产l-异亮氨酸微生物和使用该微生物生产l-异亮氨酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及具有生产L-异亮氨酸的增强能力的微生物，并且涉及使用该微生物 生产L-异亮氨酸的方法。
【背景技术】
[0002] L-氨基酸是蛋白质的基本单元，并且被广泛地用作动物的功能性食品添加 剂和营养源，并且被广泛地用于制药工业。在20种氨基酸中，支链氨基酸由3个结构 单元（member)--L-缴氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸--组成，并且其工业价值正 逐步增加。据报道，支链氨基酸在维持和形成人骨骼肌、和行使调节胰岛素的功能、以 及维持和增加肌肉质量方面起到重要作用（Andrea tom等，（2006)The journal of nutrition, 136, 324s-330s)。特别地，L-异亮氨酸在肌肉中代谢以产生能量，并且参与血 红蛋白生产，并且减轻疲劳和促进生长。因而，它用于多种应用，其包括可注射流体和营养 物，并且它在运动营养食品中的应用也正与日倶增。
[0003] 为了工业化生产L-异亮氨酸，谷氨酸棒状杆菌被用作代表性微生物。此微生物 从作为前体的丙酮酸和2- 丁酮酸经由三种中间代谢物生产L-异亮氨酸（见图1)。从两 种前体合成2-乙酰基-2-羟基丁酸，并且由此合成2, 3-二羟基-3-甲基戊酸酯和2-酮 基-3-甲基戊酸酯，并且最终产生L-异亮氨酸。使用酶一一乙酰羟酸合酶、乙酰羟酸还原 异构酶（isomeroreductase)、二轻酸脱水酶和转氨酶--来生产每一个代谢物（Jin Hwan Park 等，Appl microbial biotechnol， （2010)85:491-506)。
[0004] 在谷氨酸棒状杆菌菌株中，在L-异亮氨酸生物合成步骤中重要的乙酰羟酸 合酶是由ilvBN基因编码的，并且经受最终产物L-异亮氨酸的反馈抑制，使得基因的 表达和酶的活性被抑制。另外，产生2-丁酮酸的苏氨酸脱氢酶也经受L-异亮氨酸的 反馈抑制。因而，已知的是，参与L-异亮氨酸生物合成的基因表达和酶活性的调控对 生成以高产量生产L-异亮氨酸的菌株是关键的（Jin hwan park等，Biotechnology journal, (2010)560-577)。另外，如图1中可见，通过相同的生物合成途径生产L-异亮 氨酸、L-缬氨酸和L-亮氨酸。因而，为了大量生产L-异亮氨酸，应该充分地供应用作 2_ 丁酮酸前体的L-苏氨酸，使得可以减少其它支链氨基酸的产生，并且可以持续地产生 L-异亮氨酸。在解决此问题的尝试中，据报道，α-氨基-β_羟基正缬氨酸和L-苏氨 酸衍生物可以用于增加 L-苏氨酸的生产（Cayo Ramos等，Applied and environmental microbiology, (1992) 1677-1682)。进一步，报道了将L-异亮氨酸生产能力赋予至具有生 产L-苏氨酸的能力的微生物的方法（韩国专利特开公布号2011-0058731)，同时至生产 L-苏氨酸和L-异亮氨酸的微生物的方法（韩国专利特开公布号2002-0013777)等等。同 样，据报道，4-硫杂异亮氨酸（thiaisoleucine)---种异亮氨酸衍生物的使用抑制了 苏氨酸脱水酶的反馈（John J. Wasmuth, Journal of bacteriology, (1973) 562-570)。而 且，据报道，对异亮氨酸-异羟肟酸耐受的突变菌株具有生产L-异亮氨酸的增强的能力 (M.Kisumi, Journal of general microbiology, (1971)69291-297)。另外，有 AHAS 的研究 与开发方法的报道，所述方法包括使产L-异亮氨酸菌株突变以与L-缬氨酸的生产相比增 加 L-异亮氨酸的生产（韩国专利特开公布号2011-0061780)，并且有集中于通过改变发酵 期间的氧供应或自然条件比如pH来增加 L-异亮氨酸的产量的研究的报道（Zhihian Peng 等，Bioprocess biosyst eng, (2010)33:339-345)。
[0005] 然而，至今已经研究和开发的产L-异亮氨酸微生物对L-异亮氨酸生物合成途径 中的一些物质单独地耐受。因而，仍存在开发对多种物质耐受的产L-异亮氨酸微生物的需 要，所述物质参与L-异亮氨酸生物合成中的反馈的控制。
[0006] 公开内容
[0007] 技术问题
[0008] 本发明人已经做了大量的努力来开发与现有菌株相比更好的产L-异亮氨酸微生 物，并且已经发现对α-氨基-β-羟基正缬氨酸（L-苏氨酸衍生物）、4_硫杂异亮氨酸和 异亮氨酸-异羟肟酸（异亮氨酸衍生物）耐受的突变菌株以高产量生产L-异亮氨酸，从而 完成本发明。
[0009] 技术方案
[0010] 本发明的目的是提供以高产量生产L-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌突变菌株。
[0011] 本发明的另一个目的是提供使用所述突变菌株生产L-异亮氨酸的方法。
[0012] 本发明的仍另一个目的是提供从谷氨酸棒状杆菌产生用于L-异亮氨酸的高产量 生产的突变菌株的方法。
[0013] 有益效果
[0014] 本发明的谷氨酸棒状杆菌突变菌株耐受L-异亮氨酸、L-苏氨酸和它们的衍生物， 并且因而不经受L-异亮氨酸的反馈抑制，并且被充分地供应为L-异亮氨酸的前体的L-苏 氨酸。因而，它具有生产L-异亮氨酸的增强的能力。因此，使用根据本发明的微生物生产 L-异亮氨酸的方法可以高效率和高产量地生产L-异亮氨酸。
[0015] 附图描述
[0016] 图1显示了包括本发明的最终产物一一L-异亮氨酸的支链氨基酸的生物合成途 径。如图1中所示，支链氨基酸使用相同的酶通过所述生物合成途径生产。
[0017] 最佳实施方式
[0018] 在一方面，本发明提供了用于生产L-异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌突变菌株 KCCMl1248Ρ。
[0019] 如本文所使用，术语"L-异亮氨酸"指的是必需氨基酸中的一种和具有L-缬氨酸 和L-亮氨酸的支链氨基酸中的一种，并且具有HO 2CCH (NH2) CH (CH3) CH2CH3的结构式。
[0020] 如图1中所示，在微生物中，从作为前体的丙酮酸和2- 丁酮酸通过4步生物合成 过程生物合成L-异亮氨酸。然而，所述生物合成步骤通常也用于其它支链氨基酸（即L-缬 氨酸和L-亮氨酸）的生物合成中，并且需要被充分地供应L-苏氨酸--L-异亮氨酸生物 合成所需的前体。为此，通过发酵大量生产L-异亮氨酸是困难的。本发明的突变菌株耐受 最终产物L-异亮氨酸、L-苏氨酸和它们的衍生物的反馈抑制，并且因而被充分地供应L-异 亮氨酸的前体。本发明的突变菌株是具有生产L-异亮氨酸的增强能力的新型微生物。
[0021] 具体地，本发明的突变菌株可以耐受L-异亮氨酸或其衍生物和L-苏氨酸或其衍 生物。更具体地，它可以耐受L-异亮氨酸衍生物和L-苏氨酸衍生物。
[0022] 如本文所使用，术语"衍生物"指的是可以在最终产物L-异亮氨酸或其前体L-苏 氨酸的生物合成中引起反馈抑制的已知化合物，所述反馈抑制可以减少L-异亮氨酸或 L-苏氨酸的产生。L-异亮氨酸衍生物的实例包括但不限于4-硫杂异亮氨酸（thiaile)和 异亮氨酸-异羟肟酸（ileHx)，并且L-苏氨酸衍生物的实例包括但不限于α -氨基-β -羟 基正缬氨酸（AHV)等等。具体地，突变菌株可以耐受选自4-硫杂异亮氨酸、异亮氨酸-异羟 肟酸和α-氨基-β-羟基正缬氨酸中的一种或多种。更具体地，突变菌株可以耐受4-硫 杂异亮氨酸、异亮氨酸-异羟肟酸和α -氨基-β -羟基正缬氨酸。
[0023] 众所周知的是，当L-异亮氨酸累积超过特定的浓度或效价时，细胞中L-异亮氨酸 的生物合成被抑制。相应地，耐受衍生物的菌株解除由L-异亮氨酸引起的反馈抑制，并且 因而甚至在包含高浓度的L-异亮氨酸的条件下具有生产L-异亮氨酸的能力。在本发明的 实例中，本发明人使用衍生物筛选生产高浓度的L-异亮氨酸的菌株。因为L-苏氨酸被用 作生产L-异亮氨酸的2-丁酮酸的前体，耐受L-苏氨酸的菌株解除由L-苏氨酸引起的反 馈抑制，使得L-苏氨酸充分地供应至其中。为此，L-苏氨酸衍生物也用于筛选生产高浓度 的L-异亮氨酸的菌株。
[0024] 根据本发明，通过使亲本菌株突变和筛选期望菌株而获得具有生产L-异亮氨酸 的增强能力的突变菌株。在本文中，微生物的诱变可通过本领域广泛已知的多种方法进行， 和使用物理或化学诱变方法中的一种进行。本发明中的化学诱变剂的实例包括但不限于 N-甲基-Ν' -硝基-N-亚硝基胍（NTG)、二乙氧基丁烷、乙基甲磺酸、芥子化合物（mustard compound)、肼、和亚硝酸盐。物理诱变剂的实例包括但不限于紫外光和γ-福射。
[0025] 在诱变中，在适当浓度下诱变剂影响亲本菌株，在该适当浓度下具有特定大小的 存活种群保留。所述大小可能不同，这取决于诱变剂的种类，并且所述大小取决于在存活种 群中的突变量，其由特定杀伤率下的突变剂引起。例如，当使用NTG时，可保留大约10-50% 的原始种群。当由亚硝酸盐进行诱变时，可保留大约〇. 01-0. 1 %的原始种群，并且当由紫外 光进行诱变时，可保留大约I. 〇%的原始种群。在本发明的实例中，为了构建具有生产L-异 亮氨酸的增强能力的突变菌株，NTG被用于诱导亲本菌株中的突变。
[0026] 在本发明的实例中，为了构建具有生产L-异亮氨酸的增强能力的突变菌株，产 谷氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC 11040(谷氨酸棒状杆菌KFCC 11040)(韩国专利特开公 布2000-0002407)被用作亲本菌株。在亲本菌株中进行随机诱变后，亲本菌株涂布在 补充L-异亮氨酸衍生物--比如4-硫杂异亮氨酸（thiaile)和异亮氨酸-异羟肟酸 (ileHx) 一一和L-苏氨酸衍生物一一比如α -氨基-β -羟基正缬氨酸（AHV) -一的基本 培养基上。筛选分别耐受lmM、lmg/ml和25mg/ml的浓度下的所有衍生物的突变菌株并 命名为"KCJI-38"。另外，表明了突变菌株中L-异亮氨酸的产生至少比在亲本菌株中高 13倍（见表1)。突变谷氨酸棒状杆菌菌株（谷氨酸棒状杆菌，KCJI-38)在2012年1月 9日以登录号KCCM11248P保藏于国际保藏机构--韩国微生物保藏中心（地址=Yurim Building, 361-221，Hon