一种自抛光型酶基防污涂料的制备方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于海洋生物污损防护技术领域，设及一种自抛光型酶基防污涂料的制备 方法，取哲基硅油改性丙締酸树脂为成膜物，采用碳纳米管吸附固定的从海水中纯化培养 的多糖水解酶和从典型污损生物石灰虫外壳纯化培养的两种蛋白酶作为防污物质的防污 组合物。
【背景技术】：
[0002] 海洋污损对船舶和海洋人工设施造成严重的危害，影响其航行速度、燃油经济性 和安全性，增加保养和维修成本，因此必须采用有效措施防止海洋生物对其造成的污损附 着。传统的有机锡防污涂料因严重危害海洋生态环境，已被禁止使用；目前广泛使用的含氧 化亚铜、硫氯酸亚铜类防污涂料由于会导致海洋铜元素累积，造成严重的海洋生态环境问 题，在一些国家如加拿大和瑞典已被限制使用并面临禁用的趋势。因此，开发环境友好型海 洋防污涂料具有重要意义。
[0003] 目前，微生物源防污酶作为天然防污活性物质，可通过降解固着生物的黏附剂、 瓦解生物膜基质、阻断群体反应信号传递、甚至酶催化产生杀声剂而表现出高效的生物活 性。酶基防污涂料已成为防污领域研究与应用热点。Pettitt等人研究了包括脂肪酶、纤 维素酶、葡萄糖、淀粉酶、混合酶等24种酶的防污效果，其中丝氨酸蛋白酶在防止绿藻抱子 和藤壶幼虫附着方面具有最佳效果。公开号为CN102137900A的专利公开了一种气凝胶中 包埋生物活性剂和酶的防污组合物；公开号为CN102083919B的专利公开了一种包含第一 酶和包封的第二酶的防污组合物，采用0-半乳糖巧酶、肤酶、葡糖淀粉酶及其混合物作 为第一酶，选包封于娃酸盐中自氧化酶为第二酶；公开号为CN10230795她的专利公开了 基于酶的自抛光涂料组合物，其包括W粘合剂系统形式的粘合剂相和色素相，所述色素相 包括多糖和能辅助所述多糖水解的酶，酶可为葡萄糖淀粉酶，且多糖可为淀粉；公开号为 CN103819983A的专利公开了一种由高分子树脂、辣椒素、蛇床子素、高凹顶藻醇等防污计和 蛋白酶组成的防污涂料；公开号为CN101284956B的专利公开了一种从藤壶、贻贝中分离纯 化获得蛋白酶产生菌及其蛋白酶基防污涂料的制备方法；另外丹麦的Biolocus公司已开 发出多种应用与海洋防污的酶制剂并与J0TUN公司合作生产了酶涂料，该种涂料已在快艇 上推广应用；GE肥CORE公司和肥MP化公司合作开发了基于己糖酶和过氧化氨酶联合生产 过氧化氨进行防污的防污涂料，但该些现有技术普遍存在各种技术和应用方面的缺陷。
【发明内容】
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[0004] 本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，寻求设计一种自抛光型酶基防污涂 料的制备方法，该酶基防污涂料不含有重金属污染物，对环境友好且防污效果良好。
[0005] 为了实现上述目的，本发明方法包括多糖水解酶与蛋白酶产生菌的分离纯化培 养、防污活性酶制剂制备和酶基防污涂料制备=个步骤：
[0006] (1)、多糖水解酶与蛋白酶产生菌的分离纯化培养包括两个方面
[0007] ①、多糖水解酶产生菌的分离纯化与培养，在200ml2216E液体培养基中加入50ml 天然海水，于30°C下富集培养4她，然后将菌液在琼脂培养基上进行划线分离并于25°C下 培养72h，用接种针挑取显著水解琼脂的菌落在培养基上进行进一步分离纯化，直到细胞 菌落形态稳定一致，得到多糖水解酶产生菌；采用2216E液体培养基，控制培养基的盐度为 3-4%、抑值为7. 0-9. 0,在25-35°C下培养7-15天，获得含有多糖水解酶的培养液；
[000引②、石灰虫源蛋白酶产生菌的分离纯化与培养，将从潮间带取得的石灰虫外壳在 无菌条件下礙碎，放入250ml2216E液体培养基中于30°C下富集培养4她，然后将菌液在 酪蛋白琼脂培养基上进行划线分离并于25°C下培养72h，用接种针挑取显著水解酪蛋白 (水解圈）的菌落在培养基上进行进一步分离纯化，直到细胞菌落形态稳定一致，得到2 株蛋白酶产生菌即甜C-1和甜C-2 ;SCH-1采用2216E液体培养基，控制培养基的盐度为 0. 5-1. 5%、抑值为7. 0-8. 0,在30-40°C下培养7-10天，获得含有蛋白酶的培养液；SCH-2 采用22166液体培养基，控制培养基的盐度为0.5-1.5%、抑值为7.0-8.5，在25-351：下培 养7-10天，获得含有蛋白酶的培养液；
[0009] (2)、防污活性酶制剂制备
[0010] 将源于海水菌株的多糖水解酶和源于石灰虫外壳菌株的两种蛋白酶均采用相同 的分离纯化工艺，将含有多糖水解酶的培养液和含有蛋白酶的培养液分别在冷冻离屯、机中 于3500rpm/min条件下离屯、40min，取上清液并用硫酸锭饱和溶液盐析，盐析液静置4她后 于8000rpm/min转速下离屯、40min，将离屯、获得的沉淀物通过水相层析纯化，并吸附于碳纳 米管中，减压冷冻干燥后分别制得相应的防污活性酶制剂；
[0011] (3)、酶基防污涂料制备
[0012] 选用已公开专利化200810014220. 4 -种哲基硅油改性丙締酸树脂作为自抛光型 成膜物，其结构式为：
[001 引
【主权项】
1. 一种自抛光型酶基防污涂料的制备方法，其特征在于制备方法包括多糖水解酶与蛋 白酶产生菌的分离纯化培养、防污活性酶制剂制备和酶基防污涂料制备三个步骤： (1) 、多糖水解酶与蛋白酶产生菌的分离纯化培养包括两个方面 ① 、多糖水解酶产生菌的分离纯化与培养，在200ml2216E液体培养基中加入50ml天然 海水，于30°C下富集培养48h，然后将菌液在琼脂培养基上进行划线分离并于25°C下培养 72h，用接种针挑取显著水解琼脂的菌落在培养基上进行进一步分离纯化，直到细胞菌落形 态稳定一致，得到多糖水解酶产生菌；采用2216E液体培养基，控制培养基的盐度为3-4%、 pH值为7. 0-9. 0,在25-35°C下培养7-15天，获得含有多糖水解酶的培养液； ② 、石灰虫源蛋白酶产生菌的分离纯化与培养，将从潮间带取得的石灰虫外壳在无菌 条件下碾碎，放入250ml2216E液体培养基中于30°C下富集培养48h，然后将菌液在酪蛋白 琼脂培养基上进行划线分离并于25°C下培养72h，用接种针挑取显著水解酪蛋白（水解圈） 的菌落在培养基上进行进一步分离纯化，直到细胞菌落形态稳定一致，得到2株蛋白酶产 生菌即SHC-1和SHC-2 ;SCH-1采用2216E液体培养基，控制培养基的盐度为0. 5-1. 5%、pH 值为7. 0-8. 0,在30-40°C下培养7-10天，获得含有蛋白酶的培养液；SCH-2采用2216E液 体培养基，控制培养基的盐度为〇. 5-1. 5%、pH值为7. 0-8. 5,在25-35°C下培养7-10天，获 得含有蛋白酶的培养液； (2) 、防污活性酶制剂制备 将源于海水菌株的多糖水解酶和源于石灰虫外壳菌株的两种蛋白酶均采用相同的分 离纯化工艺，将含有多糖水解酶的培养液和含有蛋白酶的培养液分别在冷冻离心机中于 3500rpm/min条件下离心40min，取上清液并用硫酸按饱和溶液盐析，盐析液静置48h后于 8000rpm/min转速下离心40min，将离心获得的沉淀物通过水相层析纯化，并吸附于碳纳米 管中，减压冷冻干燥后分别制得相应的防污活性酶制剂； (3) 、酶基防污涂料制备 选用已公开专利ZL200810014220. 4 -种羟基硅油改性丙烯酸树脂作为自抛光型成膜 物，其结构式为：
式中X1、X2为H或CH3 ;R为C1-C7的烷基链；m为2-12的自然数，n为1-3的自然数;A为0元素或NH2基团；R1、R2均为C1-C7的烷基链；所述的自抛光型酶基防污涂料由各原料 按重量百分比选取羟基硅油改性丙烯酸树脂55-70%，松香3. 5-8%，有机膨润土 1-3%，碳 纳米管固定多糖水解酶10-15%，碳纳米管固定SCH-1蛋白酶5-10%，碳纳米管固定SCH-2 蛋白酶10-15 %和以BYK-163润湿分散剂为0. 5-2 %的助剂组成；该自抛光型酶基防污涂料 制备时，在搅拌状态下向羟基硅油改性丙烯酸树脂溶液中加入松香、有机膨润土，搅拌均匀 后再加入防污活性酶制剂和助剂，将上述物质通过高速分散机分散均匀即制得自抛光型酶 基防污涂料。
2. 根据权利要求1所述的自抛光型酶基防污涂料的制备方法，其特征在于所述多糖水 解酶分解琼脂测试过程为用接种针蘸取多糖水解酶产生菌培养液在琼脂培养基上进行划 线，于25°C下培养3天，观察琼脂培养基分解情况。
3. 根据权利要求1所述的自抛光型酶基防污涂料的制备方法，其特征在于所述SCH-1 蛋白酶和SCH-2蛋白酶分解酪蛋白测试过程为用接种针蘸取SCH-1蛋白酶产生菌和SCH-2 蛋白酶产生菌培养液在酪蛋白培养基上进行划线，于25°C下培养3天，观察酪蛋白分解情 况。
4. 根据权利要求1所述的自抛光型酶基防污涂料的制备方法，其特征在于所述自抛光 型酶基防污涂料抑制典型污损生物藤壶幼虫附着测试过程为将本发明实施例5-7制备的 自抛光型酶基防污涂料涂刷于5cmX5cm的马口铁片上，涂刷市售的不含防污剂且不具有 自抛光性能的丙烯酸树脂为对照试样，每种涂料3个平行样；涂料干燥后，将试样片置于直 径9cm的培养皿中，加入30ml天然海水，每个培养皿中放入50只活泼的藤壶附着期幼虫， 在黑暗处培养48h，观察酶基防污涂料抑制典型污损生物藤壶幼虫附着情况。
【专利摘要】本发明属于海洋生物污损防护技术领域，涉及一种自抛光型酶基防污涂料的制备方法，包括多糖水解酶与蛋白酶产生菌的分离纯化培养、防污活性酶制剂制备和酶基防污涂料制备，多糖水解酶与蛋白酶产生菌分离纯化培养包括多糖水解酶产生菌与石灰虫源蛋白酶产生菌的分离纯化与培养，防污活性酶制剂制备是将源于海水菌株的多糖水解酶和石灰虫外壳菌株的两种蛋白酶采用相同的分离纯化工艺制得相应的防污活性酶制剂；酶基防污涂料制备是选用已公开专利一种羟基硅油改性丙烯酸树脂作为自抛光型成膜物制得自抛光型酶基防污涂料；其工艺过程简便，生产成本低，所制备的防污涂料基于生物拮抗效应防污，环境友好，具有较好的防止海洋生物的附着作用。
【IPC分类】C09D7-12, C12N9-50, C09D5-16, C12N9-24, C09D133-08
【公开号】CN104774519
【申请号】CN201510204218
【发明人】王利, 蔺存国
【申请人】中国船舶重工集团公司第七二五研究所
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年4月24日