本发明涉及化合物萃取及分离纯化领域，具体而言，涉及一种有机锡分子印迹聚合物微球，固相萃取柱及其应用。
背景技术：
有机锡是一类含锡的金属有机化合物，广泛应用于工业、农业、纺织业及船舶制造业等众多领域，主要用做PVC稳定剂、木材防腐剂、防污涂料、农业杀虫剂、纺织品防腐剂等，由于这些物质在食物链富集作用下对生物体有很高的毒性，具有造成机体内分泌紊乱、神经系统疾病等危害，有机锡化合物被国际化学品安全规划署(IPCS)和经济合作与发展组织(OECD)的环境激素联合专家委员会认定为具有雄性激素样作用的内分泌干扰物(EEDs)。有机锡化合物作为重要的持久性有毒物质(PTS)之一，其污染问题已经引起国际社会的广泛关注，众多国家都相继制定相应的法规对其禁用或限制使用，但因其在塑化剂、杀虫剂和防腐剂等产品中的优良性能，使有机锡在这些领域依然持续使用，如农药杀虫剂毒菌锡和三唑锡等良好的杀虫作用、食品包装材料中有机锡化合物具有良好的稳定作用等。这些有机锡化合物可能会随着土壤地膜、灌溉、农作物、包装材料的迁移和残留到农产品中，增加了这些农产品的质量安全风险。大量实验证明，有机锡类化合物特别是三环有机锡通过食物链迁移可以危害人体健康，产生一系列显著的病理变化和临床症状。
近年来，欧盟、EPA等组织和国家纷纷规定了不同基质中的有机锡限量标准，如欧盟规定在所有地表饮水中TBT的最大允许环境限量标准(MAC-EQS)为0.0015μg/L，对有机锡检测方法提出了很高要求。目前，有机锡化合物的分析方法主要有气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)串联原子吸收(AAS)、微波等离子体发射光谱(MIP-AED)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)等。由于有机锡化合物的种类较多，理化性质存在一定的差别，其提取、衍生和测定等方法仍面临挑战。每种分析方法都具有各自的优缺点，气相色谱及联用方法均需要对前处理进行衍生化，耗费大量的时间，而对于苯基有机锡化合物其衍生化产率低，且不稳定。虽然HPLC无须衍生化，但烷基取代的有机锡化合物缺乏发色基团不能实现多种有机锡的检测，与其串联ICP/MS方法只能检测所有原子态的锡，无法排除无机锡的干扰。有学者建立了LC-MS/MS方法，但只能对三取代有机锡进行分离和检测，尚不能对二取代有机锡进行同时检测。
当前，痕量有机锡化合物的分离分析技术属于环境和食品安全领域的前沿课题。除了缺乏同步确证检测技术以外，开发新型高效富集分离和选择性较高的样品前处理方法能够为开展复杂基质中有机锡化合物的检测和安全性评价提供关键技术支撑。减少有机试剂用量，简化实验步骤，提高富集和分离效率是当前有机锡化合物前处理技术发展的核心。分子印迹前处理技术是以与目标分子具有高度识别的分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers，MIPs)为固定相进行的色谱分离技术或者作为固相萃取材料进行富集和纯化，其显现出许多独特的优点，如分子识别性强、固定相制备简便快速、操作简单、溶剂消耗量小、模板和MIP都可以回收再利用等。目前，分子印迹技术已经广泛应用生物工程、临床医学、环境监测、食品工业等众多领域，特别是在样品前处理、固相萃取、色谱柱、传感器等方面显示出了独特的优势。目前分子印迹材料在样品前处理中的应用局限于单一目标物，大都需要分批制备几种分子印迹聚合物来实现富集多种目标物，从而增加了提取次数和成本，并不符合当前多残留检测技术的要求。截至目前，尚未见一次同时富集多种有机锡的分子印迹聚合物的报道。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种有机锡分子印迹聚合物微球，所述的分子印迹聚合物微球可以实现对有机锡化合物进行的专一性识别、分离、富集和纯化；利用该有机锡分子印迹聚合物微球作为填料可制成固相萃取柱，本发明还提供了所述的固相萃取柱在检测有机锡化合物中的应用。
本发明还提供了一种所述有机锡分子印迹聚合物微球的制备方法，此方法制备的MIP对印迹分子有良好的选择性和识别特性，操作条件简单，便于普及。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种有机锡分子印迹聚合物微球，所述分子印迹聚合物微球以二丁基氯化锡和二苯基氯化锡为模板分子、甲基丙烯酸为功能单体、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯为交联剂、偶氮二异丁腈为引发剂在惰性溶剂中反应后脱除模板分子而得到；
可选的，所述惰性溶剂包括二氯甲烷和乙腈组成的混合溶剂。
本发明通过双模板法选择二丁基氯化锡(DBT)和二苯基氯化锡(DPT)，合成了具有高度“类”特异性、选择性的分子印迹聚合物微球(MIP)，同时可由此实现对二取代有机锡的检测。
功能单体的选择对于分子印迹聚合物的吸附性能有很大影响，需要根据模板分子的结构和基本性质进行选择。本发明选用了甲基丙烯酸(MAA)作为功能单体，可非常好的提高合物对模板分子的识别作用。
为了使生成的印迹聚合物具有一定的空间网络结构和稳定的结合位点，分子印迹聚合物要求的交联度很高。本发明所优选的三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)具有较高的交联度(70～90％)，且在预聚合溶液中具有良好的溶解性。
在分子印迹聚合反应中多为自由基引发反应，因此在反应时需加入引发剂引发聚合反应，本发明优选偶氮二异丁腈(AIBN)作为引发剂。偶氮二异丁腈是油溶性的偶氮引发剂，偶氮类引发剂反应稳定，是一级反应，没有副反应，比较好控制。
致孔剂实际也起着溶剂的作用。溶剂的选择在分子印迹制备中发挥着重要作用，对分子间的作用力和MD的形态影响很大，且起着致孔剂的作用。通常选择的溶剂要具备以下3个条件：1)、能溶解模板分子和功能单体；2)、能形成大的流通孔；3)、对模板分子与功能单体之间的相互作用干扰小。一般根据印迹分子与功能单体间可能的作用力类型选择适宜极性的溶剂，溶剂的极性越大，对分子识别的干扰也就越大，吸附率就越低。本发明所采用的二氯甲烷和乙腈极性小，介电常数低，同时对几种反应物的溶解性也非常好。
可选的，如上所述的有机锡分子印迹聚合物微球，所述二丁基氯化锡和所述二苯基氯化锡的摩尔比为1:1。
可选的，如上所述的有机锡分子印迹聚合物微球，所述二丁基氯化锡与所述甲基丙烯酸的摩尔比为1:(5～7)。
可选的，如上所述的有机锡分子印迹聚合物微球，所述微球的粒径≤5μm。
如上所述的有机锡分子印迹聚合物微球的制备方法，包括：
将所述模板分子、功能单体、交联剂和引发剂溶解在惰性溶剂中，随后通惰性气体除氧，热引发聚合反应得到块状聚合物，再经研磨、筛分、洗脱以及干燥后即得。
本发明的聚合方法为本体聚合法，特点是原理和制备方法简单。
可选的，如上所述的有机锡分子印迹聚合物微球的制备方法，将所述模板分子、功能单体、交联剂和引发剂溶解在惰性溶剂中时，先将所述模板分子以及功能单体溶解在惰性溶剂中并预聚合25～35min后，再加入所述交联剂和引发剂。
可选的，如上所述的有机锡分子印迹聚合物微球的制备方法，所述热引发聚合反应的反应条件为55～65℃聚合反应22～26h。
一种固相萃取柱，所述固相萃取柱以如上所述的有机锡分子印迹聚合物微球为填料。
如上的固相萃取柱在检测有机锡化合物中的应用。
可选的，如上所述的应用，所述有机锡化合物包括二丁基氯化锡、三环锡、三唑锡、二苯基氯化锡、三丁基锡、三苯基锡。
为表述方便，以下将固相萃取柱简称为SPE，将填充有有机锡分子印迹聚合物微球的固相萃取柱简称为MISPE柱。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)、首次将甲基丙烯酸(MAA)做为功能单体，采用本体聚合法制备有机锡化合物分子印迹聚合物，以此聚合物为填料制成的MISPE柱，解决了传统固相萃取柱的吸附普遍性、洗脱复杂性、重复使用的缺点，实现了分子印迹聚合物和固相萃取柱的技术集成。
2)、吸附类特异性，由于SPE常用的吸附剂主要选择性较差，在富集分析物的同时，大量基体和干扰物质也被富集，导致洗脱液中仍含有基体和杂质，干扰最后的色谱分析。同时，市场上的MISPE柱只能特异性吸附一种物质，而当前研制的固相萃取小柱，由于采用了双模板法，具有能高度的选择性和吸附性以及类特异性，实现了以分子印迹聚合物同时吸附和富集多种同类药物的固相萃取技术的应用。
3)、方便快捷，采用MISPE柱进行样品前处理，步骤简单，且分离、富集、净化效果好。
4)、环保，MISPE柱前处理技术有机溶剂使用量少，符合当前环保的要求。
5)、回收利用，在MIP的制备中使用的模板分子可以回收利用，减少成本。
6)、本发明通过对溶剂、功能单体、交联剂、引发剂的种类和用量进行选择，优化聚合条件，制得具有更好的粒径分布、物理稳定性、优良的吸附性能的分子印迹聚合物，能够选择性识别与模板分子结构类似的六种有机锡化合物，具有良好的“类”特异性。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
一种有机锡分子印迹聚合物微球，所述分子印迹聚合物微球以二丁基氯化锡和二苯基氯化锡为模板分子、甲基丙烯酸为功能单体、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯为交联剂、偶氮二异丁腈为引发剂在惰性溶剂中反应后脱除模板分子而得到。
基于MIPs以上特点和有机锡化合物检测的实际需要，采用本体聚合法，通过双模板法选择DBT和DPT，合成了具有高度“类”特异性、选择性的分子印迹聚合物微球，并以此为填料开发出适用于特异性吸附有机锡化合物的MISPE通用小柱，实现了6种有机锡化合物的多残留高效富集和检测。
截至目前，尚未见以DBT和DPT为模板，甲基丙烯酸为功能单体，二氯甲烷和乙腈为溶剂，AIBN为引发剂，TRIM为交联剂制备有机锡化合物MISPE柱的报道。
因此，本发明以DBT和DPT两种相似结构化合物为模板，MAA为功能单体，二氯甲烷和乙腈为溶剂，AIBN为引发剂以及TRIM为交联剂，采用本体聚合法合成对6种有机锡化合物有较高吸附性能的MIP，以此MIP作为填料制成的MISPE柱对可用于样品中痕量有机锡化合物的检测，其方法简便快捷，回收率高。此方法是将固相萃取柱的方便和分子印迹聚合物的特异性结合起来达到样品前处理快速、简便的目的。
优选的，所述惰性溶剂包括甲苯、二氯甲烷、乙腈、氯仿中的一种或多种；更优选的，所述惰性溶剂包括二氯甲烷和乙腈组成的混合溶剂；
优选的，所述乙腈的加入量为50～80mL。
优选的，如上所述的有机锡分子印迹聚合物微球所述二丁基氯化锡和所述二苯基氯化锡的摩尔比为1:1。
优选的，如上所述的有机锡分子印迹聚合物微球，所述二丁基氯化锡与所述甲基丙烯酸的摩尔比为1:(5～7)；更优选的，所述二丁基氯化锡与所述甲基丙烯酸的摩尔比为1:6；
进一步优选的，所述模板分子中，二丁基氯化锡和二苯基氯化锡在所述惰性溶剂中的浓度各为0.1mmol～0.3mmol，更优选为0.2mmol；所述甲基丙烯酸在所述惰性溶剂中的浓度为0.6mmol～1.8mmol，更优选为1.2mmol。
优选的，所述三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯在所述惰性溶剂中的浓度为0.6mmol～1.8mmol，更优选为1.2mmol。
优选的，所述偶氮二异丁腈在所述惰性溶剂中的浓度为0.18mmol～0.30mmol，更优选为0.25mmol。
优选的，所述微球的粒径≤5μm；更优选的粒径≤3μm；更优选的粒径≤1μm。
本领域技术人员可根据本发明提供的分子印迹聚合物、模板分子、功能单体、交联剂种类选用本体聚合法、沉淀聚合法、悬浮聚合法、电聚合法；最优选的，采用本体聚合法，该方法包括：
将所述模板分子、功能单体、交联剂和引发剂溶解在惰性溶剂中，随后通惰性气体除氧，热引发聚合反应得到块状聚合物，再经研磨、筛分、洗脱以及干燥后即得；
优选的，所述惰性气体为氮气。
优选的，如上所述的有机锡分子印迹聚合物微球的制备方法，将所述模板分子、功能单体、交联剂和引发剂溶解在惰性溶剂中时，先将所述模板分子以及功能单体溶解在惰性溶剂中并预聚合25～35min后，再加入所述交联剂和引发剂；进一步优选的，所述预聚合时，反应的条件为室温下，在震荡器中震荡25～35min，所述震荡器的振荡频率为200转/分。
优选的，所述热引发聚合反应的反应条件为55～65℃聚合反应22～26h。
一种固相萃取柱，所述固相萃取柱以如上所述的有机锡分子印迹聚合物微球为填料。
优选的，所述有机锡分子印迹聚合物微球填充在固相萃取柱内时填充量为5mg～50mg，更优选的为20mg～40mg。
如上所述的固相萃取柱在检测有机锡化合物中的应用。
优选的，如上所述的应用，所述有机锡化合物包括二丁基氯化锡、三环锡、三唑锡、二苯基氯化锡、三丁基锡、三苯基锡。
优选的，如上所述的应用，其检测有机锡化合物时的具体操作包括：
将待测物预处理后过固相萃取柱，随后用水淋洗，再用10％～20％的乙酸甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，氮气吹干供检测；优选的，所述检测的方法为高效液相色谱法。
其中，在本发明中，10％的乙酸甲醇溶液的含义为乙酸和甲醇体积比为1:9的混合溶液；同理，20％的乙酸甲醇溶液的含义为乙酸和甲醇体积比为2:8的混合溶液。
实施例1
本实施例提供了一种有机锡分子印迹聚合物微球的制备方法，及其作为填料制备的MISPE柱的应用。
A)、将二丁基氯化锡(DBT)和二苯基氯化锡(DPT)的双模板分子和0.14mL甲基丙烯酸(MAA)溶于2mL二氯甲烷中，再加入一定量的乙腈，在震荡器中震荡预作用25min；
其中，DBT和DPT在最终的惰性溶剂体系中的终浓度各为0.1mmol；所述甲基丙烯酸的终浓度为0.7mmol；
B)、向A)中的混合液中加入0.1825mL TRIM(终浓度0.6mmol)和40.0mg AIBN充分混匀。室温下超声5min、充氮气除氧10min之后密封；
C)、55℃恒温水浴加热26h，冷却、离心、过筛，弃去上清液，得到沉淀物，再将沉淀物自然干燥；
D)、用10％的乙酸甲醇溶液洗脱模板分子，直至用高效液相色谱检测不到模板分子；
将洗脱去除模板分子的粉末置于干燥箱中烘干，得到有机锡分子印迹聚合物微球，其为白色，粒径≤5μm；
E)、称取30mg聚合物均匀装填于固相萃取柱中得到MISPE柱。
实施例2
本实施例提供了一种有机锡分子印迹聚合物微球的制备方法，及其作为填料制备的MISPE柱的应用。
A)、将二丁基氯化锡(DBT)和二苯基氯化锡(DPT)的双模板分子和0.3mL甲基丙烯酸(MAA)溶于2mL二氯甲烷中，再加入一定量的乙腈，在震荡器中震荡预作用35min；
其中，DBT和DPT在最终的惰性溶剂体系中的终浓度各为0.3mmol；所述甲基丙烯酸的终浓度为1.5mmol；
B)、向A)中的混合液中加入0.5475mL TRIM(终浓度1.8mmol)和40.0mg AIBN充分混匀。室温下超声5min、充氮气除氧10min之后密封；
C)、65℃恒温水浴加热22h，冷却、离心、过筛，弃去上清液，得到沉淀物，再将沉淀物自然干燥；
D)、用10％的乙酸甲醇溶液洗脱模板分子，直至用高效液相色谱检测不到模板分子；
将洗脱去除模板分子的粉末置于干燥箱中烘干，得到有机锡分子印迹聚合物微球，其为白色，粒径≤4μm；
E)、称取30mg聚合物均匀装填于固相萃取柱中得到MISPE柱。
实施例3
本实施例提供了一种有机锡分子印迹聚合物微球的制备方法，及其作为填料制备的MISPE柱的应用。
A)、将二丁基氯化锡(DBT)和二苯基氯化锡(DPT)的双模板分子和0.24mL甲基丙烯酸(MAA)溶于2mL二氯甲烷中，再加入一定量的乙腈，在震荡器中震荡预作用30min；
其中，DBT和DPT在最终的惰性溶剂体系中的终浓度各为0.2mmol；所述甲基丙烯酸的终浓度为1.2mmol；
B)、向A)中的混合液中加入0.365mL TRIM(终浓度1.2mmol)和40.0mg AIBN充分混匀。室温下超声5min、充氮气除氧10min之后密封；
C)、60℃恒温水浴加热24h，冷却、离心、过筛，弃去上清液，得到沉淀物，再将沉淀物自然干燥；
D)、用10％的乙酸甲醇溶液洗脱模板分子，直至用高效液相色谱检测不到模板分子；
将洗脱去除模板分子的粉末置于干燥箱中烘干，得到有机锡分子印迹聚合物微球，其为白色，粒径≤5μm；
E)、称取30mg聚合物均匀装填于固相萃取柱中得到MISPE柱。
实验例
量取3mL添加浓度为10μg/kg的6种有机锡化合物黄瓜提取样，平均分成3份，加入事先用3mL甲醇活化的实施例1～3的MISPE柱；
每个MISPE柱用1ml水淋洗去除杂质，再用3mL 10％的乙酸甲醇溶液洗脱3次，收集洗脱液，氮气吹干；
用1mL的流动相溶解，采用HPLC检测。
其中，六种有机锡化合物分子印迹固相萃取柱的吸附性如表1所示：
表1六种有机锡化合物分子印迹固相萃取柱的回收率
本发明以二丁基氯化锡和二苯基氯化锡为模板分子，甲基丙烯酸为单体合成了对6种有机锡化合物——特别是二取代有机锡化合物——具有特异性吸附的分子印迹聚合物，以此聚合物为填料制备了印迹固相萃取小柱，实现了果蔬基质中有机锡化合物的特异性分离富集和高通量检测，方法快速、灵敏、准确度高。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。