通过微生物生产脂质的方法，及所述脂质的用图

通过微生物生产脂质的方法，及所述脂质的用图
【专利摘要】本发明涉及丙三醇或C3?C5的糖作为在培养放线菌细菌期间的主要碳源以通过所述细菌生产脂质的用途。
【专利说明】
通过微生物生产脂质的方法，及所述脂质的用途
技术领域
[0001]本发明涉及通过微生物生产脂质的技术领域，以及尤其是所述脂质的用途。
【背景技术】
[0002 ]通常，减少对气候以及对食品生产的影响、确保对燃料的供应以及其他经济因素， 促进了使用可再生的生物材料生产生物燃料。
[0003] 不能用于人类或畜类食品供应以及可以通过环境友好方式制造的生物资源越来 越引起人们的兴趣。生物柴油可以由油料作物、动物脂肪或再生油脂制造。
[0004] 由于人们已知海藻和某些微生物能够生产和/或积累脂质，它们也被建议用作生 物柴油的油的来源。
[0005] Campbell 2008以及Strobel et al.2008描述了藻类以及菌类在不同类型生物反 应器中的培养条件的优化，目的在于最大化脂质以及脂肪酸的产量以精制生物燃料。
[0006] 光合生产脂质的一个替代方式为使用异养微生物在没有光的情况下由有机分子 (例如糖)生产脂质。
[0007] 来源于单细胞有机体的油惯常地被当作特殊产品使用，例如在保健食品中，而不 是作为基础化学品。
[0008] 可惜，这种生产的产量较低并且最终产品很贵。
[0009]最近的一些公开专利提出了使用较便宜的原料以通过异养微生物生产脂质的新 一代方法。
[0010] 申请W0 2009/034217描述了借由废品和微生物生产石蜡、脂肪酸和醇类的发酵方 法。
[0011] 申请W0 2009/046375描述了来源于生物质的多糖向单糖、低聚糖的转化，以及其 利用包含外源基因的重组微生物转变成生物燃料，所述外源基因允许所述微生物在作为唯 一碳源的多糖中发育。
[0012] 申请US2009/0064567描述了通过利用包括纤维素作为主要碳源的原料通过微生 物异养发酵生产生物油。
[0013] 申请WO 2009/011480A1描述了通过微生物藻类和菌类生产解聚纤维素材料的生 物油。
[0014] 另外，文献WO 2009/009391A2描述了通过首先生产醇组合物然后将该产品供应给 一个宿主以生产脂肪酯的脂肪酯制备方法。
[0015] 申请US2011294173描述了通过供应有机垃圾作为碳源由链霉菌属 (Streptomyces)细菌生产脂质的方法。
[0016] 这些文献并不总是解决主要问题：由不同的微生物生产脂质的产率。
[0017] 除此之外，削减生产成本和提高脂质质量仍然是没有解决的问题。

【发明内容】

[0018] 本发明的目的是克服这些缺陷。
[0019] 本发明的一个目的是提供便宜且具有高产率的生产脂质的方法。
[0020] 本发明的另一个目的是提供能够实现由微生物实施所述方法的培养介质。
[0021 ]本说明书涉及丙三醇或C3-C5的糖作为在培养放线菌(Actinomyc6te)细菌期间的 主要碳源以通过所述细菌生产脂质的用途，所述细菌在富磷酸盐和/或氮的第一介质中培 养，然后在贫磷酸盐和/或氮的第二培养介质中培养。
[0022] 另外，本发明还涉及丙三醇或C3-C5的糖作为在培养放线菌细菌期间的主要碳源 以通过所述细菌生产脂质的用途，所述细菌在富磷酸盐的第一介质中培养，然后在贫磷酸 盐的第二培养介质中培养。
[0023] 本发明基于发明人的令人惊奇的发现，即，在丙三醇作为碳源的存在下培养的放 线菌细菌积累了大量的储存脂质（lipid de rgserve)。
[0024] 在本发明中，为了生产大量的脂质，所述细菌首先在富氮和/或磷酸盐的介质中在 确定时间内被培养(预培养）。在本发明中，所述磷酸盐或氮是有机的或矿质的源。该第一培 养在短时间内实现并且被认定为"预培养"。然后，所述细菌被转移到总是包含丙三醇作为 主要碳源而氮和/或磷酸盐贫乏的第二介质中。该第二培养为主培养。
[0025] 统一地，在下文中将氮以及有机的或矿质的磷酸盐命名为营养物。同样地，在本发 明中统一使用术语"无机的"或"矿质的"以定义非有机的营养物。
[0026] 有利地，在富氮和/或磷酸盐的介质中实现预培养，并且在相同营养物贫乏的介质 中实现培养。
[0027] 另外：
[0028] -如果预培养富氮，则所述培养将在贫氮的介质中实现，
[0029] -如果预培养富矿质的或有机的磷酸盐，则所述培养将在矿质的或有机的磷酸盐 贫乏的介质中实现，并且
[0030] -如果预培养富矿质的或有机的磷酸盐以及氮，则所述培养将在矿质的或有机的 磷酸盐和氮贫乏的介质中实现。
[0031] 先在富营养物的介质中然后在贫营养物的介质中的培养在现有技术中被称为"过 度补偿（hypercompensation)''。
[0032]在磷酸盐过度补偿的范围内，有利地向预培养介质中添加2.5mM至50mM的无机磷 酸盐，优选地3mM至40mM，特别地4mM至30mM，更特别地5mM至20mM，尤其是5mM至10mM无机磷 酸盐。添加到预培养介质中的有机磷酸盐通过以下化合物实现：由来源于核酸的核苷酸携 带的磷酸盐，其中核酸为例如核糖核酸(ARN)，脱氧核糖核酸(ADN)或三磷酸腺苷(ATP)，鸟 苷三磷酸(GTP)，酵母提取物等。该列举为非限制性的并且本领域技术人员能够确定合适的 有机磷酸盐源。
[0033]在预培养介质中使用的矿质的磷酸盐通过以下化合物实现：K2HP〇4/KH2P〇4或 Na2HP〇4/NaH2P〇4。在预培养介质中，无机磷酸盐的浓度从4mM至20mM变化，特别地所述浓度 为大约5mM。
[0034]有利地，在预培养和培养中的丙三醇的浓度不超过2M，有利地1.5M，特别地1M。
[0035]在下文的实施例中，示出了通过放线菌生产脂质与培养介质和预培养介质中的丙 三醇的浓度相关。考虑与丙三醇剂量相关的(或"剂量依赖"）的脂质生产，直到2M丙三醇。
[0036] 使用丙三醇作为本发明的主要碳源比使用通常的葡萄糖更有利。事实上，下文中 的实施例示出了通过放线菌生产脂质依赖于丙三醇的剂量或浓度，而高的葡萄糖浓度有抑 制脂质的增长及生产或积累的效果。
[0037] 在本发明中，"主要碳源"指的是一定数量的下述碳化合物，即，通过细菌可代谢、 能够产生能量(尤其是三磷酸腺苷(ATP)形式)并且能够生物合成所述细菌增长和增殖所必 需的有机分子。所述主要碳源代表在培养介质或预培养介质中大于90 %的碳供给。
[0038] 在本发明中，"C3-C5的糖"指的是包含3、4或5个碳的糖。同时，其还涉及醛糖(包含 醛官能团的多元醇)或酮糖(包含酮官能团的多元醇），所述C3的糖，C4的糖和C5的糖为线形 或环形形式，并且必要时其任选是修饰的。
[0039]在本发明中，由放线菌通过使用丙三醇或C3-C5的糖生产的脂质的形式为包含脂 肪酸混合物的组合物，所述混合物主要包含三酰甘油或TAG。
[0040] "主要包含三酰甘油的组合物"指的是相对于包含在所述组合物中的脂质的总量， 包含大于75%，尤其是大于80%，特别地大于85%，更特别地大于90%的三酰甘油的油料组 合物。
[0041 ]所述组合物还包含少量的游离脂肪酸、一酰甘油和二酰甘油。
[0042] 根据本发明的脂质生产者放线菌主要是属于如下属的细菌：链霉菌属 (Streptomyces)、红球菌属（Rhodococcus)、无枝酸菌属（Amycolatopsis)、放线菌属 (Actinomyces)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、弗兰克氏菌属 (Frankia)、微球菌属（Micrococcus)、小单抱子菌属（Mi cromonospora )、分支杆菌属 (Mycobacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)，丙酸杆菌属(Propionibacterium)等。
[0043] 在一个有利的实施方案中，本发明还涉及前文描述的用途，其中在第一介质中的 培养时间为15至120小时。
[0044] 所述预培养的时间有利地为约15至120小时，尤其是20至90小时，更特别地24至60 小时，特别地为36至48小时。因此，所述预培养在15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、 77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、 102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119或120 小时内实现。
[0045] 在贫营养物的介质中的培养，例如以上所描述的，在约15至120小时时间内实现， 有利地20至80小时，尤其是72小时。
[0046] 当所述培养介质中无机磷酸盐贫乏时，所述磷酸盐的浓度在0.5mM至2mM之间变 化，特别地为ImM。
[0047] 在一个有利的实施方案中，本发明涉及前文定义的用途，其中所述C3-C5的糖为丙 糖、丁糖或戊糖。
[0048] 在另一个有利的实施方案中，本发明还涉及如前文定义的用途，其中C3-C5的糖 为:甘油醛(glyc6rald6hyde)、赤藓糖（grythrose)、苏糖（thrgose)、核糖(ribose)、阿拉伯 糖(8瓜13；[11086)、木糖(171086)、来苏糖（15^086)、二羟基丙酮((1；[117(11'(?5^(^1：0116)、赤藓酮 糖(Srythrulose)、核酮糖(ribulose)和木酮糖(xylulose)。
[0049] 在又一个有利的实施方案中，本发明涉及上面提到的用途，其中所述细菌为链霉 菌属的放线菌。
[0050] 在又一个有利的实施方案中，本发明涉及上面提到的用途，其中所述丙三醇选自 精制丙二醇和非精制丙二醇。
[0051] 虽然出于生产成本的原因非精制丙三醇是有利的，但主要使用提纯的丙三醇或精 制丙三醇，即富含大约至少90%，尤其是95%，特别地99%，尤其是100%的丙三醇，也是同 样有利的。
[0052]已知有不同的方法生产丙三醇。
[0053] 甘油或丙三醇的历史合成起源于Wurtz反应，由稀丙基三溴化物（tribromure d' allyle)开始。然而，这样的合成是不完全的，原因是烯丙基三溴化物本身由甘油制备。完全 合成源于由丙稀进行的Charles Friedel et Silva。
[0054] 存在不同的由丙稀开始的合成线路。环氧氯丙烷(gpichlorhydrine)的方法是最 重要的。其包括氯化丙烯以提供氯丙烯，所述氯丙烯被次氯酸盐氧化成二氯丙醇，并且与强 碱反应以提供环氧氯丙烷。环氧氯丙烷然后被水解以提供丙三醇。
[0055] 丙三醇也可以通过发酵的方法(涉及例如酵母)由单糖通过以下步骤生产：
[0056] (1)在乙醛离子和亚硫酸氢盐离子之间形成络合物，因此延缓在丙三醇的生产中 乙醇的生产并且确保氧化还原反应的平衡，或
[0057] (2)通过在pH接近7或以上的条件下生长而培养微生物，或
[0058] (3)通过使用抗渗透的微生物。
[0059] 然而，如今，丙三醇在工业上按两个主要方法生产：脂肪体的皂化或植物油的酯交 换。
[0060] 皂化反应为允许从脂肪体和氢氧化钠生产肥皂和丙三醇的反应。所述源于皂化反 应的丙三醇纯度非常高(>99% )，并且因此主要用于医药及化妆品应用。
[0061] 所述丙三醇，或甘油，同样地可以由植物油的酯交换生产，其中在植物油甲基酯 (EMHV)的生产中其为副产物，所述植物油甲基酯用作被命名为生物柴油的燃料。
[0062]酯交换反应为包含三个连续的可逆步骤的反应，其中甘油三酯被转化为甘油二 酯，然后甘油二酯又被转化为甘油单酯，并且最终甘油单酯被转化成酯(生物柴油）和丙三 醇(副产物）。
[0063] 在酯交换反应过程中，所述油或油脂在一种催化剂的存在下与一种短链醇(通常 为甲醇)反应。
[0064] 该反应可通过均相催化使用在反应介质中可溶的催化剂实施，也可通过非均相催 化使用在反应物中完全不溶的催化剂实施。
[0065] 目前，均相催化为在生物柴油生产中最常使用的技术。酯交换可以通过碱性催化 剂或酸性催化剂实现。更高的反应性通常通过碱性介质获得。
[0066]存在三大类催化剂：
[0067]-碱性催化剂：
[0068] ?碱金属或碱土金属〇^、他、1(、0&、8&、(^等)的氢氧化物、醇盐、或皂，
[0069] ?胍族胺，例如；
[0070] -酸性催化剂：
[0071] ?矿物酸:HCl、H2S〇4，
[0072] ?磺酸，
[0073] ?离子交换树脂(强酸），
[0074] ?沸石；
[0075]-其他催化剂：
[0076] ?钛醇盐：11(0811)4、11((^)4等，
[0077] ?各种金属例如311、1%、211、11、？13等的氧化物。
[0078] 很少使用酸性催化剂，因为其反应性较低并且腐蚀工业装置的风险很高。金属的 醇盐或氧化物尤其被用于由不同的脂肪酸甲基酯部分(coupe)合成重醇酯。
[0079] 氢氧化钠甲醇溶液或甲醇钠是考虑用来生产生物柴油的催化剂。
[0080] 非精制丙三醇的化学组成根据生产方法变化。因此，例如甲醇、各种盐或氯化钾的 组分可以在最终产品中以不同的含量存在。
[0081] 通常地，不管使用的是何种生产方法，丙三醇都占总产品的63%至99%。甲醇的含 量在0 %至大约25 %之间变化。磷和钾的含量占干物质的1 %至2 %之间。钠的存在量为干物 质的1%。
[0082] 非均相催化在环境限制排放以及由该方法取得的丙三醇是中性的以及无盐无水 的方面具有巨大的优势，例如在专利FR-B-2752242中描述的。不同于均相催化，反应产物中 不存在盐就不会强制要求提纯处理。
[0083] 其它的技术允许通过利用创新技术，例如借助微波加热或通过酶催化，甚至通过 使用超临界甲醇来执行该反应。
[0084]粗制丙三醇产品可以通过活性炭处理被提纯或精制，以消除有机杂质，通过碱处 理以消除未反应的丙三醇的酯，并且通过离子交换以消除盐。通过一系列蒸馏获得的丙三 醇具有高纯度(>99.5%)。
[0085]在又一个优选的实施方案中，本发明涉及上面提到的用途，其中所述细菌为脂肪 IMI (bacterie lipoggnique) 〇
[0086] "脂肪生成细菌"在本发明中指的是能够自然地生产占其生物质的至少20%的脂 质的细菌。
[0087]这样的细菌菌株是有利的，因为它们允许在根据本发明的方法培养时生产大量的 脂质，占其生物质的大于50 %。
[0088]本发明的有利的脂肪生成菌株为以下菌株：抗生链霉菌3137 ( Streptomyces antibioticus 3137)、波塞链霉菌（Streptomycespeuceius)、龟裂链霉菌 2535 (Streptomyces rimosus 2535)、天蓝色链霉菌ATCC 19832(Streptomyces coelicolor ATCC 19832)、天蓝色链霉菌ATCC 21666(Streptomyces coelicolor ATCC21666)、天蓝色 链霉菌变体M145(Streptomyces coelicolor Variant M 145)、天蓝色链霉菌变体 M145M1155(Streptomyces coelicolor Variant M145M1155)、天蓝色链霉菌变体 M145M1146(Streptomyces coelicolor Variant M145M1146)、天蓝色链霉菌变体 M145M1141(Streptomyces coelicolor Variant M145M1141)、天蓝色链霉菌变体 M145M1148(Streptomyces coelicolor Variant M145M1148)、天蓝色链霉菌变体 M145M1142(Streptomyces coelicolor Variant M145M1142)和天蓝色链霉菌变体 M145M1144(Streptomyces coelicolor Variant M145M1144)、Streptomyces linolmensis NRRL2936、脱叶链霉菌（Streptomyces exfoliatus)、Streptomyces cealestius ATCC 15084、变铅青链霉菌 1326(Streptomyces lividans 1326)、活力链霉菌（Streptomyces actuosus)、产二素链霉菌OS MAROC J9(Streptomyces ambofaciens OS MAROC J9)和产二 素链霉菌OS MAROC J5(Streptomyces ambofaciens OS MAROC J5)、网状链霉菌DSM 40776 (Streptomyces reticuli DSM 40776)、微小链霉菌2283FB(Streptomyces parvulus 2283FB)、委内瑞拉链霉菌5110(Streptomyces Venezuela 5110)、诺尔斯链霉菌 (Streptomyces noursei)和Streptomyces cinabarinnus。
[0089] 本发明的另一个有利的实施方案涉及上面提到的用途，其中所述脂肪生成细菌通 过替换、删除或插入至少一个其基因组的核酸被基因修饰，从而比原始菌株积累更多的脂 质。
[0090] 例如，发明人已经说明，在如上文中描述的情况中（即，根据本发明的方法），删除 " ?丐依赖抗生素"的多肽型抗生素的生物合成路径的两个组分AbsAl/AbsA2导致链霉菌中的 三酰甘油(TAG)积累的增加。
[0091] 发明人还发现:天蓝色链霉菌M145的菌株一一其中抗生素生物合成的四个主要途 径被删除（〇?1(、004、1^0和40')并且其中两个点突变42626和02711'被引入基因叩81 (SC04659，30S核糖体蛋白S12);变体菌株M145 :M1155，相对于M145具有提高的脂质产量，特 别是有葡萄糖存在的情况下。在丙三醇存在的情况下，脂质的积累在原始菌株M145中的同 样多并且引入的不同基因修饰对葡萄糖的影响要小得多。
[0092] 当天蓝色链霉菌M145的菌株分别在丙三醇0.2M/葡萄糖0.1M R2YE介质中培养96 小时后，其积累其生物质的大约30 % /6 %的TAG。
[0093] Microbial Biotechnology(2011 )4(2)，207-215，Gomez-Escribano和Bibb中描述 的M145变体菌株M1155在过度补偿条件下在介质R2YE丙三醇0.2M中培养时，其积累其生物 质 40 % 的 TAG。
[0094] 鉴于对细菌基因组的认识，以及本领域技术人员对抗生素生物合成途径的认识， 本领域技术人员能容易地确定应该针对的基因或基因序列。
[0095]另外，基因 rpoB和/或rpsL可以被突变(通过点突变）。这些突变对储备脂质的积累 以及对抗生素(尤其是多肽类型）的生产同样都具有积极影响，表明这些突变对乙酰辅酶A (acgtylCoA)的产生具有积极影响。
[0096]再者，所述参与储备脂质的生产的基因或基因组合还能够被突变：
[0097]-输入(运输)丙三醇的流量提高涉及的基因，其向丙三醇3P(TAG的前体)的转化及 其向乙酰辅酶A(酶的功能和/或信号/调节)的分解代谢，
[0098] -TAG生物合成、脂肪酸生物合成、及其在其骨架丙三醇上的负载涉及的基因（酶的 功能和/或信号/调节），
[0099] -TAG降解涉及的基因。
[0100]在上文提到的用途的框架内，同样有利的是使用具有下述基因修饰的细菌菌株， 所述基因修饰提高用于脂质合成的前体的可用性。因此，例如，有利的是布置积累中间代谢 产物例如丙三醇3-磷酸酯(G3P)(glyc&rol 3-phosphate)甚或是乙酰基和丙二酰辅酶A(乙 酰辅酶A、丙二酸辅酶A(malonyl CoA))的细菌菌株。
[0101] 在上文提到的用途的框架内，另外有利的是使用具有下述基因修饰的细菌菌株， 所述基因修饰提高脂质合成前体的可用性。另外，例如，有利的是布置积累中间代谢产物例 如丙三醇3-磷酸酯(G3P)甚或是乙酰辅酶A的细菌菌株。
[0102] 另外，在上文提到的用途的框架内，还有利的是使用具有下述基因修饰的细菌菌 株，所述基因修饰提高前体(乙酰基和丙二酸辅酶A)的产生和TAG的生物合成所涉及的酶体 系的活性，在前体（乙酰基和丙二酸辅酶A)的产生和TAG的生物合成中，可以引用对酶的活 性(生物素）必不可少的辅助因素的可用性或翻译后的修饰(磷酸化、乙酰化、糖基化等）的 强度的提高，其对在前体的产生和TAG的生物合成中起作用的酶的活性具有积极作用。 [0103]丙三醇可以通过两条全部导致乙酰辅酶A合成的潜在竞争路径分解：
[0104]-丙三醇激酶路径，Gly3P DH(抑制素 GylR控制下的操纵子SC01659至SC01661、 SC01658)和SC04774(推定的3P脱氛酶丙三醇（glyc6rol 3P d6shydrog6nase putative))。 该路线导致TAG生物合成所必须的Gly3P的制造。
[0105] 为了提高G3P的库(pool)，尤其可联合地过度表达基因 SC01659(丙三醇的传递体） 和SC01660(丙三醇激酶），考虑灭活SC04774，SC04774被认为将Gly3P转化成进入糖酵解的 DHAP，
[0106]-丙三醇脱氢酶路径（S⑶2598/S⑶6754)，DHA激酶（S⑶0580,操纵子SC00581至 SC00576，具有分支调节器，SC00582)和/或操纵子SC07073至SC07071。
[0107] 还可以想到通过glyDH/DHA激酶路径提高丙三醇的分解代谢，以提高乙酰辅酶A的 库。
[0108] 在所有的情况下，要特别注意细胞(生成的NADH应该被再氧化)的氧化还原平衡。
[0109] 为了提高乙酰辅酶A的库，同样可通过作用在任选的翻译后调节和/或大量的这些 酶的活动所必须的辅因子上而提高编码糖酵解酶的基因的表达和/或提高相应的酶的活 性。特别的好处是糖酵解的下部的酶和尤其是复合丙酮酸盐脱氢酶。
[0110] 为了提高通过细菌生产脂质的产量，同样有利的是实现所述细菌的基因修饰，以 减少脂肪酸的降解。
[0111] 通过说明的方式，有利的是降低编码乙醛酸路径的酶的基因的表达。特别地，基因 SC00982和相邻基因可以被删除或突变，以使得其产物不再合成或不再起作用。
[0112] 上文提到的基因修饰的实例仅以参考的名义给出并且不应被认为限制本发明的 范围。具有所讨论领域的一般常识的本领域技术人员能够确定最合适的改变。
[0113] 本说明书还涉及包含丙三醇或C3-C5的糖作为主要碳源的一个培养介质组，所述 培养介质组包含：
[0114] -富矿质的磷酸盐和/或氮的第一培养介质，和
[0115] -贫矿质的磷酸盐和/或氮的第二培养介质。
[0116] 再者，本说明书还涉及包含丙三醇或C3-C5的糖作为主要碳源的一个培养介质组， 所述培养介质组包含：
[0117] -富矿质的磷酸盐和/或氮的第一培养介质，和
[0118] -贫矿质的磷酸盐和/或氮的第二培养介质。
[0119] 有利地，本发明还涉及包含丙三醇或C3-C5的糖作为主要碳源的一个培养介质组， 所述培养介质组包含：
[0120] -富矿质的磷酸盐的第一培养介质，和
[0121] -贫矿质的磷酸盐的第二培养介质。
[0122] 有利地，本说明书还涉及包含丙三醇或C3-C5的糖作为主要碳源的一个培养介质 组，所述培养介质组包含：
[0123] -富氮的第一培养介质，和
[0124] -贫氮的第二培养介质。
[0125] 在本发明中，所述培养介质为本领域技术人员通常使用的允许放线菌细菌生长的 介质。
[0126] 作为实例，在链霉菌的培养的框架中，介质取\￥￡1^、1^5、3111、1?2或1?2￥￡和改性的 YEME能够被使用。不同有利的介质的组成在下文中的实施例部分描述。
[0127] 有利地，在本发明中，第一培养介质和第二培养介质具有相同的性质。此外，如果 第一介质为R2YE介质，第二介质将有利地为R2YE介质，任选地被稍稍改变，尤其是不再包含 蔗糖。
[0128] 在本发明的一些方面，选择性质不同于第二介质的第一介质是合适的。本领域技 术人员，根据使用的细菌菌株，将能直接选择更合适的介质。
[0129] 本说明书另外涉及一个组合，该组合包含：
[0130] -富磷酸盐和/氮的第一培养介质，和 [0131 ]-贫磷酸盐和/氮的第二培养介质，
[0132] 所述第一培养介质和第二培养介质包含作为主要碳源的丙三醇或C3-C5的糖，尤 其是选自甘油醛、赤藓糖、苏糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、二羟基丙酮、赤藓酮糖、核酮 糖和木酮糖的糖，和
[0133] -至少一种放线菌菌株。
[0134] 有利地，本发明还另外涉及一个组合，该组合包含：
[0135] -富磷酸盐的第一培养介质，和
[0136] -贫磷酸盐的第二培养介质，
[0137] 所述第一培养介质和第二培养介质包含作为主要碳源的丙三醇或C3-C5的糖，尤 其是选自甘油醛、赤藓糖、苏糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、二羟基丙酮、赤藓酮糖、核酮 糖和木酮糖的糖，和
[0138] -至少一种放线菌菌株。
[0139] 有利地，本说明书另外涉及一个组合，该组合包含：
[0140] _富氮的第一培养介质，和
[0141] -贫氮的第二培养介质，
[0142] 所述第一培养介质和第二培养介质包含作为主要碳源的丙三醇或C3-C5的糖，尤 其是选自甘油醛、赤藓糖、苏糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、二羟基丙酮、赤藓酮糖、核酮 糖和木酮糖的糖，和
[0143] -至少一种放线菌菌株。
[0144] 如前文中提到的，所述放线菌菌株尤其是脂肪生成菌株，尤其是链霉菌，尤其是选 自抗生链霉菌3137、波塞链霉菌、龟裂链霉菌2535、天蓝色链霉菌ATCC 19832、天蓝色链霉 菌ATCC 21666、天蓝色链霉菌变体Ml45、天蓝色链霉菌变体Ml45M1155、天蓝色链霉菌变体 M145M 1146、天蓝色链霉菌变体M145M1141、天蓝色链霉菌变体M145M1148、天蓝色链霉菌变 体]/[145]\11142和天蓝色链霉菌变体]\1145]\11144、31:代口1:〇1115^68 1;[1101111611818冊1^2936、脱叶 链霉菌、Streptomyces cealestius ATCC 15084、变铅青链霉菌1326、活力链霉菌、产二素 链霉菌OS MAROC J9和产二素链霉菌OS MAROC J5、网状链霉菌DSM 40776、微小链霉菌 2283FB、委内瑞拉链霉菌5110、诺尔斯链霉菌和Streptomyces cinabarinnus。
[0145] 本说明书还涉及通过放线菌生产脂质的方法，所述方法包括：
[0146] -在富磷酸盐和/或氮的第一介质中培养所述细菌的步骤，和
[0147] -在贫磷酸盐和/或氮的第二介质中培养所述细菌的步骤，
[0148] 所述第一培养介质和第二培养介质包含作为主要/首要碳源的丙三醇或C3-C5的 糖。
[0149] 有利地，本发明还涉及通过放线菌生产脂质的方法，所述方法包括：
[0150] -在富磷酸盐的第一介质中培养细菌的步骤，和
[0151] _在贫磷酸盐的第二介质中培养所述细菌的步骤，
[0152] 所述第一培养介质和第二培养介质包含作为主要/首要碳源的丙三醇或C3-C5的 糖。
[0153] 有利地，本说明书涉及通过放线菌生产脂质的方法，所述方法包括：
[0154] -在富氮的第一介质中培养所述细菌的步骤，和
[0155] -在贫氮的第二介质中培养所述细菌的步骤，
[0156] 所述第一培养介质和第二培养介质包含作为主要/首要碳源的丙三醇或C3-C5的 糖。
[0157] 有利地，本发明涉及如前文描述的方法，其中所述细菌为链霉菌科的放线菌。
[0158] 在一个有利的实施方案中，本发明涉及前文描述的方法，其中所述细菌为脂肪生 成细菌，特别是通过替换、删除或插入至少一个其基因组的核酸修饰基因以使比原始菌株 积累更多的脂质的细菌。
[0159] 另外，本发明还涉及可通过上文定义的方法获得的脂质组合物。
[0160] 可通过上文提到的方法获得的本发明的有利的组合物包含以下脂肪酸，或基本由 以下脂肪酸构成，或由以下脂肪酸构成：
[0161] -6.7% 至 7.7% 的异 C14:0，
[0162] -3.1% 至 4% 的 C14:l，
[0163] -9.8% 至 11% 的反异 C15:0，
[0164] -0.1% 至 0.7% 的 C15:0，
[0165] -61.5% 至 62.5% 的异 C16:0，
[0166] -0.5% 至 1.5% 的异 C16:l，
[0167] -3.1% 至 4% 的 C16:0，
[0168] -0.1% 至 7.7% 的 C16:l，
[0169] -0.5% 至 1.5% 的 C17:0，
[0170] -0.5% 至 1.5% 的 C17:l，
[0171] -1.1% 至 2.1% 的异 C17:0,和
[0172] -6.7% 至 7.7% 的反异 C17:0，
[0173]所述百分比基于所述组合物的总脂肪酸重量表示。
[0174]另外，在本发明的组合物中，所述脂肪酸主要为TAG的形式，也就是说至少50%的 脂肪酸为TAG形式。
[0175]在本发明中，所述脂肪酸在以下列出：
[0176] -12-甲基十三烷酸(异C14:0/异十四烷酸），
[0177] -十四烷酸(C14:l)，
[0178] -12-甲基十四烷酸(反异C15:0/反异十五烷酸），
[0179] -十五烷酸(C15:0)，
[0180] -14-甲基十五烷酸(异C16:0/异十六烷酸），
[0181] -14-甲基十五烷酸(异C16:l/异十六烷酸），
[0182] -十六烷酸(C16:0)，
[0183] -十六烷酸(C16:l)，
[0184] -15-甲基十六烷酸(异C17:0/异十七烷酸），
[0185] -十七烷酸(C17:0)，
[0186] -十七烷酸(C17:l)，和
[0187] -14-甲基十六烷酸(反异C17:0/反异十七烷酸）。
[0188] 另外，本发明涉及上文提到的方法用于制造润滑剂、表面活性剂、涂料(漆，油墨 等）、溶剂、食品成分或作为油脂化学合成中间体的用途。
[0189] 例如，可通过已知的酯交换方法获得生物柴油，例如在催化剂的存在下使用甲醇 对存在于本发明的组合物中或者本发明的微生物提取物中的甘油三酯进行酯交换的方法， 以获得脂肪酸的甲基酯和丙三醇。获得的生物柴油可以与化石来源的或纯的柴油混合作为 碳氢燃料。
[0190] 同样可通过氢处理生产生物煤油。该方法包括旨在消除存在于负载物中的氧以及 将它们转化成由链烷烃组成的部分的第一步骤，和所称述的脱羧路径，这生成了比原始脂 肪链少一个碳原子的碳氢化合物，并且伴随着C0和C0 2的生成。在所有的情况下，不饱和脂 肪链被完全氢化，并且甘油基团（groupement glycgrique)被转化成丙烷。另外，作为转移 和甲烷化反应的第二反应可以带来C0和甲烷的生成。关于通常用于氢处理的硫化物类型的 催化剂，清除氧(氢化和脱羧化）的两条路径共同存在。对应该加氢脱氧步骤的氢的消耗依 赖于起始油或动物脂肪的性质，尤其是每个链的不饱和度的平均数以及碳氢脂肪链（ ch.ajn.e.grasse hydrocarbonee)的长度。
[0191] 然后，异构化氢化裂解的步骤使石蜡柴油链断裂成为支化煤油和石脑油。柴油中 煤油的产率为大约60% (40%石脑油）。在现有技术中，原油中煤油的总产率为大约55%。
[0192]通过酯交换，或化学水解，或酶水解，和/或与其它化学方法相关的水解，还可由上 文提到的方法获得润滑剂，溶剂和表面活性剂或食品成分。
[0193] 这些技术的集合是本领域技术人员所公知的。
[0194] 本说明书还涉及由来源于放线菌的脂质制造生物碳氢燃料、润滑剂、表面活性剂、 涂料(漆，油墨等）、溶剂以及合成中间体的方法，所述方法包括：
[0195] -在富磷酸盐和/或氮的第一介质中培养所述细菌的步骤，和
[0196] -在贫磷酸盐和/或氮的第二介质中培养所述细菌的步骤，
[0197] 所述第一培养介质和第二培养介质包含作为主要碳源的丙三醇或C3-C5的糖。
[0198] 本发明还涉及由来源于放线菌的脂质制造生物碳氢燃料、润滑剂、表面活性剂、涂 料(漆，油墨等）、溶剂以及合成中间体的方法，所述方法包括：
[0199] -在富磷酸盐的第一介质中培养所述细菌的步骤，和
[0200] -在贫磷酸盐的第二介质中培养所述细菌的步骤，
[0201] 所述第一培养介质和第二培养介质包含作为主要碳源的丙三醇或C3-C5的糖。 [0202] 根据本发明的方法获得的脂质组合物可以通过使用在申请W02005093015中描述 的方法用于制造生物碳氢燃料。
[0203] 作为参考，由根据本发明的方法获得的组合物制造用作生物碳氢燃料或作为碳氢 燃料的组分的脂质组合物的方法包括所述过程：
[0204] -至少一个酯交换步骤，其中通过非均相催化使根据本发明方法获得的组合物与 至少一种选自甲醇和乙醇的单伯醇反应，以一方面提供至少一种起始甘油三酯的脂肪酸的 甲基酯和/或乙基酯，另一方面提供丙三醇，这些产品都不包含副产品；和
[0205] _ 一个醚化步骤，其中使所述丙三醇与至少一种具有4至12个碳原子的烯属烃反 应;和/或
[0206] --个缩醛化步骤，其中使所述丙三醇与至少一种选自醛、酮和醛或酮的缩醛衍生 物的化合物反应。
[0207] 可以设想两种催化类型以由非均相催化剂将植物油酯交换成甲基酯（乙基酯）：应 用固定床原理的批次反应器催化或连续催化。通常地，是在固定床上进行连续操作。
[0208] 上文提到的方法以实例的形式给出并且不被认为具有限制作用。本领域技术人员 将有能力在本领域一般知识的帮助下使用其它所有类似的方法。
[0209] 借助实施例和下文中的七个附图本发明将被更好地理解。
【附图说明】
[0210]图1示出了由菌株积累的TAG的百分比比例。测试菌株如下：A:抗生链霉菌3137J II，B:波赛链霉菌，C:龟裂链霉菌2535JII，D:天蓝色链霉菌变体M145M1155，E: S.lincolnensis NRRL 2936，F:脱叶链霉菌，G:除虫链霉菌 NRRL 8165(S.avermitilis NRRL 8165)，H:天蓝色链霉菌变体M145M1146，I:天蓝色链霉菌变体M145M1141J:天蓝色链 霉菌变体姐45111148，1( :5.〇63168^8 4了〇： 15084儿:变铅青链霉菌1326，]\1:天蓝色链霉菌 变体M145M1142，N:活力链霉菌，0:产二素链霉菌0S.MAR0C J 9，P:网状链霉菌DSIVI 40776，Q:产二素链霉菌05.MAR0C J 5，R:微小链霉菌2283FB，S:天蓝色链霉菌变体 M145M1144，T:天蓝色链霉菌M145，U:天蓝色链霉菌ATCC 19832，V:委内瑞拉链霉菌 5110JII，W:诺尔斯链霉菌，X:S.cinabarinnus ATCC 23617，Y:天蓝色链霉菌ATCC 21666， Z:委内瑞拉链霉菌ATCC 15439。
[0211] 图2A-C不出了通过野生变铅青链霉菌TK24(Streptomyces lidivans TK24sauvage)积累TAG。
[0212] 图2A示出了由孢子开始在R2YE介质上在丙三醇和无机磷酸盐(5mM)的存在下培养 48小时的变铅青链霉素菌丝体的电子显微镜照片。
[0213]图2B示出了源自图2A中描述的步骤的并且在新R2YE介质上在丙三醇和贫无机磷 酸盐(5mM)的存在下培养48小时的变铅青链霉素菌丝体的电子显微镜照片。
[0214] 图2C示出了源自图2A中描述的步骤的并且在新R2YE介质上在丙三醇和贫无机磷 酸盐(ImM)的存在下培养48小时的变铅青链霉素菌丝体的电子显微镜照片。
[0215] 积累的脂质的存在通过白色脂质泡囊的存在鉴别。
[0216] 图3示出了 TAG羰基带/蛋白质的酰胺I带的比率，其对应不同链霉菌菌株的相对于 干重的TAG百分比（1:天蓝色链霉菌M145，2:天蓝色链霉菌Ml 146，3:天蓝色链霉菌Ml 155，4: 抗生链霉菌，5:龟裂链霉菌），所述菌株在R2YE介质上在0.1M葡萄糖（白条）的存在下或0.2M 丙三醇（黑条)的存在下培养72小时。
[0217] 图4示出了TAG羰基带/蛋白质的酰胺I带的比率，其对应一种链霉菌菌株(变铅青 链霉菌TK24)的相对于干重的TAG百分比，所述菌株在不同的碳源(C3或C5)(l:丙三醇0.2M， 2:木糖0.17M，3:阿拉伯糖0.17M)的存在下在R2YE介质上培养72小时。采用相同的碳当量 量。
[0218]图5A-C表示了在葡萄糖、丙三醇或精制丙三醇存在下，在本发明的条件下积累的 脂质的脂肪酸的组成。
[0219]图5A示出了一种放线菌菌株在0M葡萄糖（白条）、0.1M葡萄糖（黑条)和0.2M丙三醇 (影线条)的存在下培养96小时之后所示每种脂肪酸的比例（以yg每mg干生物质表示）。 [0220]图5B示出了一种放线菌菌株在0M精制丙三醇（白条）、0.1M丙三醇（黑条)和0.2M丙 三醇(影线条)的存在下培养96小时之后所示每种脂肪酸的比例（以yg每mg干生物质表示）。 [0221]图5C示出了一种放线菌菌株在0M精制丙三醇（白条）、0.1M精制丙三醇（黑条）和 0.2M精制丙三醇(影线条)的存在下培养96小时之后所示每种脂肪酸的比例（以yg每mg干生 物质表示）。
[0222] 图6A-B例示了突变对于葡萄糖R2YE介质的脂质生产的有利效果。
[0223] 图6A示意性地示出了通过乙醛酸途径（主要存在于油料微生物中的途径）降解脂 质中涉及的基因。
[0224] 图6B示出了删除至少一个乙醛酸途径基因的变铅青链霉菌菌株中TAG的积累。
[0225] 图7示出了 TAG羰基带/蛋白质的酰胺I带的比率，其对应于链霉菌菌株(天蓝色链 霉菌M1155)的相对于干重的TAG百分比，所述菌株在包含葡萄糖（白柱)或丙三醇（黑柱)作 为碳源的介质上、在无蔗糖的R2YE介质上培养96小时，所述碳源的浓度为1. :18g/L，2.: 45g/L，3.:68g/L，4.:90g/L。 实施例：
[0226] 实施例1:培养介质
[0227] 如下的培养介质可以用于本发明的框架中。下文中描述的培养介质的全部有C3-C5的糖，葡萄糖或丙三醇作为补充：葡萄糖（10g/L或18g/L)或丙三醇（0.2mol/L和18.4g/ L)〇
[0228] HT培养介质:
[0229] 介质HT每升包含：lg酵母提取物(酵母提取物-Difco)，lg牛肉提取物(Difco)，10g 白糊精(Prolabo)，2g A型NZ胺，20mg CoC12.7H20〇
[0230] 改性的R2Y3培养介质:
[0231] K2S〇4( 1 ? 4 ? 10-3mol/L和 0，25g/L)MM= 174g/mol
[0232] MgCh ? 6H20(5.10-2mol/L和 10，12g/L)MM=203g/mol [0233]酪蛋白胺化酸(O.lg/L)
[0234] CaCl2 ? 2H20(2? 10-2mol/L和2? 94g/L)MM= 147g/mol
[0235] L-脯氨酸(2，6 ? 10-2mol/L 和 3g/L)MM= 115g/mol
[0236] TES缓冲液（2，5 ? 10-2mol/L和 5 ? 73g/L)MM = 2304g/mol
[0237] 微量元素（2mL/L)
[0238] 酵母提取物(5g/L)
[0239] Na0H(5.10-3mol/L和 0.2g/L)MM = 30g/mol
[0240] 微量元素 R2YE储备溶液：
[0241] ZnCl240mg/L；FeCl3 ? 6H20 200mg/L；CuCl2 ? 2H20 10mg/L；MnCl2 ? 4H20 lOmg/L； Na2B4〇7 ? IOH2O 10mg/L;(NH4)6M〇7〇24 ? 4H2〇10mg/L
[0242] 介质194合成介质:
[0243] TES 22.8mM；
[0244] 柠檬酸? H2O 2.0mM;
[0245] NaCl 2.2mM；
[0246] KH2P〇4ll.OmM；
[0247] (NH4)2S〇443.0mM;
[0248] MgS04 ? 7H20 1.7mM；
[0249] CaCl2.2H2〇0.2mM;
[0250] FeS04*7H20 137.6yM；
[0251] CuS〇4 ? 5H20 12.0處；
[0252] ZnS〇4 ? 7H20 11.7處；
[0253] MnS04 ? H20 33.9yM；
[0254] Na2MoO4.2H2Ol.6yM;
[0255] C0CI2 ? 6H2O 3.2處；
[0256] KI 1.5處；
[0257] A1C13 ? 6H20 1.3處；
[0258] H3B〇32.5yM；
[0259] NiCl2.6H2Ol.6yM;
[0260] 硫胺素 -HC1 21.0yM(7mg/L);
[0261] 生物素 1.2處(0.30mg/L);
[0262] 核黄素 5.0yM(2mg/L);
[0263] 泛酸?丐8 ? 4uM(2mg/L);
[0264] 叶酸 0.6yM(0.25mg/L);
[0265] 对氨基苯甲酸1.8處(0.25mg/L);
[0266] 盐酸吡哆醇9.7處(2mg/L);
[0267] 烟酰胺 16 ? 3yM(2mg/L);
[0268] 烟酸 0.5yM(0.625mg/L);
[0269] 消泡剂 204 100.0yL/L;
[0270] 普朗尼克 F68 10%0.5mL/L。
[0271] YEME培养介质:
[0272] 3g酵母提取物，5g细菌培养用蛋白胨，3g麦芽提取物，和5mM MgCl2。
[0273] DALP培养介质:
[0274]介质DALP每升包含：10g细菌培养用蛋白胨，5g酵母提取物和10g白糊精。将pH值调 整到7.0。
[0275] MP5培养介质:
[0276] 介质MP5每升包含:7g酵母提取物，5g NaCl，36ml丙三醇，和20.9g MOPS。将pH值调 整到7.5。
[0277] SL11培养介质:
[0278] 介质SL11 每升包含：25g白糊精，12.5g酵母提取物，lg MgS〇4，lg KH2P03,20.9g MOPS。将pH值调整到7.1。
[0279] 改性的YEME培养介质:
[0280]改性的YEME介质每升包含：3g酵母提取物，5g细菌培养用蛋白胨，和3g麦芽提取 物。
[0281] 实施例2:培养条件
[0282] 液体培养(50ml瓶，2L发酵罐)
[0283] 预培养物接种106孢子/mL并且在28°C、pH 7、搅拌速度180-200rpm(每分钟转速） 下培养48小时。
[0284] 培养物用占最终培养物体积2.5%的预培养物接种。所述培养物在28°C、pH 7、对 于瓶而言的180-200rpm下培养72-96小时(对于发酵罐而言:p0270 %，搅拌400-600rpm)。
[0285] 然后，得到的样品被离心，细菌沉淀在-80°C被冷冻并且被冻干以获得干物质。其 被用于通过FTIRS(傅里叶变换红外光谱)分析TAG的含量。
[0286] 固体培养(Petri培养皿)
[0287] 孢子形成介质（SFM:大豆粉20g，甘露醇20g，细菌培养用琼脂15g，足够量的自来水 1L)的第一Petri培养皿由孢子接种，以获得细菌垫。该Petri培养皿被培养5至10天直至菌 株孢子化。
[0288]所述培养皿由8mL R2YE介质组成，并覆盖玻璃纸。该培养皿借助一根小木棍接种。 20此水被置于所述玻璃纸上，先前接触过包含孢子化菌株的SFM培养皿的小棍被"新鲜孢 子"饱和然后被浸入R2YE培养皿中存在的20yL水中并且被涂抹在玻璃纸的整个表面上。然 后，培养皿在28 °C下，在黑暗处被培养72-96小时。
[0289]在培养结束后，所述细菌通过擦刮玻璃纸被回收然后在-80°C被冷冻并且被冻干 以通过FTIRS分析其干重及TAG含量。
[0290]实施例3:脂肪生成菌株
[0291] 发明人鉴定出了被认为是脂肪生成的链霉菌菌株，也就是菌株生产的TAG大于生 物质的20 %。
[0292] 结果在图1中示出。
[0293]实施例4:过度补偿丙三醇介质
[0294] 为了确定通过微生物积累的TAG的比例，发明人测试了变铅青链霉菌菌株。
[0295] 所述细菌被涂抹在包含丙三醇(0.2M)和5mM无机磷酸盐(Pi)的固体R2YE介质上的 玻璃纸的表面48小时。用电子显微镜观察细菌示出了其含有很少的脂质囊泡（图2A)。
[0296] 在48小时结束时，所述细菌被转移至包含丙三醇(0.2M)和5mM Pi(图2B)或ImM Pi (图2C)的新固体R2YE介质的表面。
[0297] 用电子显微镜的观察示出了所述经受了磷酸盐限制的细菌（由5mM转变为ImM Pi) 积累了很多TAG(过度补偿现象），而未经受这样限制（由5mM转变为5mM)的细菌不示出这样 的现象并且积累更少数量的TAG。
[0298]在氮过度补偿的范围内获得相似的结果。
[0299] 这样的结果用天蓝色链霉菌M1155菌株确认，如图7中所示。对于该菌株(M1155)， 观察到以剂量相关的方式，在R2YE/丙三醇上培养的细菌比那些在R2YE/葡萄糖上培养的积 累的TAG多。
[0300]实施例5:过度补偿丙三醇介质和葡萄糖
[0301]为了确认前述结果，发明人对比了在葡萄糖(0.1M)或丙三醇(0.2M)的存在下，不 同的链霉菌菌株在Pi过度补偿的条件下TAG的积累情况。
[0302] 结果在图3中示出。
[0303] 观察到不管使用什么菌株，根据本发明的方法培养的细菌都比在葡萄糖的存在下 培养的相同的细菌积累的TAG多。
[0304] 实施例6:过度补偿包含C5的糖的介质
[0305] 为了确认前述结果，发明人对比了在C5的糖(0.17mM)或丙三醇(0.2M)存在下，天 蓝色链霉菌在Pi过度补偿的条件下TAG的积累情况。
[0306]所述细胞被冻干然后被压碎以获得一种直接可由FTIR光谱仪分析的粉末，例如在 Dean et al.2010Bioresource Technology, 101(12) ,4499-4507中描述。
[0307] 结果在图4中示出。
[0308]观察到所述细菌能够积累大量的包含C5糖的TAG。
[0309]实施例7:过度补偿包含精制或非精制丙三醇的介质
[0310] 发明人还鉴定出了在粗制丙三醇（图5B)或精制丙三醇（图5C)的存在下，通过在本 发明的条件下培养细菌积累的脂肪酸的组成，所述丙三醇以〇至0.2M的浓度存在。在葡萄糖 的存在下的相同的培养被用作标准(图5A)。
[0311] 这些结果示出了在丙三醇源没有被精制时更多的积累。
[0312] 另外，这些结果示出了在细菌通过使用本发明的方法培养时积累的TAG具有大量 的异C16:0脂肪酸，并且在较小程度下不可忽视的量的反异C15:0。
[0313] 在非精制丙三醇存在下培养的细菌中以TAG形式积累的脂肪酸的量化如下：每 l〇〇g干生物质中：
[0314] 异C14:0:3.5g，
[0315] 异C14:l:1.75g，
[0316] 反异 C15:0:5g，
[0317] C15:0:0.1g，
[0318] 异C16:0:30g，
[0319]异 C16:l:0.5g，
[0320] C16:0：1.75g,
[0321] C16:l：0.25g,
[0322] 异C17:0:0.8g，
[0323] 反异 C17:0:3.5g，
[0324] C17:0:0.5g，和
[0325] C17:l：0.5g〇
[0326]实施例8:过度补偿包含丙三醇并且删除脂肪酸降解基因的介质
[0327] 为了提高细菌的TAG含量，发明人测试了修饰降解脂肪酸路径的影响。
[0328] 删除了不同的乙醛酸路径基因的细菌（天蓝色链霉菌M145)在丙三醇的存在下在 本发明的条件下被培养。
[0329] 结果在图6B中示出。
[0330] 观察到基因50)0981、50)0982、50)0983和50)0984(图68中的1(^4)删除的细菌比 不具有这些删除的细菌积累多直至200%的TAG。
[0331] 这些结果示出了根据本发明的方法，结合脂肪酸代谢路径的基因修饰，能够大大 提高细菌的脂肪酸积累。
【主权项】
1. 丙三醇或C3-C5的糖作为在培养放线菌细菌期间的主要碳源以通过所述细菌生产脂 质的用途，所述细菌在富磷酸盐的第一介质中培养，然后在贫磷酸盐的第二介质中培养。2. 根据权利要求1所述的用途，其中所述糖为丙糖、丁糖或戊糖。3. 根据权利要求1或2所述的用途，其中所述细菌为链霉菌属的放线菌。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述丙三醇选自精制丙三醇和非精制 丙二醇。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述细菌为脂肪生成细菌。6. 根据权利要求5所述的用途，所述脂肪生成细菌通过替换、删除或插入至少一个其基 因组的核酸被基因修饰，从而它们基本上不产生抗生素。7. 包含丙三醇或C3-C5的糖作为主要碳源的一个培养介质组，所述培养介质组包含： -富磷酸盐的第一培养介质，和 -贫磷酸盐的第二培养介质。8. -个组合，包含： -富磷酸盐的第一培养介质，和 -贫磷酸盐的第二培养介质， 所述第一培养介质和第二培养介质包含作为主要碳源的丙三醇或C3-C5的糖，和 -至少一种放线菌细菌的菌株。9. 通过放线菌细菌生产脂质的方法，所述方法包括： -在富磷酸盐的第一介质中培养细菌的步骤，和 -在贫磷酸盐的第二介质中培养所述细菌的步骤， 所述第一培养介质和第二培养介质包含作为主要/首要碳源的丙三醇或C3-C5的糖。10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述细菌为链霉菌科的放线菌。11. 根据权利要求9或10所述的方法，其中所述细菌为脂肪生成细菌，特别是通过替换、 删除或插入至少一个其基因组的核酸而修饰基因以使其基本上不产生抗生素的细菌。12. 脂质组合物，包含可通过例如权利要求9至11中任一项所述的方法获得的脂质。13. 根据权利要求9至11中任一项所述的方法用于制造润滑剂、表面活性剂、涂料、溶 剂、食品成分或油脂化学合成的中间体的用途。14. 由来源于放线菌细菌的脂质制造润滑剂、表面活性剂、涂料、溶剂、食品成分或油脂 化学合成的中间体的方法，所述方法包括： -在富磷酸盐的第一介质中培养所述细菌的步骤，和 -在贫磷酸盐的第二介质中培养所述细菌的步骤， 所述第一培养介质和第二培养介质包含作为主要碳源的丙三醇或C3-C5的糖。
【文档编号】C12N1/38GK105849250SQ201480046540
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2014年6月20日
【发明人】F·泰佛诺, M-J·威欧雷, T·杜勒莫, M·韦尔涅
【申请人】四月, 南巴黎大学