隆实验室手册，第二版；冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY(1989))描述的标准方法，将连接混合物转化到感受态大肠杆菌细胞中。将包含多拷贝的质粒pREP4，表达lac阻抑物并授予卡那霉素抗性(″Kanr″)的大肠杆菌菌株M15/rep4用于实施这里描述的说明性例子。这一菌株(其仅仅是许多适于表达人类抗微生物肽的菌株之一)是由QIAGEN公司(同上)市售的。按照它们在存在氨苄青霉素和卡那霉素时在LB平板上的生长能力来识别转化体。将质粒DNA从抗性菌落中分离，由限制酶切分析、PCR和DNA测序测定克隆的DNA的等同性。
使包含所需构建体的克隆在液态培养物中在补加有氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)的LB培养基上生长过夜(″O/N″)。O/N培养物用来接种大型培养物，其稀释比例为大约1∶25至1∶250。使细胞在0.4和0.6的600nm光密度(″OD600″)下生长。然后加入异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷(“IPTG”)至1mM的终浓度，以便通过灭活lacI阻抑物来诱导lac阻抑敏感启动子的转录。其后进一步培养细胞3-4小时。然后由离心收获细胞。
然后在4℃下在6M胍-HCl(pH8)中搅拌细胞3-4小时。由离心除去细胞碎片，并将包含人类抗微生物肽的上清液装载到镍-次氮基-三乙酸(″Ni-NTA″)亲和性树脂柱(得自QIAGEN公司，同上)上。具有6X组氨酸标记的蛋白质与具有高亲和性的NI-NTA树脂结合，并可以使用简单的一步方法(详见QIAexpressionist，1995，QIAGEN公司，同上)纯化该蛋白质。简要地说，将上清液装载到在6M胍-HCl(pH8)中的柱上，首先以10体积6M胍-HCl(pH8)洗涤该柱，然后用10体积6M胍-HCl(pH6)洗涤柱，最后用6M胍-HCl(pH5)洗脱人类抗微生物肽。
然后通过在磷酸盐-缓冲盐水(PBS)或50mM乙酸钠缓冲液(pH 6)加上200mM NaCl中透析，使纯化的蛋白质复性。此外，当蛋白质固定在Ni-NTA柱上时，可以成功地重折叠该蛋白质。推荐的条件如下复性时利用线性6M-1M尿素梯度，该尿素溶于500mM NaCl、20％甘油、20mMTris/HCl pH7.4中，其中包含蛋白酶抑制剂。完成复性应该历时1.5小时或更长时间。在复性之后，可以通过加入250mM咪唑来洗脱蛋白质。由在PBS或50mM乙酸钠(pH6)缓冲液加上200mM NaCl中的最后透析步骤来除去咪唑。将纯化的蛋白质存储在4℃下或冻结在-80℃下。实施例1(b)抗微生物肽在大肠杆菌中的表达和纯化在这一实施例中细菌表达载体pQE60用于细菌表达。(QIAGEN公司，Eton大街9259号，Chatsworth，CA，91311)。pQE60编码氨苄青霉素抗生素抗性(″Amp″)和包含细菌的复制起点(″ori″)、IPTG诱导型启动子、核糖体结合位点(″RBS″)、利用QIAGEN公司(同上)出售的镍-次氮基-三乙酸(″Ni-NTA″)亲和性树脂使之得以亲和性纯化的六个编码组氨酸残基的密码子和合适的单限制酶切位点。这些元件安排为以便编码多肽的DNA片段可以以一定方式插入，其中该方式能够产生具有六个与多肽的羧基末端共价连接的组氨酸残基(即“6X组氨酸标记”)的多肽。然而，在这个实施例中，插入多肽编码序列以便六个组氨酸密码子的翻译受到阻止，并因此而产生了不具有6X组氨酸标记的多肽。
编码缺乏疏水前导序列的成熟人类抗微生物肽的所需部分的DNA序列利用PCR寡核苷酸引物由保藏的cDNA克隆扩增，其中PCR寡核苷酸引物退火至人类抗微生物肽的所需部分的氨基末端序列和保藏的构建体3’至cDNA编码序列的序列。将包含有利于在pQE60载体中克隆的限制酶切位点的附加核苷酸分别加至5’和3’序列上。
对于克隆成熟蛋白质来说，5’引物具有包含带下划线的后跟20个核苷酸(互补于图1中的成熟人类抗微生物肽序列的氨基末端编码序列)的NcoI限制酶切位点的序列5’GACTCCATGGGTGTTTTTGGTGGTATAGGC3’(SEQ IDNO6)。当然，本领域普通技术人员将注意到在蛋白质编码序列中的5’引物开始的位点可以变化，从而扩增比成熟形式短或长的完全蛋白质的所需部分。3’引物具有包含带下划线的后跟终止密码子和20个核苷酸(互补于在图1的人类抗微生物肽DNA序列中的编码序列的3’末端)的BglII限制酶切位点的序列5’GACTAGATCTTCATGGCTTTTTGCAGCATTTTG3’(SEQ IDNO8)。
用NcoI和BglII消化所扩增的人类抗微生物肽DNA片段和载体pQE60，然后将所消化的DNAs连接在一起。插入人类抗微生物肽DNA至受限制的pQE60载体中使人类抗微生物肽蛋白质编码区位于IPTG诱导性启动子的下游并且符合具有起始AUG的读框。相关终止密码子阻止插入点下游的六个组氨酸密码子的翻译。
利用如那些由Sambrook等(分子克隆实验室手册，第二版；冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY(1989))描述的标准方法，将连接混合物转化到感受态大肠杆菌细胞中。将包含多拷贝的质粒pREP4，表达lac阻抑物并授予卡那霉素抗性(″Kanr″)的大肠杆菌菌株M15/rep4用于实施这里描述的说明性例子。这一菌株(其仅仅是许多适于表达人类抗微生物肽的菌株之一)是由QIAGEN公司(同上)市售的。按照它们在存在氨苄青霉素和卡那霉素时在LB平板上的生长能力来识别转化体。将质粒DNA从抗性菌落中分离，由限制酶切分析、PCR和DNA测序测定克隆的DNA的等同性。
使包含所需构建体的克隆在液态培养物中在补加有氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)的LB培养基上生长过夜(″O/N″)。O/N培养物用来接种大型培养物，其稀释比例为大约1∶25至1∶250。使细胞在0.4和0.6的600nm光密度(″OD600″)下生长。然后加入异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷(“IPTG”)至1mM的终浓度，以便通过灭活lacI阻抑物来诱导lac阻抑敏感启动子的转录。其后进一步培养细胞3-4小时。然后由离心收获细胞。
然后在4℃下在6M胍-HCl(pH8)中搅拌细胞3-4小时。由离心除去细胞碎片，并使包含人类抗微生物肽的上清液在补加有200mM NaCl的50mM乙酸钠缓冲液(pH 6)中透析。此外，通过使之在500mM NaCl、20％甘油、20mM Tris/HCl pH7.4(包含蛋白酶抑制剂)中透析，可以成功地重折叠该蛋白质。在复性之后，可以用离子交换、疏水相互作用和大小排阻层析纯化蛋白质。此外，如抗体柱的亲和层析步骤可以用来获得纯的人类抗微生物肽。将纯化的蛋白质存储在4℃下或冻结在-80℃下。实施例2抗微生物肽在杆状病毒表达系统中的克隆和表达在这一说明性实施例中，质粒穿梭载体pA2用来将编码完全蛋白质的克隆的DNA(包含其天然相关的分泌信号(前导)序列)插入至表达成熟人类抗微生物肽的杆状病毒中，其中所利用的方法是Summers等(用于杆状病毒载体和昆虫细胞培养过程的方法的手册，得克萨斯农业实验站通讯，1555期(1987))描述的标准方法。这一表达载体包含苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)的强多角体蛋白启动子，该启动子后跟诸如BamHI和Asp718之类的便利的限制酶切位点。猴病毒40(″SV40″)的聚腺苷酸化位点用于有效的聚腺苷酸化。为了易于选择重组病毒，质粒包含得自在弱果蝇属启动子控制下的具有相同取向的大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因，其后跟多角体蛋白基因的聚腺苷酸化信号。使所插入的基因位于用于以细胞介导的与野生型病毒DNA的同源重组的病毒序列的两侧，以产生表达克隆的多核苷酸的活病毒。
正如本领域技术人员所易于认识到的，只要构建体为转录、翻译、分泌等等提供适当定位的信号(包含所需的信号肽和符合读框的AUG)，就可以利用许多其它杆状病毒载体(如pAc373、pVL941和pAcIM1)来替代上述载体。这样的载体描述在例如Luckow等，病毒学，17031-39中。
利用与基因的5’和3’序列相对应的PCR寡核苷酸引物，扩增编码保藏克隆中的全长人类抗微生物肽蛋白质的cDNA序列，包括AUG起始密码子和图1中所显示的天然相关的前导序列(SEQ ID NO2))。5’引物具有包含带下划线的BamHI限制酶位点的序列5’GACTGGATCCGCCATCATGAGGGTCTTGTATCTCC3’(SEQ ID NO9)(一种使真核细胞中的翻译起始的有效信号，其由Kozak，M.，分子生物学杂志，196947-950(1987)描述)，其后跟着图1所示的完全人类抗微生物肽的序列(开始于AUG起始密码子)的19个碱基。3’引物具有包含带下划线的Asp718限制酶切位点(其后为20个互补于图1中的3’非编码序列的核苷酸)的序列5’GACTGGTACCGATGTCGCACGTCTCTGATG3’(SEQ ID NO10)。
利用市售试剂盒(″Geneclean″BIO 101公司，La Jolla，Ca.)从1％琼脂糖凝胶中分离所扩增的片段。然后以Bam HI和Asp718消化片段，并再一次在1％琼脂糖凝胶上纯化之。这一片段在这里被指定为″F1″。
以限制酶Bam HI和Asp718消化质粒，同时可以选择性地由本领域所知的常规方法利用小牛小肠磷酸酶对质粒进行去磷酸化。然后利用市售试剂盒(″Geneclean″BIO 101公司，La Jolla，Ca.)从1％琼脂糖凝胶中分离DNA。这一载体DNA在这里被指定为″V1″。
使片段F1和去磷酸化的质粒V1与T4 DNA连接酶连接。用连接混合物转化大肠杆菌HB101或其它合适的大肠杆菌宿主(如XL-1Blue(Stratagene克隆系统，La Jolla，CA))细胞，并将其涂布在培养平板上。利用PCR方法鉴定包含具有人类抗微生物肽基因的质粒的细菌，其中，引物之一用来扩增基因，第二引物得自载体，使得只有那些包含人类抗微生物肽基因片段的细菌菌落才会显示出DNA的扩增。通过DNA测序确认克隆的片段的序列。这一质粒在这里被指定为pBac抗微生物肽。
利用由Felgner等(美国国家科学院院报，847413-7417(1987))描述的脂转染方法，用1.0μg市售的线性化杆状病毒DNA(“BacuioGoldTM杆状病毒DNA”，Pharmingen，San Diego，CA.)共转染5μg质粒pBac抗微生物肽。在包含50μl无血清的Grace培养基(生命技术公司，Gaithersburg，MD)的微量滴定板的无菌孔中，混合1μg BaculoGoldTM病毒DNA和5μg质粒pBac抗微生物肽。其后，加入10μl Lipofectin和90μl Grace培养基，混合之并在室温下将其培养15分钟。然后，将转染混合物滴加至接种在35mm组织培养平板(具有1ml Grace培养基而无血清)中的Sf9昆虫细胞(ATCC CRL 171)中。来回往复地摇动平板以混合新加入的溶液。然后在27℃下培养平板5小时。在5小时之后，从平板上除去转染溶液，并加入1ml补加有10％胎牛血清的Grace昆虫培养基。将平板放回培养箱，并在27℃下继续培养四天。
在四天之后，收集上清液，并按照如Summers和Smith(同上)所描述的方法进行噬斑测定。具有″Blue Gal″(生命技术公司，Gaithersburg)的琼脂糖凝胶用来使得半乳糖表达克隆(其产生蓝色染色噬斑)易于鉴定和分离。(这一类型的″噬斑测定″的详细描述也可以在由生命技术公司发布的关于昆虫细胞培养和杆状病毒学的用户指南中发现，Gaithersburg，9-10页)。在适当的温育之后，以微量移液管(如Eppendorf)尖端挑取蓝色染色噬斑。然后在包含200μl Grace培养基的微量离心管中再悬浮包含重组病毒的琼脂，并将包含重组杆状病毒的悬浮液用来感染接种在35mm平皿上的Sf9细胞。四天后，收获这些培养皿中的上清液，然后将它们存储在4℃下。重组病毒被称为V-抗微生物肽。
为了检验人类抗微生物肽基因的表达，使Sf9细胞生长在补加有10％热灭活的FBS的Grace培养基中。用重组杆状病毒V-抗微生物肽对细胞进行感染，感染复数(″MOI″)为大约2。六小时后，除去培养基，并以SF900II培养基减去甲硫氨酸和半胱氨酸(得自生命技术公司，Rockville，MD)代替之。如果需要放射性标记的蛋白质，那么在42小时后，加入5μCi35S-甲硫氨酸和5μCi35S-半胱氨酸(由Amersham提供)。进一步培养细胞16小时，然后由离心收获它们。上清液中的蛋白质以及胞内蛋白质由SDS-PAGE和其后的放射自显影术(如果是放射性标记的)分析。纯化的蛋白质的氨基末端的氨基酸序列的微量测序可以用来确定成熟蛋白质的氨基末端序列，并因此而确定分泌信号肽的切割点与长度。实施例3人类抗微生物肽在哺乳动物细胞中的克隆和表达典型的哺乳动物表达载体包含启动子元件(介导mRNA转录的起始)、蛋白质编码序列以及转录终止和转录物聚腺苷酸化所需的信号。附加的元件包括增强子、Kozak序列和间插序列(侧接RNA剪接的供体和受体位点)。利用得自SV40的早期和晚期启动子、逆转录病毒(如RSV、HTLVI、HIVI)的长末端重复序列(LTRS)和巨细胞病毒(CMV)的早期启动子，可以实现高效的转录。然而，也可以利用细胞元件(例如人肌动蛋白启动子)。例如，用于实践本发明的合适表达载体包括诸如PSVL和PMSG(Pharmacia，Uppsala，瑞典)、pRSVcat(ATCC 37152)、pSV2dhfr(ATCC37146)和pBC12MI(ATCC 67109)之类的载体。可以利用的哺乳动物宿主细胞包括人Hela 293、H9和Jurkat细胞，小鼠NIH3T3和C127细胞，Cos1，Cos 7和CV 1，鹌鹑QC1-3细胞，小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
此外，基因可以在稳定的细胞系中表达，这些细胞系包含整合入染色体的基因。利用选择性标记(如dhfr、gpt、新霉素或潮霉素)的共转染使转染的细胞的鉴定与分离得以实现。
也可以扩增转染的基因，以表达大量的所编码的蛋白质。DHFR(二氢叶酸还原酶)标记用来产生携带数百或甚至数千拷贝的感兴趣基因的细胞系。另一有用的选择标记是酶谷氨酰胺合酶(GS)(Murphy等，生物化学杂志，227277-279(1991)；Bebbington等，生物/技术，10169-175(1992))。利用这些标记，使哺乳动物细胞生长在选择性培养基中，并选择具有最高抗性的细胞。这些细胞系包含整合入染色体的扩增的基因。中国仓鼠卵巢(CHO)和NSO细胞经常用于蛋白质的产生。
表达载体pC1和pC4包含Rous肉瘤病毒的强启动子(LTR)(Cullen等，分子和细胞生物学，438-447(1985年3月))和CMV-增强子的片段(Boshart等，细胞，41521-530(1985))。多克隆位点，例如具有限制酶切位点BamHI、XbaI和Asp718的多克隆位点，有利于感兴趣的基因的克隆。此外，载体还包含大鼠前胰岛素原基因的3’内含子、聚腺苷酸化和终止信号。实施例3(a)在COS细胞中的克隆和表达通过将编码全长人类抗微生物肽的cDNA克隆至表达载体pcDNAI/Amp或者pcDNAIII(可以得自Invitrogen公司)来制得表达质粒(p抗微生物HA)。
表达载体pcDNAI/amp包含(1)对在大肠杆菌和其它原核细胞中的增殖有效的大肠杆菌复制起点；(2)用于选择包含质粒的原核细胞的氨苄青霉素抗性基因；(3)用于在真核细胞中增殖的SV40复制起点；(4)CMV启动子、多接头、SV40内含子；(5)数个编码血凝素片段的密码子(即有利于纯化的″HA″标记)，其后跟终止密码子和聚腺苷酸化信号，如此安排是以便cDNA可以方便地处于CMV启动子的表达控制下，并便于可操作地经由多接头中的限制酶切位点与SV40内含子和聚腺苷酸化信号连接。HA标记对应于得自由Wilson等(细胞，37767(1984))描述的流感血凝素蛋白质的表位。HA标记与靶蛋白质的融合使得用能识别HA表位的抗体容易地检测和回收重组蛋白得以实现。此外，pcDNAIII包含可选择的新霉素标记。
将编码全长抗微生物肽的DNA片段克隆至载体的多接头区，以便重组蛋白的表达受到CMV启动子的指导。质粒构建方法如下。利用包含便利的限制酶切位点的引物(正如上面对于构建用于在大肠杆菌中表达抗微生物肽的载体所述的一样)，扩增保藏克隆的抗微生物肽cDNA。合适的引物包括下列的、用于这一实施例的引物。包含带下划线的BamHI位点、Kozak序列、AUG起始密码子和完全抗微生物肽的5’编码区的19个核苷酸的5’引物具有下列序列5’GACTGGATCCGCCATCATGAGGGTCTTGTATCTCC3’(SEQ IDNO9)。包含带下划线的BglII位点和20 bp的3’编码序列的3’引物具有下列序列(在3’末端)5’GACTAGATCTTGGCTTTTTGCAGCATTTTG3’(SEQ IDNO7)。
以BamHI和BgllI消化PCR扩增的DNA片段和载体，即pcDNAI/Amp，然后连接之。将连接混合物转化入大肠杆菌菌株SURE(得自Stratagene克隆系统，11099 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037)中，并将所转化的培养物接种在氨苄青霉素培养基平板上，然后培养该平板以使氨苄青霉素抗性菌落得以生长。将质粒DNA从抗性菌落中分离，并用限制酶切分析或者其它手段检测质粒DNA中是否存在抗微生物肽编码片段。
对于重组抗微生物肽的表达，用如上所述的表达载体使用例如由Sambrook等(分子克隆实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1989))描述的DEAE-DEXTRAN来转染COS细胞。在用于由载体表达抗微生物肽的条件下培养细胞。
利用例如Harlow等(抗体实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1988))描述的方法，由放射性标记和免疫沉淀法检测抗微生物肽-HA融合蛋白质的表达。为此，在转染两天之后，在包含35S-半胱氨酸的培养基中培养8小时来标记细胞。收集细胞和培养基，并用包含洗涤剂的RIPA缓冲液(150mM NaCl、1％NP-40、0.1％SDS、0.5％DOC、50mM TRIS，pH 7.5，正如以上引用的Wilson等所描述的)洗涤和溶解细胞。利用HA特异性单克隆抗体使蛋白质从细胞溶胞产物和培养基中沉淀出来。然后由SDS-PAGE和放射自显影术分析所沉淀的蛋白质。在细胞溶胞产物中看见预期大小的表达产物，而在阴性对照中则看不见。实施例3(b)在CHO细胞中的克隆和表达载体pC4用来表达抗微生物肽。质粒pC4是质粒pSV2-dhfr(ATCC保藏号37146)的衍生物。质粒包含处于SV40早期启动子的控制之下的小鼠DHFR基因。可以通过使细胞生长在补加有化疗剂氨甲蝶呤的选择性培养基(α-MEM，生命技术)中来选择缺乏二氢叶酸活性的、用这些质粒转染的中国仓鼠卵巢细胞或其它细胞。在具有氨甲蝶呤(MTX)抗性的细胞中的DHFR基因的扩增已得到充分的记载(参见，例如，Alt，F.W.，Kellems，R.M.，Bertino，J.R.和Schimke，R.T.，1978，生物化学杂志，253；1357-1370，Hamlin，J.L.和Ma，C.1990，生物化学和生物物理学报，1097107-143，Page，M.J.和Sydenham，M.A.1991，生物技术，964-68)。作为DHFR基因扩增的结果，生长在MTX浓度不断增加的环境中的细胞通过超量生产靶酶(DHFR)来产生抗药性。如果第二个基因与DHFR基因连接，那么它通常得到共扩增和超表达。本领域技术人员明白这一方法可以用来产生携带超过1,000个拷贝的扩增的基因的细胞系。其后，当除去氨甲蝶呤时，获得包含整合入宿主细胞的一个或多个染色体中的扩增的基因的细胞系。
用于表达感兴趣基因的质粒pC4包含Rous肉瘤病毒(Cullen等，分子和细胞生物学，1985年3月438-447)的长末端重复序列(LTR)的强大的启动子和分离自人巨细胞病毒(CMV)(Boshart等，细胞，41521-530(1985))的立即早期基因的增强子的片段。启动子的下游是使基因得以整合的BamHI、XbaI和Asp718限制酶切割位点。在这些克隆位点后面，质粒包含大鼠前胰岛素原基因的3’内含子和聚腺苷酸化位点。其它的高效启动子也可以用于表达，例如人β-肌动蛋白启动子，SV40早期或晚期启动子或者得自其它逆转录病毒(如HIV和HTLVI)的长末端重复序列。Clontech的Tet-Off和Tet-On基因表达系统和类似系统可以用来在哺乳动物细胞中以可调方式表达抗微生物肽(Gossen，M.和Bujard，H.1992，美国国家科学院院报，895547-5551)。对于mRNA的聚腺苷酸化其它信号，例如得自人生长激素或珠蛋白基因的信号也可以利用。也可以基于利用选择性标记(如gpt、G418或潮霉素)的共转染来选择携带整合入染色体中的感兴趣基因的稳定细胞系。优选在开始时利用一个以上的选择性标记，例如G418和氨甲蝶呤。
用限制酶BamHI和Asp718消化质粒pC4，然后利用小牛小肠磷酸酶由本领域已知的方法使之去磷酸化。然后从1％琼脂糖凝胶中分离载体。
利用与基因的5’和3’序列对应的PCR寡核苷酸引物，扩增编码完全抗微生物肽的DNA序列，包含其前导序列。5’引物具有包含带下划线的BamHI限制酶位点(其后为用于起始在真核生物中的翻译的有效信号，正如Kozak，M.，分子生物学杂志，196947-950(1987)所描述的)和图1(SEQID NO1)所示的抗微生物肽的20个碱基的编码序列的序列5’GACTGGATCCGCCATCATGAGGGTCTTGTATCTCC3’(SEQ ID NO9)。引物3’具有包含带下划线的Asp718限制酶切位点(其后为互补于图1(SEQ ID NO1)所示的抗微生物肽基因的非翻译区的20个核苷酸)的序列5’GACTGGTACCGATGTCGCACGTCTCTGATG3’(SEQ ID NO10)。
以内切核酸酶BamHI和Asp718消化所扩增的片段，然后在1％琼脂糖凝胶上再一次纯化之。然后以T4 DNA连接酶连接分离的片段和去磷酸化的载体。然后转化大肠杆菌HB101或XL-1 Blue细胞，并利用例如限制酶分析鉴定包含插入到质粒pC4中的片段的细菌。
将缺乏活性DHFR基因的中国仓鼠卵巢细胞用于转染。利用Lipofectin(Felgner等，同上)用0.5μg质粒pSV2-neo共转染5μg表达质粒pC4。质粒pSV2-neo包含显性选择标记、得自编码酶(授予抗包括G418的抗生素的抗性)的Tn5的neo基因。将细胞接种在补加有1mg/mlG418的α-MEM中。在2天之后，对细胞进行胰蛋白酶消化，并将其接种在杂交瘤克隆平板(Greiner，德国)(在补加有10、25或50ng/ml氨甲蝶呤和1mg/ml G418的α-MEM中的)中。在大约10-14天之后，对单一克隆进行胰蛋白酶消化，然后利用不同浓度(50nM、100nM、200nM、400nM、800nM)的氨甲蝶呤将其接种在6孔培养皿或10ml烧瓶中。然后将在最高浓度的氨甲蝶呤下生长的克隆转移至包含更高浓度(1μM、2μM、5μM、10mM、20mM)氨甲蝶呤的新的6孔平板上。重复相同的过程，直到获得生长在100-200μM浓度下的克隆。由例如SDS-PAGE和Western印迹或反相HPLC分析所需基因产物的表达。实施例4抗微生物肽mRNA表达的组织分布利用由Sambrook等(同上)描述的方法，进行Northern印迹分析以检测在人组织中抗微生物肽基因的表达。利用rediprimeTMDNA标记系统(Amersham生命科学)，按照制造厂商的指导，用32P标记包含抗微生物肽(SEQ ID NO1)的整个核苷酸序列的cDNA探针。在标记之后，利用CHROMASPIN-100TM柱(Clontech实验室公司)，按照制造厂商的PT1200-1号方案纯化探针。然后用纯化的标记的探针来检测各人体组织中的抗微生物肽mRNA。
包含各种人体组织(H)或人免疫系统组织(IM)的多组织Northern(MTN)印迹得自Clontech，并利用ExpressHybTM杂交溶液(Clontech)按照制造厂商的PT1190-1号方案用标记的探针检测之。在杂交和洗涤之后，封固印迹同时使之在-70℃下在胶片上曝光一夜，并按照标准方法显影胶片。
明显的是与在前面说明书和实施例中具体描述的方法相比，本发明可以用更多的其它方法实践。
按照以上教导，本发明的许多改进和变化是可能实现的，因此这些改进和变化处于后附的权利要求的范围之内。
本文引用的所有出版物(包含专利、专利申请、期刊文章、实验室手册、书或其它文献)的全部公开部分与本文一并参考。
序列表(1)一般信息(i)申请人人类基因组科学公司9410 KEY WEST AVENUEROCKVILLE，MD 20850美国申请人/发明人OLSEN，HENRIK S.
RUBEN，STEVEN M.
(ii)发明名称抗微生物肽(iii)序列数10个(iv)通讯地址(A)收信人STERNE，KESSLER，GOLDSTEIN & FOX P.L.L.C.
(B)街道1100 NEW YORK AVENUE，SUITE 600(C)城市华盛顿(D)州DC(E)国家美国(F)ZIP20005(v)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1.0，版本#1.30(vi)当前的申请数据(A)申请号待定(B)申请日本申请的提交日(C)分类(vii)在先的申请数据(A)申请号US 60/046,415(B)申请日14-5-1997
(viii)律师/代理人信息(A)名称STEFFE，ERIC K.
(B)登记号36,688(C)参考/证书号1488.093PC01(ix)电讯信息(A)电话(202)371-2600(B)传真(202)371-2540(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度323个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构两种(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置36..227(ix)特征(A)名称/关键词信号肽(B)位置36..104(ix)特征(A)名称/关键词成熟肽(B)位置105..227(xi)序列描述SEQ ID NO1GACTCAGCTC CTGGTGAAGC TCCCAGCCAT CAGCC ATG AGG GTC TTG TAT CTC 53Met Arg Val Leu Tyr Leu-23 -20CTC TTC TCG TTC CTC TTC ATA TTC CTG ATG CCT CTT CCA GGT GTT TTT 101Leu Phe Ser Phe Leu Phe Ile Phe Leu Met Pro Leu Pro Gly Val Phe-15 -10 -5GGT GGT ATA GGC GAT CCT GTT ACC TGC CTT AAG AGT GGA GCC ATA TGT 149Gly Gly Ile Gly Asp Pro Val Thr Cys Leu Lys Ser Gly Ala Ile Cys1 5 10 15CAT CCA GTC TTT TGC CCT AGA AGG TAT AAA CAA ATT GGC ACC TGT GGT 197His Pro Val Phe Cys Pro Arg Arg Tyr Lys Gln Ile Gly Thr Cys Gly20 25 30CTC CCT GGA ACA AAA TGC TGC AAA AAG CCA TGAGGAGGCC AAGAAGCTGC 247Leu Pro Gly Thr Lys Cys Cys Lys Lys Pro35 40TGTGGCTGAT GCGGATTCAG AAAGGGCTCC CTCATCAGAG ACGTGCGACA TGTAAACCAA 307ATTAAACTAT GGTGTC 323(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度64个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Arg Val Leu Tyr Leu Leu Phe Ser Phe Leu Phe Ile Phe Leu Met-23 -20 -15 -10Pro Leu Pro Gly Val Phe Gly Gly Ile Gly Asp Pro Val Thr Cys Leu-5 1 5Lys Ser Gly Ala Ile Cys His Pro Val Phe Cys Pro Arg Arg Tyr Lys10 15 20 25Gln Ile Gly Thr Cys Gly Leu Pro Gly Thr Lys Cys Cys Lys Lys Pro30 35 40(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度63个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构无关(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO3Met Arg Leu His His Leu Leu Leu Ala Leu Leu Phe Leu Val Leu Ser1 5 10 15Ala Trp Ser Gly Phe Thr Gln Gly Val Gly Asn Pro Val Ser Cys Val20 25 30Arg Asn Lys Gly Ile Cys Val Pro Ile Arg Cys Pro Gly Ser Met Lys35 40 45Gln Ile Gly Thr Cys Val Gly Arg Ala Val Lys Cys Cys Arg Lys50 55 60(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度3974个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构两种(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO4GGTACCTAAG TGAGTAGGGC GTCCGATCGA CGGACGCCTT TTTTTTGAAT TCGTAATCAT60GGTCATAGCT GTTTCCTGTG TGAAATTGTT ATCCGCTCAC AATTCCACAC AACATACGAG 120CCGGAAGCAT AAAGTGTAAA GCCTGGGGTG CCTAATGAGT 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CTTGGCGGCA AGAAAGCCAT CCAGTTTACT 3600TTGCAGGGCT TCCCAACCTT ACCAGAGGGC GCCCCAGCTG GCAATTCCGG TTCGCTTGCT 3660GTCCATAAAA CCGCCCAGTC TAGCTATCGC CATGTAAGCC CACTGCAAGC TACCTGCTTT 3720CTCTTTGCGC TTGCGTTTTC CCTTGTCCAG ATAGCCCAGT AGCTGACATT CATCCGGGGT 3780CAGCACCGTT TCTGCGGACT GGCTTTCTAC GTGTTCCGCT TCCTTTAGCA GCCCTTGCGC 3840CCTGAGTGCT TGCGGCAGCG TGAAGCTTAA AAAACTGCAA AAAATAGTTT GACTTGTGAG 3900CGGATAACAA TTAAGATGTA CCCAATTGTG AGCGGATAAC AATTTCACAC ATTAAAGAGG 3960AGAAATTACA TATG3974(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度112个碱基对(B)类型核酸(C)链型两种(D)拓扑结构双链(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO5AAGCTTAAAA AACTGCAAAA AATAGTTTGA CTTGTGAGCG GATAACAATT AAGATGTACC60CAATTGTGAG CGGATAACAA TTTCACACAT TAAAGAGGAG AAATTACATA TG 112(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度30个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型iii)分子类型cDNAixi)序列描述SEQ ID NO6GACTCCATGG GTGTTTTTGG TGGTATAGGC 30(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型cDNAixi)序列描述SEQ ID NO7GACTAGATCT TGGCTTTTTG CAGCATTTTG 30(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型cDNAixi)序列描述SEQ ID NO8GACTAGATCT TCATGGCTTT TTGCAGCATT TTG 33(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线型(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO9GACTGGATCC GCCATCATGA GGGTCTTGTA TCTCC 35(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO10GACTGGTACC GATGTCGCAC GTCTCTGATG 30
权利要求
1.一种分离的核酸分子，该核酸分子包含具有与选自由下列序列组成的组中的序列有至少95％同源性的核苷酸序列的多核苷酸(a)一种编码SEQ ID NO2中的大约-23至大约41位氨基酸的核苷酸序列；(b)一种编码SEQ ID NO2中的大约-22至大约41位氨基酸的核苷酸序列；(c)一种编码SEQ ID NO2中的大约1至大约41位氨基酸的核苷酸序列；(d)一种编码具有由包含在ATCC保藏号97982中的cDNA克隆所编码的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；(e)一种编码具有由包含在ATCC保藏号97982中的cDNA克隆所编码的氨基酸序列的成熟抗微生物多肽的核苷酸序列；和(f)一种互补于(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的核苷酸序列之任一的核苷酸序列。
2.一种分离的核酸分子，该核酸分子包含编码SEQ ID NO2的抗微生物多肽的携带表位部分的氨基酸序列的多核苷酸。
3.权利要求2的分离的核酸分子，其中所说的携带表位部分选自由下列节段组成的组中SEQ ID NO2中的大约19至大约27位氨基酸和SEQ ID NO2中的大约31至大约41位氨基酸。
4.一种分离的核酸分子，该核酸分子包含具有选自由下列序列组成的组中的序列的多核苷酸(a)SEQ ID NO1所显示的序列的片段的核苷酸序列，其中所说的片段包含至少20个SEQ ID NO1中的邻接核苷酸；和(b)一种互补于(a)的核苷酸序列的核苷酸序列。
5.一种用于制备重组载体的方法，该方法包括将权利要求1的分离的核酸分子以对启动子可操作的键插入到载体中。
6.一种由权利要求5的方法产生的重组载体。
7.一种制备重组宿主细胞的方法，该方法包括将权利要求6的重组载体引入到宿主细胞中。
8.一种由权利要求7的方法产生的重组宿主细胞。
9.一种用于产生多肽的重组方法，该方法包括在使所说的多肽得到表达的条件下培养权利要求8的重组宿主细胞并回收所说的多肽。
10.一种分离的抗微生物多肽，该抗微生物多肽包含与选自由下列氨基酸组成的组中的氨基酸有至少95％同源性的氨基酸(a)SEQ ID NO2中的大约-23至大约41位氨基酸；(b)SEQ ID NO2中的大约-22至大约41位氨基酸；(c)SEQ ID NO2中的大约1至大约41位氨基酸；和(d)包含(a)、(b)或(c)的多肽之任一的携带表位部分的氨基酸。
11.一种分离的多肽，该多肽包含SEQ ID NO2的抗微生物蛋白质的携带表位部分，其中所说的部分选自由下列节段组成的组中SEQ ID NO2中的大约19至大约27位氨基酸和SEQ ID NO2中的大约31至大约41位氨基酸。
12.一种分离的抗体，该抗体特异性结合权利要求10的抗微生物肽。
13.一种分离的核酸分子，该核酸分子包含编码抗微生物肽的多核苷酸，其中除至少一个保守氨基酸取代外，所说的多肽还具有选自由下列序列组成的组中的序列(a)SEQ ID NO2中的大约-23至大约41位氨基酸；(b)SEQ ID NO2中的大约-22至大约41位氨基酸；(c)SEQ ID NO2中的大约1至大约41位氨基酸；(d)由包含在ATCC保藏号97982中的cDNA克隆编码的氨基酸序列；(e)由包含在ATCC保藏号97982中的cDNA克隆编码的成熟抗微生物多肽的氨基酸序列；和(f)一种互补于(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的核苷酸序列之任一的核苷酸序列。
14.一种分离的抗微生物多肽，其中除至少一个保守氨基酸取代外，所说的多肽还包含选自由下列序列组成的组中的序列(a)SEQ ID NO2中的大约-23至大约41位氨基酸；(b)SEQ ID NO2中的大约-22至大约41位氨基酸；(c)SEQ ID NO2中的大约1至大约41位氨基酸；(d)由包含在ATCC保藏号97982中的cDNA克隆编码的氨基酸序列；(e)由包含在ATCC保藏号97982中的cDNA克隆编码的成熟抗微生物多肽的氨基酸序列；和(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的多肽之任一的携带表位部分的氨基酸序列。
15.一种分离的抗微生物多肽，该抗微生物多肽包含与由包含在ATCC保藏号97982中的cDNA克隆所编码的氨基酸有至少95％同源性的氨基酸序列。
全文摘要
本发明涉及新的人类抗微生物肽,该肽是防卫素超家族的成员之一。具体地说,本发明提供了编码人类抗微生物肽的分离的核酸分子。本发明也提供了抗微生物肽以及载体、宿主细胞和产生该肽、载体、宿主细胞的重组方法。本发明还提供了用于检测与免疫系统有关的病症的诊断方法和用于治疗这些病症的方法。
文档编号C12N15/12GK1260834SQ98806203
公开日2000年7月19日 申请日期1998年5月14日 优先权日1997年5月14日
发明者H·S·欧尔森, S·M·鲁本 申请人:人类基因组科学公司