专利名称：D－丙氨酸微生物制造方法
技术领域：
本发明涉及一种以消旋的丙氨酸为原料，利用微生物分解其中的L-丙氨酸，生产D-丙氨酸的方法。
背景技术：
D-丙氨酸是一种重要的手性有机化合物，主要应用于手性药物、药物中间体、食品添加剂等领域，在制药、食品行业作为手性合成的手性原料。作为一种结构最简单的具有光学活性的氨基酸，在某些手性化合物的不对称合成过程中具有不可替代的作用，目前主要用于生产新型广谱抗生素、D-丙氨醇、多肽、新型甜味剂阿力甜(Alitame)，其中合成新型甜昧剂阿力甜(Alitame)为该产品提供了巨大的市场空间。
已知的制取D-丙氨酸的技术方法主要有“生物发酵法”、“不对称化学合成法”、“氨基酸酰化酶拆分法”。其中“发酵法”生产周期长，设备投资大，有副反应，分离较复杂、污染大成本高；“不对称化学合成法”反应机制复杂，工艺过程长；需要纯手性试剂或贵金属络合物作催化剂，生产成本极高，以上两种方法不具备工业化应用价值，目前国内外工业化生产D-丙氨酸普遍采用“氨基酸酰化酶拆分法”，该法利用的氨基酸价格昂贵，生产成本仍然较高，只能用于小规模工业化生产。
由于D-丙氨酸的生理作用被不断发现，其应用越来越广泛，需要研究开发一种适合大规模工业工业化、能显著降低生产成本的技术。依据生物的不对称降解或同化作用机理，研究生产手性氨基酸的方法，是一个重要的方向。本发明也是基于此原理。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种生产过程简单，条件温和，能够大幅度降低生产成本的D-丙氨酸微生物制造方法。
其技术方案是一种D-丙氨酸微生物制造方法，具体步骤和特征如下1、含酶细胞悬液的制作采用摇瓶或发酵罐通风培养。摇瓶旋转速度为40-200转/分钟，1000毫升三角烧瓶装液量100-400毫升，培养时间12-48小时，培养温度25℃-40℃。发酵培养通风比1∶0.05V-1∶0.4V(液体体积∶每分钟通入的空气体积)，培养时间12-48小时，培养温度25℃-40℃。
培养基可以使用通常的碳水化合物作为碳源，如葡萄糖、蔗糖、淀粉、糊精、麦芽汁、糖蜜等；作为氮源可以单独或混合使用各种动物植物蛋白胨、豆饼水解液、硫酸铵、酵母提取物、玉米浆等；无机盐可以单独或混合使用氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等多种无机盐。此外培养基中加入大豆油、各种消泡剂，避免灭菌或培养过程中的起泡现象。培养基配制后用酸或碱调节PH值到4-7.5。然后用蒸汽110-121℃灭菌10--30分钟。
其中碳源的浓度为0-100g/L；氮源的浓度为0.5-50g/L；无机盐的浓度为0.1-10g/L。诱导物L-丙氨酸的浓度为0.1-200g/L。
本发明所筛选使用的微生物主要有假丝酵母和其他各种丝状真菌，也包括细菌中的大肠杆菌属、变形杆菌属和绿脓杆菌属等革兰氏阴性细菌，上述这些微生物都是好氧型的。利用的微生物酶主要有氨基酸氧化酶、丙氨酸转氨酶等。其中主要的酶氨基酸氧化酶活力最高可以达到每小时每克湿细胞催化分解2800μmolL-丙氨酸。这些酶可以单独提取出来使用，本发明主要是利用含有能够分解L-丙氨酸的酶系的全细胞培养液(发酵液)。当然，具有上述能够分解L-丙氨酸能力的微生物细胞也可以从发酵液中分离出来，用聚合胶包埋等方式固定化使用。
2、酶催化不对称降解反应将培养好的细胞悬液(发酵液)维持一定温度30-58℃，通入空气，通风比为1∶0.05V-1∶2V(液体体积∶每分钟通入的空气体积)。向液体中流加底物DL-丙氨酸，流加的DL-丙氨酸两种异构体的比例可以是任意的。反应体系中的氨基酸氧化酶特异性的氧化分解L-丙氨酸，并放出氨气，其中的D-丙氨酸很少或基本不参与反应。随着底物流加量的不断增加，反应液体的PH值会增加，影响反应的进行，可以通过加大通风量或加入硫酸等手段降低溶液PH值，维持最适宜的PH值在4.5-8.0。
3、产物提取分离反应过程D-丙氨酸的浓度不断增加，积累到一定程度，D-丙氨酸从反应体系中结晶出来，通过离心分离得到粗品，这是本发明的又一项重要创新。离心后的酶反应液可以回收反复套用多次，直到酶活力降低到没有利用价值。丧失酶活力的酶反应液中含有一定浓度的D-丙氨酸，这部分产品可以通过浓缩的方式结晶出来。每升上述发酵液可以生产D丙氨酸100-1500克。
4、D-丙氨酸的精制可以通过公知的活性炭脱色、过滤、重结晶等简单工艺进行。活性碳脱色温度60-80℃，脱色浓度8％-16％。脱色液透光率98.8％以上。脱色液用真空浓缩的方法减少水分，从而使D-丙氨酸结晶出来。离心或抽滤得到成品。
其技术效果是利用微生物产生的氨基酸氧化酶，不对称催化氧化分解底物DL-丙氨酸中的L-丙氨酸，而D-丙氨酸则很少或基本不参与反应，最终作为目标产物被提取出来。产品光学纯度高达99.8％、化学纯度高达99.7％；生产过程简单，条件温和，生产成本低。
实施例以下，用实施例对本发明进行说明，但本发明不受这些实施例的限制。实施例中使用的原料是旋光度为零的DL-丙氨酸。
实施例1配制含有蛋白胨20g/L，葡萄糖10g/L，氯化钠5g/L，玉米浆干粉18g/LL-丙氨酸5g/L，硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾1g/L的培养基1升，用氨水或硫酸调整PH值到7左右，分装入1000毫升三角烧瓶中，每瓶装液量250毫升。将上述培养基121℃高压灭菌15分钟。冷却到30℃，将保存在斜面上的假丝酵母用ф1mm接种环挑取一环接入上述培养基中。使用旋转震荡器，在30℃、110rpm下培养24小时。
合并上述细胞培养液1升，水浴升温至45℃，每分钟通入空气0.5升，流加DL-丙氨酸，用PH试纸检测氨气释放强度，反应连续进行40小时，累计加入DL-丙氨酸600g，停止加料，继续反应1小时。冷却至15℃，用抽滤的方法分离结晶出的D-丙氨酸粗品180g，抽滤液真空浓缩得D-丙氨酸粗品80g，合并粗品260g。粗品溶解于2升蒸馏水中，加热到80℃，加入6g活性碳脱色30分钟，抽滤。用旋转薄膜蒸发器真空浓缩结晶，得D-丙氨酸精制品230g，25℃母液190毫升。产品光学纯度99.5％，化学纯度99.6％。
实施例2配制含有蛋白胨20g/L，酵母膏20g/L，葡萄糖10g/L，氯化钠5g/L，玉米浆干粉18g/L，硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾1g/L的一级培养基150毫升，用氨水或硫酸调整PH值到7左右，分装入500毫升三角烧瓶中，每瓶装液量150毫升。将上述培养基121℃高压灭菌15分钟。冷却到37℃，将保存在斜面上的假丝酵母用ф1mm接种环挑去一环接入上述培养基中。使用旋转震荡器，在30℃，110rpm下培养16小时，得到一级种子细胞悬液400毫升。
配制含豆饼水解液20g/L(折干)，麦芽粉20g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠5g/L，玉米浆干粉5g/L，硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾1g/L、L-丙氨酸5g/L的发酵液10升，调整整PH值7左右，将上述培养基加到有效容积10升的发酵罐中，115℃高压灭菌15-20分钟。冷却至30℃，接入上述一级种子细胞悬液400毫升。每分钟通入无菌空气2升，培养24小时。
将上述发酵液体水浴升温至50℃，每分钟通入空气5升，流加DL-丙氨酸，反应连续进行48小时，累计加入DL-丙氨酸8000g，停止加料，继续反应1小时。冷却至15℃，用100目涤纶滤布过滤得D-丙氨酸粗品2400g。
滤液再加热至50℃，按上述方法继续流加DL-丙氨酸，随着反应时间的延长，反应速度降低，继续反应50小时，氨气析出量很少，用HPLC测量液体中的L-丙氨酸残留量低于0.5％时停止反应。第二次累计加入DL丙氨酸6000g，分离得D-丙氨酸粗品2900g。
第二次分离后的反应液真空浓缩得D-丙氨酸粗品900g，合并上述D-丙氨酸粗6200g，用实施例1的方法精制，得光学纯度99.8％、化学纯度99.7％的D-丙氨酸5952g。
权利要求
1.一种D-丙氨酸微生物制造方法，其特征在于1)分解L-丙氨酸的微生物细胞悬液的制作将碳源、氮源、无机盐、水和诱导物按比例配制培养基，用酸或碱将其PH值调节到4-7.5；然后，接入经筛选出来的能够产生分解L-丙氨酸酶的微生物，用旋转震荡器或发酵罐通风培养12-48小时，培养温度为25℃-40℃。2)酶催化不对称降解反应向培养好的细胞悬液液体中不断流加底物DL-丙氨酸，使反应体系中的氨基酸氧化酶特异性的氧化分解L-丙氨酸，并放出氨气，通过加大通风量或加入硫酸等手段降低溶液PH值，使溶液中的PH值维持在4.5-8.0；反应温度28-68℃。3)产物提取分离通过向转化体系中不断加入DL-丙氨酸，增加D-丙氨酸的浓度，使D-丙氨酸从反应体系中结晶出来，通过离心分离得到粗品；4)D-丙氨酸的精制粗品通过活性炭脱色、过滤、重结晶，即得精制的D-丙氨酸成品。
2.根据权利要求1所述的一种D-丙氨酸微生物制造方法，其特征在于所述培养基中的碳源为单独或混合使用的碳水化合物中的葡萄糖、蔗糖、淀粉、糊精、麦芽汁和糖蜜；氮源为单独或混合使用的各种动物植物蛋白胨、豆饼水解液、硫酸铵、酵母提取物和玉米浆；无机盐为单独或混合使用的氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾；所述的诱导物为L-丙氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的一种D-丙氨酸微生物制造方法，其特征在于所述碳源的浓度为0-100g/L；氮源的浓度为0.5-50g/L；无机盐的浓度为0.1-10g/L；诱导物L-丙氨酸的浓度为0.1-200g/L。
4.根据权利要求1所述的一种D-丙氨酸微生物制造方法，其特征在于所述能够产生分解L-丙氨酸酶的微生物为假丝酵母和其他各种丝状真菌，也包括细菌中的大肠杆菌属、变形杆菌属和绿脓杆菌属等革兰氏阴性细菌。
5.根据权利要求1所述的一种D-丙氨酸微生物制造方法，其特征在于所用原料DL-丙氨酸中的两种旋光异构体的比例可以是任意的；DL-丙氨酸是作为酶催化分解的底物，而不是培养基的成分；利用的是微生物全细胞进行催化分解反应。
全文摘要
D－丙氨酸微生物制造方法属生物技术领域。其所要解决的技术问题是提供一种生产过程简单、能够降低生产成本的D－丙氨酸微生物制造方法。其技术要点在特定的培养条件下培养微生物如假丝酵母，产生对L－丙氨酸具有强氧化能力的氨基酸氧化酶；以DL－丙氨酸为底物，流加进培养好的含有氨基酸氧化酶、L－丙氨酸转氨酶的细胞悬液中，通入空气，特异性地降解DL－丙氨酸中的L－丙氨酸脱去氨基分解；而D－丙氨酸则完全不参与反应，作为目标产物提取出来；通过不断流加底物，产物浓度增高，使D－丙氨酸在酶液中形成结晶体，直接分离，经过脱色、过滤、重结晶就可以达到精制提纯的目的。产品化学纯度和光学纯度高，制造成本低。
文档编号C12P41/00GK1884565SQ20061004068
公开日2006年12月27日 申请日期2006年5月29日 优先权日2006年5月29日
发明者黄建坡, 陈武军, 尹若春 申请人:安徽华恒生物工程有限公司