一种编码丙氨酸异构酶的基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种编码丙氨酸异构酶的基因及其 应用。
【背景技术】
[0002] 丙氨酸是构成蛋白质的20种基本氨基酸之一，是血中氮的优良运输工具，又是 一种有效生糖氨基酸。D-丙氨酸包含于大的有机组织中，作为细胞壁肽壁糖或肽抗生素。 D-丙氨酸是一种非天然氨基酸，一种重要的有机手性源，主要应用于手性药物、手性添加 剂、手性助剂等领域，在制药及食品行业作为手性合成的手性源。目前D-丙氨酸主要用于 生产新型广谱抗生素、D-丙氨醇、多肽合成过程的丙氨酸保护剂、食品添加剂以及化妆品。 同时D-丙氨酸
[0003] 也广泛应用在功能性食用甜味剂方面。D-丙氨酸是合成二肽甜味剂阿力甜的一 种重要的原料。今年的研宄还发现D-丙氨酸的新的生理活性的应用。D-丙氨酸可使体内 氨基酸氧化酶（DAAO)在肿瘤细胞质中异位表达，阻止体内脂质氧化损伤，清除细胞毒性。 D-丙氨酸还可以抑制致癌物质二甲基亚硝胺（DMNA)，抑制效果为72. 4。
[0004] 目前D-丙氨酸的制备方法主要为化学合成法，通过化学合成得到DL-丙氨酸的混 旋体，再利用各种光学拆分方法得到D-丙氨酸。目前工业上生产DL-丙氨酸的方法主要是 由乙醛为原料与氰化钠，氯化铵，氨作用合成2-氨基丙腈，再经过水解后制得DL-丙氨酸。 然后在DL-丙氨酸消旋混合物的饱和溶液中加入D-丙氨酸晶种和少量表面活性剂，控制浓 度和温度，使两种对映体的结晶速度产生差异，D-丙氨酸优先析出结晶。
[0005] 但迄今，无论采用何种化学合成法制备D-丙氨酸，都有工艺流程长、步骤多、副产 物去除过程复杂，收率低，成本高且易污染环境等缺点，从而限制了D-丙氨酸的生产和市 场推广。因此，研宄开发一种工艺路线短、成本低的D-丙氨酸生产方法变得十分迫切和必 要。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为了克服上述技术的不足，提供了一种编码丙氨酸异构酶的基因 克隆及其表达，进而开发出一种工艺路线短、成本低的D-丙氨酸生产方法。
[0007] 基于昆虫和节肢动物蜕皮机理的研宄，从酵母CDNA文库中克隆一种新的编码丙 氨酸异构酶的基因（以下简称maf)，并在真核细胞中表达。该丙氨酸异构酶能催化L-丙氨 酸消旋，直接转化L-丙氨酸为D-丙氨酸。这样的结果，十分有利于下一步研宄高酶活、低 成本的异构酶制造方法，从而开发一种新的生物法合成D-丙氨酸工艺路线，降低D-丙氨酸 生产成本。
[0008] 本发明解决问题所采用的技术方案：
[0009] 本发明提供一种编码丙氨酸异构酶的基因，是从已构建的酵母cDNA文库中获得， 其核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示。
[0010] 本发明获得的丙氨酸异构酶为丙氨酸异构酶基因表达产物，该酶由399个氨基酸 组成，其分子量为46880.577730&，氨基酸序列如3￡〇10勵:2所示。
[0011] 本发明提供一种由表达质粒和编码丙氨酸异构酶的基因重组而得的重组表达质 粒。
[0012] 优选的是，所述重组表达质粒为真核表达质粒pPICZaA。
[0013] 本发明还提供一种由重组表达质粒转化宿主菌而得的基因工程菌。
[0014] 本发明还提供了一种利用编码丙氨酸异构酶基因制备丙氨酸异构酶的方法，其特 征在于：包含以下步骤：
[0015] (1)克隆编码丙氨酸异构酶的基因；
[0016] (2)将编码丙氨酸异构酶基因与表达质粒连接构建重组表达质粒；
[0017] (3)将重组表达质粒线性化与纯化；
[0018] (4)将纯化后的重组表达质粒转化受体菌，筛选后获得基因工程菌；
[0019] (5)将基因工程菌诱导表达，纯化鉴定后获得丙氨酸异构酶。
[0020] 优选的是，步骤4)中所述的受体菌为毕赤酵母X-33。
[0021] 优选的是，步骤（5)中所述的基因工程菌利用甲醇进行诱导表达。
[0022] 优选的是，所述甲醇添加至终浓度为0. 5% (v/v)。
[0023] 本发明还提供了丙氨酸异构酶在D-丙氨酸生产中的应用，其特征在于：所述丙氨 酸异构酶能转化L-丙氨酸为D-丙氨酸，其酶解反应条件是在温度37°C下反应12h。
[0024] 与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：
[0025] 1、本发明是从酵母中获取丙氨酸异构酶基因。
[0026] 2、本发明涉及到该丙氨酸异构酶基因克隆、与之相对应的氨基酸序列及其在受体 菌毕赤酵母X-33中的表达，该表达酶可以转化L-丙氨酸为D-丙氨酸，为生物法合成丙氨 酸异构酶提供了一种新的方法。
[0027] 3、本发明提供的丙氨酸异构酶能转化L-丙氨酸为D-丙氨酸的酶解法简单高效， 可实现一步酶法转化L-丙氨酸为D-丙氨酸，既提高其转化效率、缩短D-丙氨酸的工艺路 线，又减少环境污染；由于L-丙氨酸来源广泛，还能降低生产成本。
【附图说明】
[0028] 本发明涉及酵母丙氨酸异构酶的基因克隆与表达，将结合附图简要说明：
[0029] 图1为重组质粒Pmll、Xbal双酶切和PCR鉴定图，是以重组克隆载体为模板进行 ?〇?扩增，回收产物和？？扣2&4分别经过？11111和乂6 &1进行双酶切，其结果通过0.8%琼脂 糖凝胶电泳检测；其中，M为Maker AHindIII;第1-4孔为Pmll/Xbal酶切质粒；第5孔为 MakerDL2000 ;第6-9孔为PCR重组产物。
[0030] 图2为重组子在毕赤酵母X-33中表达图，是用含空pPICZaA载体的重组菌作为空 白对照，经诱导表达后提取菌体蛋白，经12%SDS-PAGE分析；其中，M为蛋白分子量标记； 第1孔为阴性对照液；第2-8孔分别为重组maf诱导24、36、48、60、72、84、96h后的结果。
[0031] 图3为标品D-丙氨酸高效液相色谱图，检测条件为：手性柱（5ym， 150mmX4. 6mm)，流动相甲醇体积为分数为33%，磷酸氢二钠浓度为0. 01mol/L，PH= 6. 0， 柱温30°C，流速1.OmL/min，UV检测波长254nm。
[0032] 图4为酶促反应液高效液相色谱图，是将酶促反应液预处理后采用用高效液相色 谱法检测反应结果，其检测条件为：手性柱（5ym，150_X4. 6_)，流动相流动相甲醇体积 为分数为33%，磷酸氢二钠浓度为0. 01mol/L，PH= 6. 0,柱温30°C，柱温30°C，流速1.OmL/ min，UV检测波长254nm。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不 局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此 夕卜，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同 样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
[0034] 实施例:
[0035] 1、文库来源和质粒
[0036] 酵母cDNA文库和pPICZaA均由本实验室保存。
[0037] 2、主要试剂
[0038]表达宿主菌P.pastorisX-33 (野生型）、抗生素Zeocin均购自invitrogen公司。 Pm11酶和Xbal酶均购自TaKaRa生物工程公司。
[0039] 3、方法
[0040] 3.1、基因的克隆与测序
[0041] 以自行设计的引物进行PCR扩增，上游引物：5-GCGCACGTG ATGCTACTGGAACAGAITTGGG-3，下游引物为 5-GCGTCTAGAGCCCAGTCAAAAAITGAITITGCTT-3。采 用25yL的反应体系：10Xbuffer2. 5yL，dTNP0? 5yL，正反向引物各0? 5yL，cDNA模板 0. 5yL，RTaq酶 0. 25yL，补水至 25yL。PCR条件