专利名称：一种dl-丙氨酸的酶法生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于氨基酸的生产技术领域，具体涉及一种DL-丙氨酸的酶法生产
工艺。
背景技术：
DL-丙氨酸是一种非天然氨基酸，是重要的有机手性源。主要应用于手性药 物、手性添加剂、手性助剂等领域，在制药及食品行业作为手性合成的手性源。 目前主要用于生产新型农药、氨基丙醇、化工中间体、食品添加剂。
目前DL-丙氨酸的制备包括Streck法、a-卤代酸法、相转移催化合成和冰 醋酸消旋法四种工艺。其中
Streck法为乙醛与氰化氢形成氰醇，除去其中过量氰化氢后，加入氨溶 液内，生成氨基腈，加碱水解得到丙氨酸的钠盐，经离子交换树脂处理得到DL-丙氨酸，尽管原料价格便宜，但却存在着氨基腈水解后分离比较困难，特别是 DL-丙氨酸与副产物分离比较复杂，稍有不当即影响产品质量，氨解反应条件苛 刻，氰化氢的运输比氨更为困难。
a-卤代酸法为以a-卤丙酸为原料，以乌洛托品位催化剂，与氨水进行氨 化，制成a-丙氨酸和氯化铵混合物，粗制品进入醇溶液中进行醇析、离心、干燥 得到工业级产品，再经离子交换树脂法或重结晶法得到DL-ci-丙氨酸，尽管连连 易得，对设备要求不高，但在生产过程中会产生大量副产物氯化铵，分离困难， 精制成本高；要采用大量甲醇醇析，造成甲醇严重挥发排放，污染严重，且甲醇 贮存场地和生产场地易燃易爆，生成安全性不高；催化剂用量很大，不能回收而 造成浪费，未反应完原料不能回用，反映终点难以判断，难于降低原来的消耗。
冰醋酸消旋法为以L-丙氨酸为原料，加入催化剂，在冰醋酸溶液中加热 80~110°C、溶解；温度保持在95 10(TC进行蒸发浓縮得到消旋的DL-丙氨酸；将 消旋的DL-丙氨酸母液降温至20 5(TC冷却后，含杂质的DL-丙氨酸结晶析出， 将该结晶进行离心甩干后，加热至100 12(TC的温度下烘干再得粗品DL-丙氨酸; 然后脱色、重结晶精制。该工艺能耗高，污染量大，冰醋酸易挥发、运输困难。国内现有与DL-丙氨酸的生产方法相关的研究，研究单位有冀州市华阳化 工有限责任公司、广东工业大学化工系、新旗氨基酸有限公司。冀州市华阳化工 有限责任公司的专利"一种DL-丙氨酸的制备工艺"，申请(专利)号 200610012947. X。其主要技术方案为以L-丙氨酸为原料,加入催化剂，在冰醋酸 溶液中加热、溶解、蒸发浓縮得到消旋的DL-丙氨酸;后再经降温、结晶、离心 甩干和烘干等工序即可得到高含量的DL-丙氨酸。
(《广东化工》1999年26巻2期-23-24页)发表了 "DL—丙氨酸合成方 法的研究"，此文研究了以乙醛为原料，在相转移催化剂在下与氯仿，氨水作用， 一步合成DL—丙氨酸的实验新方法，并对合成产物的熔点，红外光谱等进行了 分析、鉴定。
上述现有技术中的工艺，其产品制备成本相对较高，转化效率较低，难以 达到工业化生产的要求。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种DL-丙氨酸的 酶法生产工艺，该工艺可适合大规模工业化生产且能显著降低生产成本。
本发明为实现其目的所采取的技术方案 一种DL-丙氨酸的酶法生产工艺， 包括摇瓶种子培养和发酵，采用大肠杆菌在下述条件下培养和发酵
a、 种子培养基(质量百分比)和培养条件蛋白胨0. 6 0. 8%，氯化钠0. 4 0.6%，硫酸镁0.01 0.02%,磷酸二氢钾O. 1 0.2%， L-丙氨酸1X，玉米浆 1.5 1.8%，余量为纯净水，氨水调pH7. 0 7. 2。 35 8。C培养24小时；摇 床频率为105 110r /min;
b、 发酵培养基蛋白胨0.8 1.2%，玉米浆1.8 2.2%，硫酸镁0.01 0.02%，磷酸二氢钾0.05 0.2%，氯化钠O. 1 0.2%，卜丙氨酸1%，余量为 纯净水，配料完毕用氨水调pH至7.0 7.2。
c、发酵培养条件罐温3(TC土5X:，通风比l: 0.2。培养终点pH值7.0 8.5。
本发明从自然界筛选产对L-丙氨酸有消旋作用的微生物——大肠杆菌，通 过物理或化学的方法诱变，提高其氨基酸消旋酶的生产能力和活性。培养上述微生物，产生氨基酸消旋酶，生产原料是L-丙氨酸，L-丙氨酸直接作为酶转化 的底物，而不是培养基，转化过程是把L-丙氨酸流加进预先培养好的含有氨基 酸消旋酶的细胞悬液中。生产条件利用的是生物催化剂，生产过程无高温高压反 应，无有毒化学品，常温、常压操作。通过转化过程不断流加L-丙氨酸。L-丙 氨酸积累浓度增加，累积到一定程度可以以结晶体的形式与反应液分离，只需要 经过简单的溶解、脱色、重结晶就可以得到精制品，生产效率高。
本发明的有益效果采用微生物酶法转化L-丙氨酸规模化生产DL-丙氨酸， 转化效率达到99. 6%以上，产品纯度99.0%以上，大大降低生产成本，适合大规 模工业化生产。
以下结合附图和实施例对本发明进一步详细说明。
图1为本发明工艺流程图。
具体实施例方式
参见图1，对本发明工艺过程描述如下
1、 菌种培养
将斜面菌种接种到摇瓶液体培养基中，在震荡培养器上连续培养24小时左 右后，转移到发酵罐通风培养。在特定工艺条件下发酵20小时左右后，检测发
酵液OD值、pH值、酶活力等参数。培养结束，把上述含有氨基酸消旋酶的细胞 悬液转移至反应罐。
2、 酶促反应
细胞悬液在反应罐升到一定温度后，通入无菌空气，流加底物L-丙氨酸， 反应体系中的L-丙氨酸消旋酶消旋L-丙氨酸。随着底物流加量的不断增加，DL-丙氨酸的浓度不断增加，积累到一定程度，DL-丙氨酸从反应体系中结晶出来， 通过离心分离得到粗品。离心后的酶反应液可以回收反复套用多次，直到酶活力 降低到没有利用价值。丧失酶活力的酶反应液中含有一定浓度的DL-丙氨酸，这 部分产品可以通过浓縮的方式结晶出来。
3、产品精制粗品DL-丙氨酸，含有一定量的色素、蛋白质等有机杂质，投入脱色罐中加 水升温溶解，加入活性碳脱色，溶液经活性碳过滤机、50Wn膜过滤机过滤，净 化后的过滤清液经真空浓縮结晶，可以得到化学纯度超过98.5%，光学纯度超过 99%的产品。 主要技术参数
本发明利用现有L-丙氨酸生产装置，适当增加设备。进行了多个批次的工
业化实验，取得了系列适合工业化生产的技术参数。
1、 一级种子工艺技术参数
硫酸镁0.02% ，蛋白胨0.7%,氯化钠0.5%，牛肉膏1%， 琼脂2% ,
磷酸二氢钾0.1%，反丁烯二酸1%,余量为纯净水，氨水调pH 7. 0~7. 2。
试管空消120。C，灭菌3o分钟，实消i2o。c，灭菌30分钟。37^恒温培养
24~36小时。
一级种子培养基配方和培养条件
蛋白胨0.7%，氯化钠0.5%，硫酸镁0.02%，磷酸二氢钾0.1%，反丁烯 二酸1%，玉米桨l. 8%，余量为纯净水，氨水调pH7. 0 7. 2。
1000ml三角瓶装液量200ml， 0. lMPa灭菌20分钟，37。C培养24小时。摇 床条件冲程6. 5 7cm，频率为105 110r/min。
2、 发酵罐发酵产酶工艺技术参数
(1) OD值净长大于O. 35;
(2) 培养周期不超过20小时；
(3) 培养条件
罐温30。C土rC，通风比l: 0.2。培养终点pH值8.0; (4)发酵罐培养基配方
种子罐定容500L，其中加蛋白胨1. 0% ，玉米浆1. 8-2. 2%，七水硫酸镁0. 02 %，磷酸二氢钾O. 1%，氯化钠0.145%，反丁烯二酸1%，泡敌150ml左右， 配料完毕用氨水调pH至7. 0 7. 2。
3、 转化工艺技术参数
(1) 对L-丙氨酸消旋率99. 5%以上；
(2) 转化时间小于12小时；
(3) 转化温度控制在37。C 4(TC之间，含酶发酵液体加入量0. 4%。(4)转化体系配方硫酸镁2.2kg， L-丙氨酸(含量》99%) 1200kg，含酶 发酵液0.4%,水定容10m3,用液氨调pH值为8.0左右。 4、提取过程工艺技术参数
(1) 脱色温度80'C;
(2) 活性炭加量30 50kg;
(3) 静止20 30分钟；
(4) 滤液澄清无杂质，透光率》99%;
(5) 脱色液浓缩温度《6(TC，真空度《0.07MPa;
(6) 浓縮比》1/0.3有大量晶体出现，pH值5 .5~6.5;
(7) 结晶温度《2(TC;
(8) 离心终点出水成滴不成线；
(9) 干燥温度60~70 。C，干燥失重《0.2%。
本发明主要技术指标酶活力2800nmol/g.h;操作稳定性7天；转化率》 98.5%;产品对底物质量收率》95%;化学纯度》98.5%;光学纯度》99%。以上几 项要求，在本发明生物酶生产DL-丙氨酸技术生产中都得到了良好的体现。
实施例1
配种子液2000ml，种子液配比为蛋白胨0. 7%，氯化钠0. 5%，硫酸镁0. 02 %，磷酸二氢钾O. 1%， L-丙氨酸1%，玉米浆l. 8%，余量为纯净水，氨水调 pH7. 0。分装在5只1000ml三角瓶灭菌后，37°C接种斜面，摇床培养24h，摇 床转速为105r/min，接种100L发酵液，发酵液配比为蛋白胨1.0%，玉米浆 1.8~2.2%，硫酸镁0.02%，磷酸二氢钾0.1%，氯化钠0.145%， L-丙氨酸1 %，泡敌30ml，配料完毕用氨水调pH至7. 0。发酵培养条件培养温度3(yC， 通风比l: 0.2，罐压0.05MPa，培养18h。 OD值净长大于0. 35后，取发酵液配 制500L转化液，L-丙氨酸60kg，酶液2000ml，余量为纯净水，用液氨调pH 值为8.0左右。转化温度38"C,转化12h。 80"C脱色，活性炭加量lkg，过滤后浓 縮，65。C干燥。得到产品59. 6kg，产品含量99. 5%，比旋光度[a ]DJ°为0，透 光率99. 8%。实施例2
配种子液1000ml，种子液配比为蛋白胨0.6X，氯化钠0.6%，硫酸镁0.03 %，磷酸二氢钾0.2%，卜丙氨酸1%，玉米浆2.0%，余量为纯净水，氨水调 pH7. 5.分装在10只1000ml三角瓶灭菌后，37°C接种斜面，摇床培养20h，摇 床转速为110r/min，接种IOOL发酵液，发酵液配比为蛋白胨1. 2% ，玉米浆2. 4 % ，硫酸镁0. 03 % ，磷酸二氢钾0.2%，氯化钠0. 2 % ， L-丙氨酸1 % ，泡敌30ml ， 配料完毕用氨水调pH至7.5。发酵培养条件培养温度32"C，通风比l: 0.2， 罐压0.05MPa，培养20h。 OD值净长大于0. 35后，取发酵液配制500L转化液， 硫酸镁0.2kg， L-丙氨酸60kg，酶液1000ml，用液氨调pH值为8.5。转化温度 40flC，转化12h。 85t脱色，活性炭加量1.2kg，过滤后浓縮，70"C干燥。得到产 品59. 4kg，产品含量99. 3%，比旋光度[a ]0,为0，透光率99. 2%。
实施例3
配种子液800ml，种子液配比为蛋白胨0.6%，氯化钠0.4%，七水硫酸镁 0.01%，磷酸二氢钾0.05%，卜丙氨酸1%，玉米浆1. 5%，余量为纯净水， 氨水调p朋.5。分装在4只1000ml三角瓶灭菌后，37°C接种斜面，摇床培养24h， 摇床转速为100r/min，接种100L发酵液，发酵液配比为蛋白胨0. 8%，玉米浆 1.8%,硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.05%，氯化钠O. 1%， L-丙氨酸1%，泡 敌20ml，配料完毕用氨水调pH至6.5。发酵培养条件培养温度30°C，通风比 1: 0.2，罐压0.05MPa，培养18h。 OD值净长大于0. 35后，取发酵液配制500L 转化液，硫酸镁O. lkg， L-丙氨酸60kg，酶液800ml，用液氨调pH值为7.5。转 化温度35"C，转化12h。 70"C脱色，活性炭加量0.8kg,过滤后浓縮，60eC千燥。 得到产品59. 2kg，产品含量99. 4%，比旋光度[a ]此2。为0，透光率99. 4%。
本发明采用的"生物酶"，直接利用含有氨基酸消旋酶的细胞培养液，只通 过一步反应即可生产出DL-丙氨酸，生产成本大幅度下降，可以做到3万元以下。 按目前产品市场价格3.75万元，有很大的获利空间。
自然界中多数微生物具有分解氨基酸的能力，本发明利用的微生物是大肠杆 菌，通过发酵培养产生L-丙氨酸消旋酶生产DL-丙氨酸。
权利要求
1、一种DL-丙氨酸的酶法生产工艺，包括摇瓶种子培养和发酵，其特征在于采用大肠杆菌在下述条件下培养和发酵a、种子培养基(质量百分比)和培养条件蛋白胨0.6～0.8％，氯化钠0.4～0.6％，硫酸镁0.01～0.02％，磷酸二氢钾0.1～0.2％，L-丙氨酸1％，玉米浆1.5～1.8％，余量为纯净水，氨水调pH7.0～7.2。35～38℃培养24小时；摇床频率为105～110r/min；b、发酵培养基蛋白胨0.8～1.2％，玉米浆1.8～2.2％，硫酸镁0.01～0.02％，磷酸二氢钾0.05～0.2％，氯化钠0.1～0.2％，L-丙氨酸1％，余量为纯净水，配料完毕用氨水调pH至7.0～7.2。c、发酵培养条件罐温30℃±5℃，通风比1∶0.2。培养终点pH值7.0～8.5。
全文摘要
本发明公开了一种DL-丙氨酸的酶法生产工艺，包括摇瓶种子培养和发酵，采用大肠杆菌，对其进行培养，产生氨基酸消旋酶，直接利用含有氨基酸消旋酶的细胞培养液，只通过一步反应即可生产出DL-丙氨酸。用本发明工艺生产DL-丙氨酸，转化效率达到99.6％以上，产品纯度99.0％以上，大大降低生产成本，适合大规模工业化生产。
文档编号C12P13/00GK101580858SQ200910117049
公开日2009年11月18日 申请日期2009年6月11日 优先权日2009年6月11日
发明者唐思青, 张晓斌, 蒋光玉, 郑向辉 申请人:安徽华恒生物工程有限公司