酶催化高浓度β-氨基丙腈水解制备β-丙氨酸的方法
【专利摘要】本发明涉及酶催化高浓度β-氨基丙腈水解制备β-丙氨酸的方法。更具体的，本发明提供了一种利用腈水解酶及其基因工程菌或结合天冬氨酸氨裂解酶及其基因工程菌将高浓度β-氨基丙腈水解成β-丙氨酸的方法，所述的β-丙氨酸广泛应用于合成泛酸和泛酸钙、肌肽、帕米膦酸钠、巴柳氮等医药或饲料及食品添加剂。本方法具有底物浓度高、反应条件温和、无污染和工艺路线简单等显著特点。
【专利说明】酶催化高浓度β-氨基丙腈水解制备β-丙氨酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物催化制备药物中间体和绿色化学领域，涉及利用腈水解酶基因工 程菌、培养物、或者加工制品或结合天冬氨酸氨裂解酶催化高浓度β-氨基丙腈水解制备 β-丙氨酸的方法。
【背景技术】
[0002] β -丙氨酸广泛应用于合成泛酸和泛酸钙、肌肽、帕米膦酸钠、巴柳氮等医药或饲 料及食品添加剂。获得丙氨酸的途径可由丝胶、明胶、玉米蛋白等物质水解、精制而得， 但原料来源有限，成本高。目前工业上主要通过化学方法生产，但化学合成法需要强酸或强 碱等参与反应，对设备要求较高，且需要排放大量的高盐废水，对环境不友好，而且收率不 商。
[0003] 近年来，生物催化由于环境友好、反应条件温和、污染少、选择性高等优点引 起广泛关注。及川利洋等曾经报道了利用产腈化合物转化酶的微生物催化β_氨基 丙腈水解合成β _丙氨酸的方法，微生物sp. 0ΜΤ-ΜΥ14, JcAroffioAacier xerosi IFO12668, Pseodonocardia thermophlia ATCC19285, Aminobacter aminobrance ATCC23314等能够催化β-氨基丙腈水解生成β-丙氨酸，其中微生物577 .0MT-MY14的催化效果最佳，β-丙氨酸浓度达到3.3 g/L (JP特开平10-042886 A， 1998-2-17)。郑裕国等报道了 TPAot/ococci/s G20 以 1.0% 的 β-氨基丙臆为 底物，湿菌体量为70 g/L，反应5小时后，β -丙氨酸浓度能达到7. 0 g/L (食品与发酵工 业，2008,34(04): 11-19)。
[0004] 目前已报道的利用微生物催化水解β -氨基丙腈生成β -丙氨酸的方法，底物浓 度较低，难以实现工业化。
【发明内容】
[0005] 本发明中提供了一种产腈水解酶的基因工程菌，以及利用该酶或菌体催化高浓度 氨基丙腈水解生成丙氨酸的方法。同时利用天冬氨酸氨裂解酶将反应产生的氨转 化为L-天冬氨酸，从而有效降低副产物β -氨基丙酰胺的生成及废物氨的排放，同时可以 副产L-天冬氨酸。
[0006] 本发明中所述的产腈水解酶的基因工程菌，具体的构建方法是：设计上游引物（5' -3'）TCGCATATGATGGATAGCAACCGACCG，下游引物（5，-3'）TTTGGATCCTCAATTGCGCGCGCGAACG， 从办rAizoAia? USDA 110中扩增blr3397基因，构建到能表达外源基因的 质粒载体中：PET系列质粒、pTXBl系列、pGEX系列、pETduet系列、pTYB系列；然后接种到 能表达外源基因的宿主菌中：BL21系列、Rosetta系列、Origami系列、Tuner系列；并对基 因工程菌进行发酵培养，实现了腈水解酶的高效异源表达。
[0007] 用于本发明的腈水解酶可以是上述腈水解酶基因工程重组菌的培养物，也可以是 通过将培养基离心后得到的菌体细胞或其加工制品。其中加工制品指的是菌体得到的提取 物、破碎液、或者对提取物腈水解酶进行的分离和/或纯化得到的分离产品，或者通过固定 化提取物或者加工制品的固定化制品。
[0008] 将所述产腈水解酶的基因工程菌或产天冬氨酸氨裂解酶的基因工程菌经种子培 养基培养，按一定比例接种到发酵培养基，培养一定时间后，加入诱导剂IPTG或乳糖或二 者混合物诱导培养一定时间，离心收集菌体。
[0009] 反应体系的构建： 体系一、将一定量的β-氨基丙腈溶于一定量的水中，加6 Μ盐酸调pH至特定值，配置 成一定浓度、一定pH的溶液，加入一定量的产腈水解酶基因工程菌或纯酶，在一定温度下 转化4?8小时，反应完全后经分离纯化后得到β -丙氨酸及β -氨基丙酰胺。
[0010] 体系二、将一定量的氨基丙腈溶于一定量的水中，加富马酸(粉末）调pH至特 定值，配置成一定浓度、一定pH的溶液，加入一定量的产腈水解酶基因工程菌或纯酶及产 天冬氨酸氨裂解酶基因工程菌或纯酶，在一定温度下转化3?8小时，反应完全后经分离纯 化后得到β -丙氨酸及L-天冬氨酸。
[0011] 本发明所述的pH值优选能够保持在腈水解酶可以表达其活性的pH范围内，优选 pH值为6. 0?10. 0。反应温度优选保持在腈水解酶可以表达其活性的温度范围内，优选 20 ?50 ?。
[0012] 本发明所述的底物浓度没有限制，通常底物为140?280 g/L。
[0013] 本发明所述的催化剂是静息细胞时，其用量为50?100 g/L。
[0014] 本发明所述的腈水解酶可以催化氨基丙腈水解生成丙氨酸，若结合天冬 氨酸氨裂解酶则可以减少副产物β -氨基丙酰胺的生成，并且可以减少氨的排放，同时可 以副产L-天冬氨酸，其化学反应方程式为：
【权利要求】
1. 一种酶催化高浓度β-氨基丙腈水解制备β-丙氨酸的方法，其特征在于通过腈水 解酶及天冬氨酸氨裂解酶催化水解高浓度β-氨基丙腈得到β-丙氨酸及L-天冬氨酸，包 括如下步骤： a) 将腈水解酶基因工程菌在发酵培养基中，进行扩增培养，并进行诱导产生目的蛋白 后，进行离心收集菌体； b) 利用富马酸将β-氨基丙腈水溶液的pH调至适当值，然后加入腈水解酶与天冬氨酸 氨裂解酶，于一定温度下反应一定时间；反应完全后灭菌从反应体系中收集上层清液，利用 强阳离子交换树脂及强阴离子交换树脂分离纯化得β -丙氨酸及L-天冬氨酸； c) 利用盐酸将β -氨基丙腈水溶液的pH调至适当值，然后加入腈水解酶，于一定温度 下反应一定时间；反应完全后灭菌从反应体系中收集上层清液，利用强阳离子交换树脂分 离纯化得β-丙氨酸及β-氨基丙酰胺混合物。
2. 如权利要求1所述的方法a)步骤其特征在于所述的腈水解酶是从 USDA110中扩增blr3397基因，构建到质粒载体中，得到blr3397腈水解酶的高 表达基因工程菌。
3. 如权利要求1所述的方法a)步骤产腈水解酶的基因工程菌，其特征在于所述的能高 效表达外源基因的质粒为下列之一 ：pET系列质粒、pTXBl系列、pGEX系列、pETduet系列、 pTYB系列；高效表达外源基因的宿主菌为下列之一：BL21系列、Rosetta系列、Origami系 列、Tuner系列。
4. 如权利要求1所述的方法b)及c)步骤中，其中所述腈水解酶或天冬氨酸氨基裂解 酶是完整的微生物细胞、微生物细胞萃取物、硫酸铵粗纯的酶、经纯后纯度较高的酶、或固 定在载体上的酶催化剂形式。
5. 如权利要求1所述的方法b)及c)步骤，其特征在于所述的反应条件：温度为20? 50°C，优选25?30°C ;所述的pH为6. 0?10. 0,优选pH为7. 5 ;反应时间为3-8小时。
6. 如权利要求1所述的转化方法b)及c)步骤，其特征在于所述的β-氨基丙腈的浓 度为 140 ?280 g/L，优选 210 g/L。
【文档编号】C12P13/06GK104195193SQ201410456080
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月10日 优先权日:2014年9月10日
【发明者】姚培圆, 吴洽庆, 袁京, 韩超, 冯进辉, 朱敦明, 马延和 申请人:中国科学院天津工业生物技术研究所