专利名称：：甜菜碱对丙氨酸氨基转移酶的稳定作用及丙氨酸氨基转移酶校准品组合物的制作方法
技术领域：
：本发明属于临床生物化学酶学检验及质量控制领域，特别涉及甜菜碱对丙氨酸氨基转移酶的稳定作用及丙氨酸氨基转移酶校准品组合物。
背景技术：
：血清丙氨酸氨基转移酶(AlanineAminotransferas，ALT)是临床生化最常用的肝功能检测项目，在肝病防治中起了积极作用。为保证检测结果的准确性，ALT校准品质控品起着重要作用，而校准品质控品中ALT酶活性的稳定性就成为重点。但ALT的活性因受时间和贮存温度等多种因素的影响会发生明显变化，尤其在高温天气，酶活力每小时下降几个单位。目前，国内外比较常用的ALT的稳定剂多为糖醇类如海藻糖等。但这些稳定剂的添加会使检测系统产生不同程度的基体效应((matrixeffect)，从而影响检测结果。甜菜碱(betaine)又名三甲基甘氨酸，化学名称为三甲氨基乙内酯，作为一种渗透剂(osmolyte)在自然界中广泛存在。StefanKn即p等人(StefanK，Extremophiles[J]，1999)的研究表明甜菜碱能影响RNaseA的去折叠热动力学参数从而稳定蛋白酶的天然折叠状态，DominicLambert等(DominicLambert，J.Mol.Biol[J]，2007)研究发现甜菜碱等渗透剂能稳定RNA的二级与三级结构，并稳定RNA-Mg2+的相互作用。本发明提供甜菜碱稳定血清酶ALT酶活性的稳定作用。目前，国内各个公司提供的检测试剂盒从试剂组成、血清和试剂的用量比例、单双试剂、检测程序等都会有所不同，造成病人样品检测结果的不一致，给疾病的诊断、治疗、疗效观察、预防、科研等工作带来了不利的影响。为了使酶测定结果在方法间，实验室间有可比性，消除参考范围的多重混乱，以利于临床应用，开展酶测定的标准化工作势在必行。由于校准品在检测体系中基体效应的存在，故目前公认病人新鲜血清才是最好的校准品。由于人血清中ALT酶活性的不稳定，给新鲜血清的运输和保存形成了极大的不便。本发明另一目的是提供了一种以甜菜碱为稳定剂的ALT血清校准品组合物。
发明内容本发明所要解决的技术问题之一是提供一种稳定血清ALT酶活力的稳定剂甜菜碱，即甜菜碱对谷丙转氨酶的稳定作用。本发明所要解决的另一技术问题是提供一种以甜菜碱为稳定剂的ALT血清校准品组合物，其特征在于所述校准品组合物包括人血清与甜菜碱，甜菜碱浓度为lmol/L。甜菜碱对人血清中ALT酶活力有较好的稳定作用，37t:添加甜菜碱的血清可稳定48小时，25t:添加甜菜碱的血清可稳定4天，这样的稳定效果可很好满足在常温或夏季的高温下短期运输血清的需要；4t:添加甜菜碱的血清可稳定4周、-201:添加甜菜碱的的血清可稳定4个月。血清中的添加剂对各检测系统会产生不同程度的基体效应(matrixeffect)，但基体效应有绝对性也有其相对性，只要经方法学比较认可某基体效应可被忽略不计或由基体效应对某检测系统引入的误差在可接受水平即可认为"无"基体效应。在临床常用的几个检测体系中进行实验，本发明提供的校准品组合物在检测体系中无明显基体效应。本发明所提供的校准品组合物有很好的稳定效果，尤其是高温下的短期稳定作用，且其在常用的检测系统中未见明显集体效应，适合用于临床实验室ALT检测的各检测体系的校准。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1稳定实验先配制5mol/L的甜菜碱贮存液；将收集的血清进行混合得到原混合血清，将部分混合血清中加入5mol/L的甜菜碱贮存液，使得添加的稳定剂甜菜碱终浓度为lmol/L，得到添加甜菜碱的血清；原混合血清与添加甜菜碱的血清分别用0.22um的滤器过滤，将两种血清以每管300ul分装入EP管并用parafilm膜封管，原血清为对照血清。分装的血清管分别于37。C水浴lh，3h，5h，16h，24h，48h，25。C室温放置l_4d，7d及14d，4。C冷藏l-4w及6w，于-2(TC冷冻l-6m。BeckmancoulterCX9自动生化分析仪分别检测其ALT酶活力，每个检测三次求均值。以95%的可信区间作为酶活力(A%)稳定的判断标准，即酶活力为100±5%为酶活力稳定。结果显示，37t:添加甜菜碱的血清可稳定48h，对照血清只能稳定3h;25t:添加甜菜碱的血清可稳定4d，对照血清只能稳定ld;4t:添加甜菜碱的血清可稳定4w，对照血清lw后酶活力已降至81%;-2(TC添加甜菜碱的血清可稳定4m，对照血清lm后酶活力已降至79%。见表l。表1甜菜碱在不同温度对ALT酶活力的稳定作用37°C25'C4°C-20'Ct(h)A%+甜菜碱A%对照柳A%+甜菜碱A%对照t(w)A%+甜菜碱A%对照t(m)A%+甜菜碱A%对照0h1001000d1001000w1001000m100100lh9898ld9898lw9881lm9979<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>实施例2基体效应实验1.根据美国临床化学标准委员会(NCCLS)文件EP14-A方案进行实验。以Beckman-Coulter公司检测系统(BC)和3家常用试剂(分别用WK、KH、FH表示)一日立仪器检测系统为被评价方法，3家常用试剂又分别用校准品CFAS和K值校准，所以被评价方法为7个检测系统(BC，WK-C，KH-C，FH-C，WK-K，KH-K，FH-K);以罗氏公司试剂一日立仪器检测系统为比较方法，用比较方法和被评价方法检测40个患者血清样品，添加了lmol/Lbetiane的三个血清(高、中、低浓度)样本随机穿插一起测定，然后再重复测定2批，每批均作校准，3批检测均在一天内完成，用质控品做室内质控。2.按照NCCLS文件EP14-A方法进行数据处理。回归直线的f估计值，的95%可<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>2其中_为回归线上的预期估计值，n为患者样本数，SY/X为回归线的标准误，《为第i个患者样本比较方法测定结果的均值，"为第i个患者样本被评价方法测定结果的均值，f为所有样本比较方法测定结果的均值的均值，t(O.975,38)=2.0252。结果(1)7个被评价系统和比较系统进行患者样品比对，回归处理后得相关系数(r)、斜率(b)、截距(a)，以r>0.975为判断标准，b接近1.0，a接近0。结果显示7个被评价系统和比较系统均有较好的相关性。结果见表2。表27个被评价系统和比较系统进行患者样品比对实验的相关性<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(2)3个添加了lmol/L甜菜碱的血清样本在7个被评价系统和比较系统中进行基体效应比较，所得数据按照NCCLS文件EP14-A方法进行处理，结果显示添加了甜菜碱的3个样本的值均在回归直线的F估计值，的95X可信区间内，即其在7个被评价系统和比较系统中均无明显基体效应。结果见表3。表33个添加甜菜碱样本在7个被评价系统和比较系统中的基体效应<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求甜菜碱对丙氨酸氨基转移酶的稳定作用。2.—种以甜菜碱为稳定剂的丙氨酸氨基转移酶校准品组合物，其特征在于所述校准品组合物包括人血清与甜菜碱，甜菜碱浓度为lmol/L。3.根据权利要求2所述的校准品组合物，其特征在于所述组合物在37t:丙氨酸氨基转移酶活力稳定48小时。4.根据权利要求2所述的校准品组合物，其特征在于所述组合物在25t:丙氨酸氨基转移酶活力稳定4天。5.根据权利要求2所述的校准品组合物，其特征在于所述组合物在4t:丙氨酸氨基转移酶活力稳定4周。6.根据权利要求2所述的校准品组合物，其特征在于所述组合物在_201:丙氨酸氨基转移酶活力稳定4月。全文摘要本发明涉及甜菜碱对丙氨酸氨基转移酶ALT的稳定作用及谷丙氨酸氨基转移酶校准品组合物。丙氨酸氨基转移酶校准品组合物包括人血清与甜菜碱，甜菜碱浓度为1mol/L。本发明所提供的校准品组合物丙氨酸氨基转移酶ALT有很好的稳定效果，尤其是高温下的短期稳定作用，且其在常用的检测系统中未见明显集体效应，适合用于临床实验室丙氨酸氨基转移酶ALT检测的各检测体系的校准。文档编号C12N9/10GK101775380SQ20101010961公开日2010年7月14日申请日期2010年2月11日优先权日2010年2月11日发明者唐立萍,居漪,欧元祝,王美娟,虞啸炫申请人:上海市临床检验中心