丙氨酸2,3－氨基变位酶的制作方法

专利名称：丙氨酸2,3－氨基变位酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及丙氨酸2，3-氨基变位酶核酸和氨基酸序列，具有可将α-丙氨酸转化为β-丙氨酸的丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的细胞，以及利用这些细胞生产β-丙氨酸、泛酸、3-羟丙酸和其它有机化合物的方法。
背景技术：
有机化学制品诸如有机酸、酯和多元醇可用于合成塑料物质和其它的产物。为了满足对有机化学制品不断增加的需求，人们正在开发更有效和节约成本的利用基于碳水化合物而非碳氢化合物的原材料的生产方法。例如，某些细菌已用于制备大量的用于聚乳酸生产的乳酸。
3-羟丙酸(3-HP)是有机酸。人们已经描述了几种化学合成途径以生产3-HP，并且也已公开了生物催化途径(Suthers等人的WO 01/16346)。3-HP具有用于特定合成的用途且可通过化学工业中已知的技术转化为商业上重要的中间产物，例如经脱水作用形成的丙烯酸、经氧化形成的丙二酸、经与醇进行酯化反应形成的酯，以及经还原作用形成的1，3-丙二醇。
发明概述可从PEP或丙酮酸通过关键的β-丙氨酸中间产物来生物催化产生(

图1)化合物3-羟丙酸(3-HP)。β-丙氨酸可以在细胞中通过5，6-二氢尿嘧啶和N-氨甲酰基β-丙氨酸、N-乙酰-β-丙氨酸、鹅肌肽或天冬氨酸，从肌肽、β-丙氨酰精氨酸、β-丙氨酰赖氨酸、尿嘧啶来合成(图1和2)。然而，这些途径相对的低效率的，因为它们需要稀有的前体或比3-HP更昂贵的起始化合物。
因此，如果α-丙氨酸可直接转化为β-丙氨酸，则利用生物催化途径生产3-HP是更有效的(图1)。令人遗憾的是，相互转化α-丙氨酸和β-丙氨酸的酶还没有被鉴定出来。如果鉴定出进行转化α-丙氨酸为β-丙氨酸例如丙氨酸2，3-氨基变位酶的酶活性，将是有利的。
在此公开了2，3-氨基变位酶核酸序列(例如SEQ ID NOS20和29)、氨基酸序列(例如SEQ ID NOS21和30)，及其保持丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的变体、片段、融合体和多态型。在一个实例中，多肽是包括SEQ ID NO21或30，或其保持丙氨酸2，3氨基变位酶活性的变体、片段或融合体的序列。在一个实例中，该多肽是突变的赖氨酸2，3-氨基变位酶和/或赖氨酸5，6-氨基变位酶的氨基酸序列。所公开的序列可用于转化细胞，以使得该转化细胞具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性，从而允许该细胞由α-丙氨酸产生β-丙氨酸。本发明公开了特异性结合丙氨酸2，3-氨基变位酶的结合剂。
本发明公开了具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性，允许将α-丙氨酸转化为β-丙氨酸的细胞。这种细胞可以是真核或原核细胞，例如酵母细胞、植物细胞、乳杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、芽胞杆菌(Bacillus)或埃希氏杆菌(Escherichia)细胞。在一个实例中，该细胞是用赋予丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的突变赖氨酸2，3-氨基变位酶和/或突变的赖氨酸5，6-氨基变位酶进行转化的细胞。在另一个实例中，转化的细胞包括例如SEQ ID NO21或30的丙氨酸2，3-氨基变位酶。本发明所公开的细胞可用于生产核酸分子、多肽和有机化合物。该多肽可用于催化有机化合物的形成或可用作抗原来产生特异性的结合剂。
本发明公开了具有至少一种外源核酸，例如编码丙氨酸2，3-氨基变位酶的核酸的生产细胞。在一个实例中，该核酸序列包括SEQ ID NOS20或29(或其保持丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的片段、变体或融合体)。在另一个实例中，该核酸序列编码SEQ ID NO21或30中所示的氨基酸序列(或其保持丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的片段、变体或融合蛋白)。生产细胞可用于表达具有酶活性，例如CoA转移酶活性、β-丙氨酸氨裂解酶活性、3-羟丙酰基-CoA(3-HP-CoA)脱水酶活性、谷氨酸脱氢酶、3-羟丙酰基-CoA水解酶、丙氨酸脱氢酶、丙酮酸-谷氨酸转氨酶，和/或3-羟异丁酰基-CoA水解酶活性的多肽。在另一个实例中，生产细胞被用于表达具有诸如β-丙氨酸-2-氧化戊二酸氨基转移酶和3-HP脱氢酶和/或3-羟异丁酸脱氢酶的酶活性的多肽。本发明也公开了生产上述核酸序列编码的多肽的方法。
本发明公开了一种鉴定具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的细胞的方法。该方法包括在不含β-丙氨酸或泛酸的培养基中，培养功能性缺失panD的细胞。例如，该细胞可由培养基来源的碳、氧、氢和氮生产α-丙氨酸，但不包括β-丙氨酸。鉴定能够在该培养基中生长的细胞，其中细胞生长表明该细胞由α-丙氨酸产生β-丙氨酸，这表明该细胞具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性。相反，缺少细胞生长表明该细胞不能由α-丙氨酸产生β-丙氨酸，这表明该细胞不具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性。在一个实例中，在培养用于筛选的细胞之前，用一或多种突变的赖氨酸2，3-氨基变位酶和/或赖氨酸5，6-氨基变位酶转化细胞。
本发明公开了生产具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的多肽的方法。在一个实例中，该方法包括培养具有至少一种编码丙氨酸2，3-氨基变位酶的外源核酸分子(例如SEQ ID NOS20和29)，能够由α-丙氨酸产生β-丙氨酸的细胞。
本发明公开了几种利用公开的具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的细胞由β-丙氨酸产生3-HP的方法。在一个实例中，用一或多种由β-丙氨酸转化为3-HP所必需的一或多种酶转染该细胞。在另一个实例中，该方法包括从细胞纯化β-丙氨酸，然后将β-丙氨酸与由β-丙氨酸转化为3-HP所必需的多肽接触。
在此所公开的细胞、丙氨酸2，3-氨基变位酶核酸和氨基酸序列(例如SEQ ID NOS20，21，29和30)以及方法可用于生产泛酸、3-HP及其衍生物，例如辅酶A(CoA)和其它有机化合物，例如1，3-丙二醇、丙烯酸、聚合的丙烯酸、丙烯酸的酯、聚合的3-HP、3-HP的共聚合物和其它化合物，例如丁酸、戊酸和其它化合物，3-HP的酯和丙二酸及其酯。3-HP在生物学和商业上都是重要的。例如，当可由3-HP产生上述的衍生物时，在营养工业中可使用3-HP作为食物、饲料添加剂或防腐剂。
用于编码丙氨酸2，3氨基变位酶的核酸分子(例如SEQ ID NOS20和29)可用于工程改造具有生产3-HP以及诸如上述其它有机化合物的宿主细胞。丙氨酸2，3-氨基变位酶的肽(例如SEQ ID NOS21和30)可用于无细胞体系以产生3-HP以及诸如上述的其它有机化合物。在此描述的细胞可用于培养体系以生产大量的3-HP以及诸如上述的其它有机化合物。
本发明的一个方面提供了除丙氨酸2，3-氨基变位酶活性外，包括其它酶活性，诸如CoA转移酶活性、β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性和3-羟丙酰基-CoA脱水酶活性的细胞。此外，本发明公开了从这些细胞生产产物的方法。在一些实例中，该细胞也包括编码一或多种具有谷氨酸脱氢酶活性、CoA转移酶活性、3-羟丙酰基-CoA水解酶、和/或3-羟异丁酰基-CoA水解酶活性和丙氨酸脱氢酶或丙酮酸-谷氨酸转氨酶活性的多肽的一或多种外源核酸分子。在另一个实例中，该细胞也包括4-氨基丁酸和/或β-丙氨酸-2-氧化戊二酸氨基转移酶活性和3-HP脱氢酶活性和/或3-羟基异丁酸脱氢酶活性。另外，该细胞可包括CoA水解酶活性、聚醇酸合酶活性和/或脂肪酶或酯酶活性。
在另一个实例中，包括丙氨酸2，3-氨基变位酶活性；CoA转移酶活性；β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性；丙氨酸脱氢酶或丙酮酸-谷氨酸转氨酶活性和3-HP-CoA脱水酶活性的细胞，生产例如3-HP和/或3-HP的酯，诸如3-羟丙酸甲酯、3-羟丙酸乙酯、3-羟丙酸丙酯和/或3-羟丙酸丁酯的产物。在一些实例中，该细胞进一步包括谷氨酸脱氢酶活性、CoA转移酶活性、3-羟丙酰基-CoA水解酶和/或3-羟异丁酰基基-CoA水解酶活性。相应地，本发明也提供生产一或多种这类产物的方法。这些方法包括在允许生产该产物的条件下培养包括CoA转移酶活性、β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性、3-HP-CoA脱水酶活性和在某些实例中包括谷氨酸脱氢酶活性、CoA转移酶活性、3-羟丙酰基-CoA水解酶、3-羟异丁酰基-CoA水解酶活性和/或丙氨酸脱氢酶或丙酮酸-谷氨酸转氨酶活性的细胞。
本发明的另一个方面提供了除具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性外，具有CoA转移酶活性、β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性、3-羟丙酰基-CoA脱水酶活性和聚醇酸合酶活性的细胞。在一些实例中，这些细胞可包含编码一或多种具有CoA转移酶活性、β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性、3-羟丙酰基-CoA脱水酶活性、丙氨酸脱氢酶或丙酮酸-谷氨酸转氨酶活性和聚醇酸合酶活性的多肽的外源核酸分子。该细胞可用于，例如，生产诸如聚合的3-HP和3-HP的共聚合物和其它化合物，诸如丁酸酯、戊酸酯和其它化合物的产物。
在另一个实例中，该细胞除具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性外，具有CoA转移酶活性、β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性、丙氨酸脱氢酶或丙酮酸-谷氨酸转氨酶活性和聚醇酸合酶活性，从而可生产例如聚合的3-HP的产物。在一些实例中，这些细胞可包含编码一或多种具有CoA转移酶活性、β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性、和/或聚醇酸合酶活性的一或多种外源核酸分子。
本

发明内容
的另一个方面提供了包括丙氨酸2，3-氨基变位酶活性、CoA转移酶活性、β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性、丙氨酸脱氢酶或丙酮酸-谷氨酸转氨酶活性和脂肪酶或酯酶活性的细胞。在一个实例中，该细胞也包括CoA水解酶活性。在一些实例中，该细胞包含编码一或多种具有CoA转移酶活性、β-丙氨酰基-辅酶A氨裂解酶活性、脂肪酶或酯酶活性和/或CoA水解酶活性的多肽的外源核酸分子。该细胞尤其可用于生产产物诸如丙烯酸酯(例如，丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯和丙烯酸丁酯)。
本发明公开了可生产1，3-丙二醇的细胞及其应用的方法。1，3-丙二醇可通过利用具有酶活性的多肽，由3-HP-CoA或3-HP来生成。当将3-HP-CoA转化为1，3-丙二醇时，可使用具有氧化还原酶活性或者还原酶活性的多肽，例如具有乙酰化醛NAD(+)氧化还原酶和醇NAD(+)氧化还原酶活性(例如，来自1.1.1.1和/或1.2.1.10的酶分类的酶)的多肽。当从3-HP制备1，3-丙二醇时，可使用具有醛脱氢酶活性(例如，来自1.2.1-分类的酶)的多肽和具有乙醇脱氢酶活性(例如，来自1.1.1.-分类的酶)的多肽的组合物，例如醛脱氢酶(NAD(P)+)(EC 1.2.1.-)和乙醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)。
在一些实例中，产物在体外产生(在细胞外)。在其它的实例中，使用体外和体内(在细胞内)方法的组合产生产物。在其它的实例中，产物是体内产生的。对涉及体内步骤的方法而言，细胞可以是分离培养的细胞或整个生物体，诸如转基因植物、非人哺乳动物或单细胞生物，诸如酵母和细菌(例如，乳杆菌、乳球菌、芽胞杆菌和埃希氏杆菌细胞)。在下文中这种细胞称为生产细胞。由这些生产细胞产生的产物可以是有机产物，诸如β-丙氨酸、3-HP、泛酸和其衍生物，例如有机酸、多元醇(即1，3-丙二醇)、辅酶A(CoA)以及在此所述的丙氨酸2，3-氨基变位酶。
泛酸是一种很多动物生长和健康所必需的维生素，其涉及脂肪酸的合成和降解。此维生素的缺乏导致全身性的临床不适。因此，使用在此所公开的方法生产的泛酸可以以治疗有效量给药于泛酸缺乏的受试者。生产泛酸的细胞和利用该公开的细胞由β-丙氨酸产生泛酸的方法是公开的。产生泛酸和/或CoA的生产细胞可用于表达α-酮泛酸羟甲基转移酶(E.C.2.1.2.11)，α-酮泛酸还原酶(E.C.1.1.1.169)和泛酸合酶(E.C.6.3.2.1)来产生泛酸，或另外表达泛酸激酶(E.C.2.7.1.33)、4′-磷酸羟泛酰基-1-半胱氨酸合成酶(E.C.6.3.2.5)、4’-磷酸羟泛酰基半胱氨酸脱羧酶(E.C.4.1.1.36)、ATP4′-磷酸泛酰巯基乙胺腺苷转移酶(E.C.2.7.7.3)和脱磷酸-CoA激酶(E.C.2.7.1.24)来产生辅酶A。
附图的简要描述图1是经β-丙氨酸的中间产物产生3-HP及其衍生物，以及由α-丙氨酸产生β-丙氨酸的途径的图解。
图2是用于产生β-丙氨酸的途径的图解。
图3是用于由β-丙氨酸产生辅酶A和泛酸的途径的图解。
图4是枯草芽孢杆菌野生型的赖氨酸2，3-氨基变位酶(KAM，SEQ ID NO31)及其编码丙氨酸2，3-氨基变位酶的突变形式(SEQ ID NO21)的序列对比。取代以粗体显示。Fe-S簇-结合基序加下划线，而推定的PLP-结合基序是斜体的。
图5是牙龈卟啉单胞菌野生型的赖氨酸2，3-氨基变位酶(kam，SEQ ID NO28)及其编码丙氨酸2，3-氨基变位酶的突变形式(aam，SEQID NO30)的序列对比。取代以粗体显示。Fe-S簇-结合基序加下划线，而推定的PLP-结合基序是斜体的。
图6是枯草芽孢杆菌和牙龈卟啉单胞菌野生型的赖氨酸2，3-氨基变位酶(kam，SEQ ID NO31和28)，以及其编码丙氨酸2，3-氨基变位酶的突变形式(aam，SEQ ID NO21和29)的序列对比。在相同位点的取代用粗体表示。
序列表在所附序列表的核酸和氨基酸序列中，用标准字体的缩写表示核苷酸碱基，并用三字码表示氨基酸。只显示每个核酸序列的单链，但是可以理解通过对所显示链的任何参考的互补链也包括在内。
SEQ ID NOS1和2是用于克隆枯草芽孢杆菌赖氨酸2，3-氨基变位酶(KAM)基因的PCR引物。
SEQ ID NO3是枯草芽孢杆菌KAM基因的核酸序列。
SEQ ID NOS4和5是用于扩增pKD3的CAT基因的PCR引物。
SEQ ID NOS6和7是用于证实CAT基因正确的插入panD基因座的PCR引物。
SEQ ID NOS8和9是用于扩增pKD3的CAT基因的引物的核酸序列。
SEQ ID NOS10和11是用于在野生型的枯草芽孢杆菌赖氨酸2，3-氨基变位酶基因中产生L103M突变的引物的核酸序列。
SEQ ID NOS12和13是用于在野生型的枯草芽孢杆菌赖氨酸2，3-氨基变位酶基因中产生M136V突变的引物的核酸序列。
SEQ ID NOS14和15是用于在野生型的枯草芽孢杆菌赖氨酸2，3-氨基变位酶基因中产生D339H突变的引物的核酸序列。
SEQ ID NOS16-19，26，27和32是用于从粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)M3A克隆3-HP脱氢酶基因的引物的核酸序列。
SEQ ID NO20是丙氨酸2，3-氨基变位酶DNA的核酸序列。
SEQ ID NO21是丙氨酸2，3-氨基变位酶蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO22是β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶(ACL-1)cDNA的核酸序列。
SEQ ID NO23是β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶(ACL-1)蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO24是CoA转移酶cDNA的核酸序列。
SEQ ID NO25是CoA转移酶蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO28是牙龈卟啉单胞菌KAM的氨基酸序列。
SEQ ID NO29是丙氨酸2，3-氨基变位酶的核酸序列。
SEQ ID NO30是丙氨酸2，3-氨基变位酶蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO31是枯草芽孢杆菌KAM的氨基酸序列。
SEQ ID NO33是来自粪产碱菌M3A的3-HP脱氢酶基因的核酸序列。
SEQ ID NO34是来自粪产碱菌M3A的3-HP脱氢酶基因的氨基酸序列。
SEQ ID NOS35-37是用于克隆β-丙氨酸-CoA氨裂解酶(ACL-1和ACL-2)的引物的核酸序列。
SEQ ID NOS38-40是用于从大肠杆菌克隆CoA转移酶的引物的核酸序列。
SEQ ID NOS41-48是用于产生包括ACL-1或ACL-2、CoA转移酶和CoA水合酶基因的操纵子1和2的引物的核酸序列。
SEQ ID NOS49-52是用于产生包括4-氨基丁酸氨基转移酶和3-羟异丁酸脱氢酶基因的操纵子3的引物的核酸序列。
SEQ ID NO53是β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶(ACL-2)cDNA的核酸序列。
SEQ ID NO54是β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶(ACL-2)蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NOS55-56是用于从pATH-2-2-1质粒扩增ATH-2操纵子的引物的核酸序列。
SEQ ID NOS57-58是用于从pATD质粒扩增ATD操纵子的引物的核酸序列。
SEQ ID NOS59-60是用于扩增枯草芽孢杆菌丙氨酸2，3氨基变位酶的引物的核酸序列。
SEQ ID NOS61-62是用于扩增大鼠β-丙氨酸氨基转移酶基因的引物的核酸序列。
SEQ ID NOS63-64是用于从粪产碱菌扩增3-HP脱氢酶的引物的核酸序列。
SEQ ID NOS65-66是用于从大鼠扩增α-丙氨酸氨基转移酶基因的引物的核酸序列。
几个实施方案的具体描述缩写和术语提供下列术语和方法的说明以更好地描述本发明的内容并且指导本领域的普通技术人员实施本发明的内容。在此所使用的，包含”意味着“包括”并且单数形式的“一”或“一个”或“该”包括复数的参考，除非上下文另有清楚地规定。例如，“包含一种蛋白”指包括一或多种的这种蛋白，并且“包含该细胞”指包括一或多种细胞及其本领域技术人员公知的等同物等。
除非另有解释，否则在此使用的所有技术和科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。尽管与在此所描述的相似或等效的方法和物质可用于实施或检测本发明的内容，适当的方法和物质描述如下。该物质、方法和实施例只是说明性的而不是限制性的。所公开内容的其它特性和优点在下列发明详述和权利要求中是显而易见的。
丙氨酸2，3-氨基变位酶可在例如细胞中将α-丙氨酸转化为β-丙氨酸的酶。包括来自任何生物体例如原核生物的的任何丙氨酸2，3-氨基变位酶基因、cDNA或蛋白质。在一个实例中，丙氨酸2，3-氨基变位酶是具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的突变的赖氨酸2，3-氨基变位酶或突变的赖氨酸5，6-氨基变位酶赖氨酸2，3-氨基变位酶(或在遗传学数据库中注释为赖氨酸2，3氨基变位酶的基因)可从任何生物体，例如原核生物，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)、近端梭菌(Clostridium subterminale)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)或大肠杆菌，并且使用本领域已知的任何方法突变来获得。
在特定的实例中，丙氨酸2，3-氨基变位酶核酸序列包括SEQ IDNOS20或29中显示的序列或其保持编码具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的肽或蛋白质的能力的片段、变体或融合体。在另一个实例中，丙氨酸2，3-氨基变位酶蛋白质包括SEQ ID NOS21或30中显示的氨基酸序列或其保持丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的片段、变体或融合体。
在另一个实例中，丙氨酸2，3-氨基变位酶序列包括全长的野生型序列，例如SEQ ID NO21或30以及保持转化α-丙氨酸为β-丙氨酸能力的短序列，例如SEQ ID NO21的氨基酸50-390，SEQ ID NO21的氨基酸101-339，SEQ ID NO30的氨基酸15-390和SEQ ID NO 30的氨基酸15-340。本说明书包括丙氨酸2，3-氨基变位酶的等位变体以及保持转化α-丙氨酸为β-丙氨酸能力的任何变体、片段或融合序列。
丙氨酸2，3-氨基变位酶活性转化α-丙氨酸为β-丙氨酸的丙氨酸2，3-氨基变位酶的能力。在一个实例中，这种活性发生在细胞中。在另一个实例中，这种活性发生在体外。这种活性可使用本领域已知的任何方法来测定，例如在实施例6和9-11中描述的筛选分析和酶活测定方法。此外，具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的酶可通过将酶与α-丙氨酸或β-丙氨酸温育并且通过高效液相色谱(例如使用Abe等人的方法，J.Chromatography B，712439，1998)确定反应产物来鉴定。在一个实例中，它是在功能性缺失panD基因的大肠杆菌中转化α-丙氨酸为β-丙氨酸的丙氨酸2，3-氨基变位酶的能力。
抗体一种包括特异性结合(免疫反应)抗原的抗原结合位点的分子。实例包括多克隆抗体、单克隆抗体、人单克隆抗体或其免疫有效部分。
其包括免疫球蛋白分子及其免疫活性部分。自然产生的抗体(例如，IgG)包括四条多肽链，通过二硫键内连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。然而，抗体的抗原-结合功能可通过天然存在的抗体的片段来实施。单克隆抗体的免疫有效部分包括，但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc和Fv部分(参见综述，Better和Horowitz，酶学方法Methods.Enzymol.1989，178476-96)。抗原结合片段的其它实例包括，但不限于(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由VH结构域组成的dAb片段；(v)分离的互补决定区域(CDR)；和(vi)F(ab′)2片段，包含通过二硫键连接绞链区的两个Fab片段的二价片段。此外，尽管Fv片段的两个结构域是通过分离基因编码，可产生合成的接头使它们能够作为单个的蛋白质链(已知为经重组方法形成的单链Fv(scFv)。这种单链抗体也是包括在内的。
″特异性结合″指特定试剂(″特异性结合试剂″)与特定的分析物特异性反应的能力，例如特异地与抗体免疫反应或特异结合特定的肽序列。该结合是在例如抗体分子和抗原决定子之间的非随机结合反应。抗体的结合特异性一般决定于抗体区别结合特异抗原和独立抗原的能力的参考点，并由此区别两个不同的抗原，尤其具有两个独特表位的抗原。特异结合特定表位的抗体被认为是″特异性抗体″。
可产生丙氨酸2，3-氨基变位酶多肽(例如SEQ ID NO21和/或30)、丙氨酸2，3-氨基变位酶多肽的片段(例如SEQ ID NO21的氨基酸50-390、例如SEQ ID NO21的氨基酸101-339或SEQ ID NO30的氨基酸15-390、例如SEQ ID NO30的氨基酸15-331)或其变体、融合体片段的单克隆或多克隆抗体。最佳地，针对多肽抗原上的一或多种表位的抗体将特异性地检测那些多肽。也就是说，针对一个特定多肽的抗体将识别和结合那些特定多肽而基本上不会识别或结合其它多肽。测定抗体特异性地结合特定的多肽是通过大量标准免疫测定方法中的任何一种来基性的；例如，Western印迹(参见，例如Sambrook等人(ed.)分子克隆实验室手册，第二版，vol.1-3，冷泉港实验室出版，冷泉港，细约，1989)。
为了通过Western印迹测定抗体制剂(例如在抗丙氨酸2，3-氨基变位酶多肽，例如SEQ ID NO21或30的小鼠中产生的制剂)特异性检测适合的多肽(例如，丙氨酸2，3-氨基变位酶多肽)，可从细胞提取总的细胞蛋白质并通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离。分离的总细胞蛋白质可随后转移至膜(例如，硝酸纤维)，并将该膜与抗体制剂温育。洗涤膜除去非特异性结合的抗体后，可使用结合酶的合适的第二抗体(例如，抗-小鼠抗体)检测特异性结合抗体的存在，所述的酶例如碱性磷酸酶，由于应用5-溴-4-氯-3吲哚基磷酸盐/硝基蓝四氮唑通过免疫定位碱性磷酸酶而导致产生浓密的蓝色-有色化合物。
从转染细胞、转化细胞或野生型细胞获得适合用作免疫原的基本上纯的多肽可。最终制备的多肽的浓度可以通过例如在Amicon过滤装置上调整到每毫升几微克的水平。此外，从全长多肽到只有9个氨基酸残基范围内的多肽都可以用作免疫原。这种多肽可在细胞培养物中产生，可使用标准方法化学来合成，或可通过将大的多肽切割成可被纯化的小的多肽而获得。当出现在上下文主要组织相容性复合体(MHC)分子，例如MHC类I或MHC类II分子的免疫系统中时，只有9个氨基酸残基长度的多肽可以是免疫原性的。因此，具有至少9，10，11，12，13，14，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，70，80，90，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，900，1000，1050，1100，1150，1200，1250，1300，1350或更多的连续氨基酸残基的丙氨酸2，3-氨基变位酶多肽的多肽能被用作生产抗体的免疫原。
可根据Kohler和Milstein(自然Nature 256495，1975)的传统方法或其衍生的方法由鼠的杂交瘤来制备在此所公开的任何多肽的单克隆抗体。
通过用该多肽(或其片段、融合体或变体)免疫适合的动物可制备包含在此所公开的任何多肽的异种表位抗体的多克隆抗血清，它可以是未改变的或为提高免疫原性而修饰的。有效免疫兔的方法可在Vaitukaitis等人(J.Clin.Endocrinol.Metab.33988-91，1971)中找到。
抗体片段可代替完整的抗体来使用并且可在原核宿主细胞中很容易地表达。制备和使用单克隆抗体的免疫有效部分也称为″抗体片段″的方法是公知的，且包括Better和Horowitz(酶学方法(Methods Enzymol.)178476-96，1989)、Glockshuber等人(生物化学(Biochemistry)291362-7，1990)、美国专利No.5,648,237(″功能性抗体片段的表达″)、美国专利No.4,946,778(″单多肽链结合分子″)、美国专利No.5,455,030(″使用单链多肽结合分子″)以及其中引用的参考文献中所描述的方法。
抗原化合物、组合物或可在动物体内刺激抗体产生或T-细胞反应的物质，包括对动物诸如注射或吸收给药的组合物。与特异的体液或细胞免疫的产物反应的抗原包括通过异源免疫原诱导的抗原。术语“抗原”包括所有相关的抗原表位。
cDNA(互补的DNA)缺少中间的非编码片段(内含子)和决定转录的调节序列的DNA片段。cDNA可在实验室中通过逆转录来自细胞中提取的信使RNA而合成。
保守取代氨基酸残基的一或多种氨基酸取代(例如1，2，5或10个残基)具有相似的生物化学性质。一般地，保守取代对所得到的多肽的活性只有很小的影响或没有影响。例如，保守取代是在丙氨酸2，3-氨基变位酶肽的氨基酸取代基本上不影响该肽转化α-丙氨酸为β-丙氨酸的能力。在特定的实例中，保守取代是在丙氨酸2，3-氨基变位酶肽的氨基酸取代，诸如在SEQ ID NO21或30中的保守取代，其不显著地改变该蛋白质转化α-丙氨酸为β-丙氨酸的能力。可用于测定丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的方法在此是公开的(实施例6和9-11)。丙氨酸扫描可用于鉴定丙氨酸2，3-氨基变位酶肽中哪些氨基酸残基可允许氨基酸取代。在一个实例中，当丙氨酸或其它保守的氨基酸(例如如下所列出的)被一或多种天然氨基酸取代时，丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的改变不超过25％，例如不多于20％，例如不多于10％。
在一个实例中，肽中包括一个保守取代，诸如SEQ ID NO21或30中的保守取代。在另一个实例中，肽中包括10个或更少的保守取代，诸如5个或更少。多肽可通过使用例如定点诱变或PCR标准方法操作编码该多肽的核苷酸序列来产生以包含一或多种保守取代。可选择地，可通过使用标准的肽合成法产生多肽使其包含一或多种保守取代。
取代的变体中至少氨基酸序列的一个残基已经被除去并且在其位置插入了不同的残基。蛋白质中可取代原始氨基酸并且被认为是保守取代的氨基酸的实例包括Ser取代Ala；Lys取代Arg；Gln或His取代Asn；Glu取代Asp；Ser取代Cys；Asn取代Gln；Asp取代Glu；Pro取代Gly；Asn或Gln取代His；Leu或Val取代Ile；Ile或Val取代Leu；Arg或Gln取代Lys；Leu或Ile取代Met；Met、Leu或Tyr取代Phe；Thr取代Ser；Ser取代Thr；Tyr取代Trp；Trp或Phe取代Tyr；以及Ile或Leu取代Val。
关于保守取代的进一步信息可在其它位置找到，Ben-Bassat等人(J.Bacteriol.169751-7，1987)，O′Regan等人(Gene 77237-51，1989)，Sahin-Toth等人(Protein Sci.3240-7，1994)，Hochuli等人(Bio/Technology61321-5，1988)，WO00/67796(Curd等人)以及在遗传学和分子生物学的标准教科书。
缺失核酸例如DNA的序列的去除，将两侧的区域连接在一起。
可检测的能够确定存在或出现。例如，如果由β-丙氨酸产生的信号强到足够可被测量，从α-丙氨酸到β-丙氨酸的生产就是可检测的。
DNA脱氧核糖核酸。DNA是包含多数生物体的遗传物质的长链聚合物(一些病毒具有包含核糖核酸、RNA的基因)。DNA聚合物中的重复单位是4种不同的核苷酸，每个包括4个碱基中的一个，结合于附带磷酸基的脱氧核糖核苷糖的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。三联体的核苷酸被认为是密码子，DNA分子的密码对应于多肽的氨基酸。术语密码子也用于指将DNA序列转录成mRNA中的3个核苷酸的相应(和互补的)序列。
外源的在此所使用的关于核酸和特定细胞的术语″外源的″指不是来源于在自然界中得到的特定细胞的任何核酸。因此，非天然存在的核酸一旦被引入细胞就相对于该细胞被认为是外源的。天然存在的核酸也可以相对于特定细胞是外源的。例如，分离自人X的细胞的全部染色体一旦该染色体被引入人Y的细胞，相对于Y的细胞就是外源的核酸。
功能性缺失突变、部分的或完全的缺失、插入或其它变化使得基因序列抑制该基因产物的产生，和/或使得该基因产物无功能。例如，大肠杆菌中panD的功能性缺失阻止通过由panD基因编码的天冬氨酸脱羧酶由天冬氨酸产生β-丙氨酸。大肠杆菌中panD的该功能性缺失使天冬氨酸脱羧酶失活从而导致大肠杆菌在缺乏β-丙氨酸或泛酸的生长培养基中的生长受到抑制。
功能等效具有同等的功能。在上下文中，丙氨酸2，3-氨基变位酶分子的功能等效分子包括保持丙氨酸2，3-氨基变位酶功能的不同分子。例如，功能等效可通过丙氨酸2，3-氨基变位酶中的序列变化来提供，其中具有一或多种序列变化的肽保持未改变的肽的功能，因此它保持将α-丙氨酸转化为β-丙氨酸的能力。
序列变化的实例包括但不限于，保守取代、缺失、突变、移码和插入。在一个实例中，给定的多肽结合抗体，而功能等效物是结合相同抗体的多肽。因此功能等效物包括与多肽一样具有相同结合特异性的肽，而且可用作代替该多肽的试剂(例如在泛酸和3-HP的生产中)。在一个实例中功能等效物包括结合序列是不连续的，其中抗体结合线性表位的多肽。因此，如果肽序列是MKNKWYKPKR(SEQIDNO21的氨基酸1-10)，功能等效物包括不连续的表位，可表现为(**＝任何数目的插入氨基酸)NH2-**-M**K**N**K**W**Y**K**P**K**R-COOH。在该实例中，如果多肽的三维结构是与结合SEQIDNO21的氨基酸1-10单克隆抗体结合的，则该多肽与SEQIDNO21的氨基酸1-10是功能等效的。
杂交根据互补的单链DNA和/或RNA形成双分子的能力，检测两种核酸分子的核苷酸序列互补性的方法。可使用核酸杂交技术获得本发明的分离核酸。简而言之，具有与丙氨酸2，3-氨基变位酶的一些同源性(例如与SEQIDNOS20和29或其变体或片段的同源性)的任何核酸可被用作探针，通过在中等至高度的严谨条件下杂交而鉴定类似的核酸。该核酸一旦被鉴定，随后可被纯化、测序和分析以确定它是否是具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的丙氨酸2，3-氨基变位酶。
杂交可通过Southern或Northern分析进行以分别鉴定与探针杂交的DNA或RNA序列。该探针可被标记，例如用生物素、荧光团、地高辛、酶或例如32P的放射性同位素。待分析的DNA或RNA可在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，转移到硝化纤维、尼龙或其它合适的薄膜上，以及使用本领域公知的标准技术与探针杂交，那些技术在Sambrook等人(1989)分子克隆，第二版，冷泉港实验室，Plainview，纽约的7.39-7.52部分中有描述。一般地，探针长度是至少大约20个核苷酸。例如，可使用包括丙氨酸2，3-氨基变位酶20个邻近的核苷酸(例如SEQ ID NO20或29的20个邻近的核苷酸)的探针鉴定相同的或相似的核酸。此外，可使用比20个核苷酸更长或更短的探针。
本发明也提供了至少大约12个碱基长度的分离的核酸序列(例如，至少大约13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，40，50，60，100，250，500，750，1000，1400，2000，3000，4000或5000个碱基长度)以及在杂交条件下与丙氨酸2，3-氨基变位酶核酸序列例如SEQ ID NO20或29的正义或反义链杂交。杂交条件可以是中等或高度严谨的杂交条件。
中等严谨杂交条件是于大约42℃，在包含25mM KPO4(pH7.4)、5×SSC、5×Denhart′s溶液、50μg/ml变性、超声处理的鲑鱼精DNA、50％甲酰胺、10％葡聚糖硫酸酯和1-15ng/ml探针(大约5×107，cpm/μg)的杂交溶液中进行杂交，同时在大约50℃用包含2×SSC和0.1％十二烷基硫酸钠的洗液进行洗涤。
高度严谨杂交条件是于大约42℃，在包含25mM KPO4(pH7.4)、5×SSC、5×Denhart′s溶液、50μg/ml变性、超声处理的鲑鱼精DNA、50％甲酰胺、10％葡聚糖硫酸酯和1-15ng/ml探针(大约5×107，cpm/μg)的杂交溶液中进行杂交，同时在大约65℃用包含0.2×SSC和0.1％十二烷基硫酸钠的洗液进行洗涤。
分离的″分离的″生物成分(例如核酸分子或蛋白质)大体上分离自或纯化自生物体细胞中的其它生物成分，其中该成分，即其它的染色体和染色体外的DNA、RNA和蛋白质是天然存在的。″分离的″核酸和蛋白质包括通过标准的纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语也包含通过在宿主细胞重组表达的核酸和蛋白质以及化学合成的核酸、蛋白质和肽。
在一个实例中，分离的指天然产生的核酸其不与其获自的天然存在的生物基因组连续相连(一侧在5′末端，而另一侧在3′末端)的序列连续相连。例如，分离的核酸可以是但不限于，任何长度的重组DNA分子，而在天然存在的基因组中通常发现紧邻重组DNA分子的两侧的核酸序列被除去或缺乏。因此，分离的核酸包括但不限于，作为分离的分子独立于其它序列存在的重组DNA(例如，通过PCR或限制性内切核酸酶处理的cDNA或基因组DNA片段)，以及整合到载体、自主复制的质粒、病毒(例如，反向病毒、腺病毒或疱疹病毒)中，或整合到原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA。此外，分离的核酸可包括杂交或融合核酸序列部分的重组DNA分子。
在一个实例中，关于核酸所使用的术语″分离的″也包括任何非天然存在的核酸，因为非天然存在的核酸序列在自然界中没有发现并且在天然存在的基因组中不具有紧邻的序列。例如，非天然存在的核酸，如工程化的核酸被认为是分离的核酸。工程化的核酸可使用常规的分子克隆或化学核酸合成技术来产生。分离的非天然存在的核酸可独立于其它序列，或整合到载体、自主复制质粒、病毒(例如，反向病毒、腺病毒或疱疹病毒)，或原核生物或真核生物的基因组DNA中。此外，分离的非天然存在的核酸可包括杂交或融合的核酸序列部分的重组DNA分子。
亮氨酸2，3-氨基变位酶可转化α-亮氨酸为β-亮氨酸的酶。包括来自任何生物体的任何亮氨酸2，3-氨基变位酶基因、cDNA、RNA或蛋白质，诸如来自原核生物或真核生物，例如来自大鼠、人、鸡或生孢梭菌(Clostridium sporogenes)(Poston，J.Biol.Chem.2511859-63，1976)。本说明书包括亮氨酸2，3-氨基变位酶等位基因的变体，以及保持转化α-亮氨酸为β-亮氨酸的能力的任何变体、片段或融合蛋白。
赖氨酸2，3-氨基变位酶可转化α-赖氨酸为β-赖氨酸的酶。包括来自任何生物体的任何赖氨酸2，3-氨基变位酶基因、cDNA、RNA或蛋白质，例如来自原核生物，例如枯草芽孢杆菌、耐放射异常球菌、近端梭菌、牙龈卟啉单胞菌、粪产碱菌、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)或大肠杆菌。本说明书包括赖氨酸2，3-氨基变位酶等位基因的变体，以及保持转化α-赖氨酸为β-赖氨酸的能力的任何变体、片段或融合序列。在一个实例中，包括通过在公共的DNA序列数据库，诸如GenBank中注明为赖氨酸2，3-氨基变位酶的基因编码的多肽。
核酸包括RNA和DNA，包括但不限于，cDNA、基因组DNA和合成的(例如，化学合成)DNA。该核酸可以是双链或单链的。其中单链的核酸可以是有义链或反义链。此外，核酸可以是环状的或线性的。
寡核苷酸至少9个核苷酸的线性多核苷酸(例如DNA或RNA)序列，例如至少15、18、24、25、27、30、50、100或甚至200个核苷酸长度。
可操作地连接当第一核酸序列处于与第二核酸序列的功能关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。一般地，可操作地连接的DNA序列是邻接的并且连接相同阅读框中的两个蛋白质编码区域是必需的。
ORF(开放阅读框)一系列的无任何终止密码子的编码氨基酸的核苷酸三联体(密码子)。这些序列通常可翻译成肽。
泛酸盐或泛酸用于化妆品、医药和营养品的商业上重要的维生素。在此术语泛酸和泛酸盐可互换使用，并且不仅指游离酸而且也指D-泛酸的盐类，例如钙盐、钠盐、铵盐或钾盐。泛酸盐可使用在此所公开的细胞和方法通过化学合成或生物技术由β-丙氨酸来产生。
测定泛酸盐的量的方法是已知的(例如参见Rieping等人的美国专利No.6,184,006和Eggeling等人的美国专利No.6,177,264)。例如，D-泛酸盐的定量测定可通过使用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)(测试菌株植物乳杆菌ATCC 8014，产品目录号3211-30-3；培养基Bacto泛酸盐分析培养基(实验室，Michigan，美国)，产品目录号0604-15-3)泛酸盐分析来进行。该指示菌株只在指示培养基中存在泛酸盐时才生长并且显示依赖于培养基中泛酸盐浓度的光度可测量的、线性的生长。可使用泛酸盐的半钙盐校准(Sigma产品目录号P2250)。光密度可在580nm的波长确定。
肽的修饰本发明包括丙氨酸2，3-氨基变位酶肽以及合成的实施方案。此外，类似物(非肽的有机分子)、衍生物(从所公开的肽序列开始获得的化学功能化的肽)和具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的变体(同系物)可用于在此所描述的方法中。在此所公开的肽包括可以是天然存在的L-和/或D-氨基酸等的氨基酸序列。
可通过多种化学技术来修饰肽，以产生具有与未修饰的肽本质上活性相同，并任意具有其它所需特性的衍生物。例如，蛋白质的羧基，无论是羧基末端或侧链，可以药物学上可接受的阳离子或酯化的盐的形式提供，以形成C1-C6的酯，或转化为通式为NR1R2的氨化物，其中R1和R2分别为H或C1-C16的烷基，或结合形成诸如5-或6-元环的杂环。肽的氨基，无论是氨基末端或侧链，可以是药物学上可接受的酸的加成盐，诸如HCl、HBr、乙酸、苯甲酸、磺化甲苯、马来酸、酒石酸的和其它有机盐的形式，或可修饰为C1-C16烷基或二烷基氨基或进一步转化为氨化物。
肽侧链的羟基可使用公知的技术转化为C1-C16的烷氧基或C1-C16的酯。肽侧链的苯基和酚环可用一或多种卤素原子，诸如F、Cl、Br或I，或用C1-C16的烷基、C1-C6的烷氧基、羧酸及其酯，或该羧酸的氨化物来替换。肽侧链的亚甲基可延伸至同系的C2-C4烯烃。硫醇可用许多公知的保护基诸如乙酰胺基团中的任何一个来保护。本领域的技术人员也将认识到用于将环状结构导入所公开的肽的方法以选择和提供结构的构象限制而导致稳定性的增加。例如，可将C-或N-末端的半胱氨酸加入肽，使得当氧化该肽时将包含产生环肽的二硫键。肽环化的其它方法包括形成硫醚和羧基和氨基末端的氨化物和酯。
多肽模拟物和有机模拟物的实施方案也在本发明的范围内，因此这种肽-和有机模拟物化学成分的三维结构模仿肽主链和氨基酸侧链成分的三维结构，产生了本发明的具有可检测的丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的蛋白质的多肽-和有机模拟物。为了计算机模型应用，药效基团是用于生物活性的结构要求的理想化三维定义的。肽-和有机模拟物可通过现在的计算机模拟软件(使用计算机辅助的药物设计或CADD)设计来于适合各种药效基团。参见Walters，″药物的计算机辅助模型″，Klegerman和Groves eds.，1993，Pharmaceutical Biotechnology，Interpharm PressBuffalo Grove，IL pp.165-174和Principles of Pharmacology，Munson(ed.)1995，Ch.102，用于CADD的技术说明。使用这种技术制备的模拟物也包括在本发明的范围内。在一个实例中，通过丙氨酸2，3-氨基变位酶或其变体、片段或融合体来产生模拟丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的模拟物。
多核苷酸任意长度的线性核酸序列。因此，多核苷酸包括至少大约15，25，50，75，100，200或400(寡核苷酸)以及全长cDNA的核苷酸分子。
探针和引物″探针″包括含有可检测的标记或报告分子的分离核酸。典型的标记包括放射性同位素、配体、化学发光剂、荧光团和酶。用于标记和指导选择适合于多种目的标记的方法在例如，Sambrook等人(ed.)，分子克隆实验室手册2nd ed.，vol.1-3冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989，和Ausubel等人(ed.) Current Protocols in Molecular Biology，Greene Piblishing和Wiley-Interscience，纽约(定期更新)，1987中有讨论。
″引物″一般是具有10个以上核苷酸(例如，具有大约10个核苷酸和大约100核苷酸之间的核酸分子)的核酸分子。引物可通过核酸杂交退火为互补的靶核酸链来形成引物和靶核酸链之间的杂交物，并随后通过例如DNA聚合酶沿靶核酸链延伸。可使用引物对扩增核酸序列，例如通过聚合酶链反应(PCR)或其它的核酸扩增方法。
用于制备和使用探针和引物的方法描述于例如，参考如Sambrook等人(ed.)，分子克隆实验室手册，第二版，vol.1-3，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989；Ausubel等人(ed.))，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing和Wiley-Interscience，纽约(定期更新)，1987；和Innis等人，PCR ProtocolsA Guideto Methods and Applications，学院出版社San Diego，1990。PCR引物对可来源于已知序列，例如，通过使用例如引物Primer的计算机程序(版本0.5，_1991，Whitehead Institute for Biomedical Research，剑桥，Mass.)根据目的而设计。本领域的技术人员可理解特定探针或引物的特异性随长度而增加，但是探针或引物是在全长序列到短至5个连续的核苷酸序列的大小范围内。因此例如，20个连续核苷酸的引物退火，对于靶而言，比只有15个核苷酸的相应引物具有更高的特异性。因此，为了获得更大的特异性，可选择的探针和引物包含，例如，25，30，35，40，50，60，70，80，90，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，850，900，950，1000，1050，1100，1150，1200，1250，1300，1350，1400，1450，1500或更多连续的核苷酸。
启动子一系列介导核酸转录的核酸调控序列。启动子包括邻近转录起始位点的必需核酸序列，例如，就聚合酶II型启动子来说的TATA元件。启动子还选择性地包括位于离转录起始位点多至数千个碱基的远端的增强子或阻遏元件。
纯化的术语纯化的不要求绝对的纯度；更确切些，它意味着相对的术语。因此，例如，纯化的肽制剂是其中的肽或蛋白质比细胞内部环境中的肽或蛋白质更富集，因此该肽是基本上与可能与其伴随的细胞组分(核酸、脂类、碳水化合物和其它多肽)分离的。在另一个实例中，纯化的肽制剂是其中的肽基本上不受污染的，诸如可能按照肽的化学合成提供。
在一个实例中，当样品重量的至少50％是由肽组成的，例如样品的至少60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、98％或99％或更多是由肽组成时，丙氨酸2，3-氨基变位酶肽是纯化的。可用于纯化抗原的方法实例，包括但不限于，Sambrook等人所公开的方法。(分子克隆实验室手册，冷泉港，纽约，1989，Ch.17)。蛋白质纯度的确定可通过，例如，蛋白质样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后通过染色该聚丙烯酰胺凝胶显示单个多肽的条带；高压液相色谱法；测序；或其它常规方法。
重组重组核酸是一种具有非天然存在的序列和/或通过人工组合两个另外序列的单独片段的序列。该人工组合物通常通过化学来合成或更通常地通过人工操作核酸的分离部分，例如通过遗传工程技术来完成。也使用重组描述已经被人工操作，但包含与在该核酸被分离的生物体中发现的序列相同的调节序列和编码区域的核酸分子。
序列的同一性/相似性两个或更多核酸序列，或两个或更多氨基酸序列之间的同一性/相似性，是用序列之间的同一性或相似性表示的。序列的同一性可以通过同一性百分数来测定；百分比越高，序列则越相同。序列的相似性可以相似性百分数来测定(考虑了保守的氨基酸取代)；百分比越高，序列则越相似。当使用标准方法进行序列比对时，核酸或氨基酸序列的同源物或正类似物具有相对高度的序列同一性/相似性。当正类似的蛋白质或cDNAs源自于关系更近的种属(例如，人和小鼠的序列)时，与源自关系更远的种属(例如，人和C.elegans序列)相比，这种同源性是更显著的。
用于比较序列的比对的方法是本领域公知的。多种程序和序列比对的算法描述于Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2482，1981；Needleman和Wunsch，分子生物学杂志J.Mol.Biol.48443，1970；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.852444，1988；Higgins和Sharp，Gene，73237-44，1988；Higgins和Sharp，CABIOS5151-3，1989；Corpet等人，Nuc.Acid Res.1610881-90，1988；Huang等人，Computer Appls.in the Biosciences8，155-65，1992；和Pearson等人，Meth.Mol.Bio.24307-31，1994.Altschul等人，J.Mol.Biol.Biol.215403-10，1990，提供序列比对方法和同源性计算的具体考虑事项。
NCBIBasicLocal Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul等人，分子生物学杂志J.Mol.Bioi.215403-10，1990)可从几个来源获得，包括国家生物信息中心(NCBI医药的国家图书馆，38A楼，8N805室，Bethesda，MD 20894)和在国际互连网上，用于序列分析的程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx。其它信息可在NCBI网址上找到。
使用BLASTN比较核酸序列，同时使用BLASTP比较氨基酸序列。为了比较两个核酸序列，可如下设置选项-i设置为包含第一个待比较核酸序列的文件(例如，C\seq1.txt)；-j设置为包含第二个待比较核酸序列的文件(例如，C\seq2.txt)；-p设置为blastn；-o设置为任何所需的文件名(例如，C\output.txt)；-q设置为-1；-r设置为2；以及其它选项保持其缺省值。例如，可使用下列命令产生包含两个序列间的比较的输出文件C\B12seq-i c\seq1.txt-j c\seq2.txt-p blastn-o c\output.txt-q-1-r 2。
为了比较两个氨基酸序列，可如下设置选项B12seq-i设置为包含第一个待比较氨基酸序列的文件(例如，C\seq1.txt)；-j设置为包含第二个待比较氨基酸序列的文件(例如，C\seq2.txt)；-p设置为blastp；-o设置为任何所需的文件名(例如，C\output.txt)；且其它选项保持其缺省值。例如，可使用下列命令产生包含两个氨基酸序列间的比较的输出文件C\B12seq-ic\seq1.txtjc\seq2.txt-p blastp-o c\output.txt。如果两个比较的序列具有同源性，然后该指定的输出文件将提供同源性的区域作为排列的序列。如果两个比较的序列不具有同源性，然后该指定的输出文件将不会提供排列的序列比对。
一旦比对，匹配的数目被通过计算相同的核苷酸或氨基酸残基出现于在两个序列中位置的数目来确定。序列同一性的百分数通过匹配的数目除以已鉴定序列中阐明的序列长度，或除以接合长度(例如，来自己鉴定序列中阐明的100个连续的核苷酸或者氨基酸残基)，然后将结果值乘以100来确定。例如，当与具有1154个核苷酸的待测序列对比具有1166个匹配的核酸序列时，则与待测序列具有75.0百分数的同一性(即，1166÷1554×100＝75.0)。序列同一性值的百分数四舍五入为接近十分之一。例如，75.11、75.12、75.13和75.14四舍五入降至75.1，同时75.15、75.16、75.17、75.18和75.19四舍五入为75.2。长度值总是整数。在另一个实例中，目标序列包含与来自己鉴定的序列20个连续的核苷酸排列20个核苷酸的区域，如下包含具有与已鉴定的序列75百分数的序列同一性的区域(即，15-20×100＝75)。
为了比较大于大约30个氨基酸的氨基酸序列，使用Blast 2序列的功能，利用设置为缺省参数的缺省BLOSUM62矩阵，(缺口存在值为11，而每个残基缺口值为1)。通常以对全长氨基酸序列的对比序列，使用NCBI Basic Blast 2.0，用诸如nr或swissprot数据库的缺口blastp计算具有至少70％的序列同一性来表征同源性。通过blastn程序进行的查询搜索用DUST滤过(Hancock和Armstrong，1994，计算机的生物科学应用Comput.Appl.Biosci.1067-70)。其它的程序使用SEG。此外，可进行手工的序列比对。当通过该方法评估时，具有更大相似性的蛋白质可能显示增加的同一性百分数，诸如至少75％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。
当比对短的肽(少于约30个氨基酸)时，比对应使用Blast 2序列功能，利用设置为缺省参数的PAM30矩阵(开放缺口9，延伸缺口罚分1)进行。当通过该方法评估时，具有更大相似性的蛋白质对于参考序列可能显示增加的同一性百分数，诸如至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％，99％的序列同一性。当比较小于全部序列的序列同一性时，同源性可能一般对于10-20个氨基酸的区域具有至少75％的序列同一性，以及可根据它们对于参考序列的同一性而具有至少85％、90％、95％或98％的序列同一性。用于确定这种短区域的序列同一性的方法在NCBI网址上有描述。
两种核酸分子关系紧密的指示是两种分子在严谨条件下相互杂交。严谨条件是序列依赖的并且在不同的环境参数下是不同的。在严谨条件下与丙氨酸2，3-氨基变位酶基因序列杂交的核酸分子通常在如上所述的条件下分别杂交于基于全部的丙氨酸2，3-氨基变位酶基因或选择的部分基因的探针。
由于遗传密码的简并性，不显示高度同一性的核酸序列可能仍然编码相同的或相似的(保守的)氨基酸序列。可通过使用该简并性产生所有编码本质上相同的蛋白质的多种核酸分子来产生核酸序列中的变化。这种同源的核酸序列可，例如，具有至少60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的通过该方法测定的序列同一性。
本领域的技术人员可意识到这些序列同一性的范围只是用于提供指导；获得的强烈显著的同源性超出所提供的范围是有可能的。
两种核酸序列是基本上相同的可选择的(而非必要累积的)指示是第一核酸编码的多肽与第二核酸编码的多肽是免疫交叉反应的。
特异性结合剂基本上只结合限定的靶，诸如目标肽的试剂。例如，丙氨酸2，3-氨基变位酶结合剂包括抗丙氨酸2，3-氨基变位酶的抗体和基本上只结合丙氨酸2，3-氨基变位酶的其它试剂(例如肽或药物)。可使用丙氨酸2，3-氨基变位酶蛋白质(或其片段)的抗体来纯化或鉴定这种蛋白质。
转化的例如通过分子生物学技术将核酸分子导入细胞。如在此所使用的，术语转化包含将核酸分子引入该细胞的所有技术，包括但不限于用病毒载体转染，接合、用质粒载体转化并且通过电穿孔、脂质转染和粒子加速枪导入裸露的DNA。
变体、片段或融合蛋白质本发明的丙氨酸2，3氨基变位酶蛋白质，包括其变体、片段和融合体。编码蛋白质(例如SEQ ID NO20或29)、融合的丙氨酸2，3氨基变位酶蛋白质或丙氨酸2，3氨基变位酶蛋白质的片段或变体的DNA序列可被工程化以允许蛋白质在真核细胞、细菌、昆虫和/或植物中表达。为了获得表达，DNA序列可被改变并且可操作地连接到其它调节序列上。包含调节序列和蛋白质的最终产物称为载体。该载体可被导入真核、细菌、昆虫和/或植物细胞。一旦在细胞内部该载体允许蛋白质的产生。
融合蛋白质包括，例如丙氨酸2，3-氨基变位酶(或其变体、多态型、突变体或片段)，例如SEQ ID NO21或30，连接到不抑制所需的丙氨酸2，3氨基变位酶活性，例如不抑制转化α-丙氨酸为β-丙氨酸的能力的其它氨基酸序列上的蛋白质。在一个实例中，另一个氨基酸序列不多于大约10，12，15，20，25，30或50个氨基酸的长度。
本领域的普通技术人员可意识到DNA序列可在多个方面被改变而不影响该编码的蛋白质的生物活性。例如，可使用PCR在编码丙氨酸2，3-氨基变位酶的DNA序列中产生变化。这种变体可以是为用于表达该蛋白质的宿主细胞所偏爱的密码子，或促进表达的其它序列变化而优化的变体。
载体被导入细胞从而产生转化细胞的核酸分子。载体可包括允许它在细胞中例如复制原点复制的核酸序列。载体还可包括一或多种可选择的标记基因和其它本领域已知的遗传元件。
丙氨酸2，3-氨基变位酶的核酸和多肽具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的多肽被公开在此。在一个实例中，该多肽是突变的氨基变位酶氨基酸序列，例如赖氨酸2，3-氨基变位酶、亮氨酸2，3-氨基变位酶或赖氨酸5，6-氨基变位酶序列。具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的多肽的实例显示在SEQ ID NOS21和30中。然而，本发明还包含保持丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的SEQ IDNOS21和30的变体、融合体和片段。可使用的片段的实例包括，但不限于SEQ ID NO21的氨基酸50-390，50-350、60-350，75-340或100-339和SEQ ID NO30的氨基酸1-390、15-390，15-340或19-331。可被取代，同时仍然保持丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的实例，包括但不限于SEQ ID NO21的V21I或V21L；Y71P；L17I；K361R；A410V；和/或Y430F或Y430W，和SEQ ID NO30的T40S；V96I或V96L；D102E；A252V；和/或L393V，以及其组合。
本发明提供了酶多肽，诸如丙氨酸2，3-氨基变位酶(例如SEQ ID NO21和/或30，及其保持丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的变体、片段和融合体)。本领域的技术人员将理解可使用变化的酶序列，只要该酶保持所需的酶活性，例如丙氨酸2，3-氨基变位酶活性。例如，所公开的内容提供包含与例如丙氨酸2，3氨基变位酶序列的酶序列相同的至少15个连接的氨基酸的多肽。可以理解本发明也提供包含多于至少15个氨基酸残基(例如，至少16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，50，75，100，150，200，250，300或更多氨基酸残基)的氨基酸序列的多肽，和与在此所公开的或其它公开可利用的任何酶相同的多肽。
此外，本发明提供了酶的多肽，诸如丙氨酸2，3-氨基变位酶肽(例如，SEQ ID NO21和/或30)，其包括具有酶氨基酸序列变化的氨基酸序列。变体序列可包含单个插入、单个缺失、单个取代、多个插入、多个缺失、多个取代，或其任何组合(例如，单个缺失和多个插入一起)。这种多肽与诸如丙氨酸2，3-氨基变位酶序列的酶序列具有至少60，65，70，75，80，85，90，95，97，98或99％的序列同一性，只要通过该氨基酸序列编码的肽保持所要求的酶活性。
具有变异氨基酸序列的多肽可保持酶活性，诸如丙氨酸2，3-氨基变位酶活性。这种多肽可通过使用诸如定点诱变或PCR的标准方法操作编码多肽的核苷酸序列来产生。一种类型的修饰包括一或多个氨基酸残基的取代，诸如不超过10个氨基酸取代具有相似生物化学性质的氨基酸残基，即保守取代。
更多实质的变化可通过选择较少保守的取代来获得，例如，选择在保持下列性质中有显著不同影响的残基(a)在取代的区域内多肽主链的结构，例如片层或螺旋构象；(b)在靶位点多肽的电荷或疏水性；或(c)侧链的体积。一般预期在多肽的功能上产生大的变化的取代是(a)亲水残基，例如，丝氨酸或苏氨酸取代(或被)疏水的残基，例如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸(取代)；(b)半胱氨酸或脯氨酸被(或通过)任何其它残基取代；(c)具有正电侧链的残基，例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代(或被)负电残基，例如谷氨酸或天冬氨酸(取代)；或(d)具有大的侧链的残基，例如苯丙氨酸取代(或被)不具有侧链的残基，例如甘氨酸(取代)。这些氨基酸取代(或其它缺失或加入)的效果可通过如同相关的天然多肽催化相同的产物分析该多肽催化相同底物转化的能力而评估具有酶活性的多肽。因此，在此提供具有不超过5，10，20，30，40或50个保守取代的多肽。
本发明也公开了编码具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的多肽，例如包括SEQ ID NO20或29的序列的分离核酸。然而，本发明还包含保持编码具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的蛋白质或肽的SEQ IDNOS20和29的变体、融合体和片段。在一个实例中编码具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性多肽的分离核酸被可操作地连接到启动子序列上，且可成为载体的一部分。该核酸可以是用于转化细胞并制备转化细胞和/或转基因的非人哺乳动物的重组核酸。
本发明公开了包括编码具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性多肽(例如SEQ ID NO20和/或29或保持丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的其片段、融合体或变体)的至少一个外源核酸分子的转化细胞。在一个实例中，这种转化的细胞由α-丙氨酸产生β-丙氨酸。在另一个实例中，该细胞产生3-HP、泛酸、CoA和/或有机化合物诸如1，3-丙二醇。
编码在此所公开的酶的核酸序列，诸如丙氨酸2，3-氨基变位酶(SEQ ID NO20和29)、赖氨酸2，3-氨基变位酶(SEQ ID NOS3和28)，以及β-丙氨酰基CoA氨裂解酶SEQ ID NO22)、(以及在此所公开的任何其它酶)，可以包含编码酶及其保持所需的酶活性的部分的全部核酸序列。例如，酶的核酸可以包含酶核酸序列的至少15个连续的核苷酸。可以理解本发明也提供了包含多于15个核苷酸(例如，至少16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，40，50，75，10，200，500或更多核苷酸)长度的核苷酸序列，以及与诸如SEQ ID NO20和/或29所显示丙氨酸2，3-氨基变位酶序列的酶序列任何部分相同的分离核酸。
此外，本发明提供了包含酶序列的变化，例如变异的丙氨酸2，3-氨基变位酶核酸序列的分离的酶核酸序列。变体可包含单个插入、单个缺失、单个取代、多个插入、多个缺失、多个取代，或其任何组合(例如，单个缺失和多个插入一起)，只要由此编码的肽保持丙氨酸2，3-氨基变位酶活性。这种分离的核酸分子可与例如丙氨酸2，3-氨基变位酶序列的酶序列具有至少60，70，75，80，85，90，92，95，97，98或99％的序列同一性，只要由该核酸编码的肽保持所需要的酶活性，例如丙氨酸2，3-氨基变位酶活性。例如，可对丙氨酸2，3-氨基变位酶核酸序列产生下列变异对于SEQ ID NO20，12位的″a″可用″g″取代；1050位的″g″可用″a″取代；255位的″a″可用″g″″t″或″c″取代；对于SEQ ID NO29，6位的″a″可用″g″″t″或″c″取代；66位的″t″可用″c″取代；以及315位的″g″可用″a″″t″或″c″取代。
特定种类的密码子偏好和密码子用法表可用于工程改造利用特定种属的密码子偏好的分离的核酸分子。例如，在此所公开的酶可以设计成具有特定的目的生物体优先使用的密码子。
本发明也提供了编码酶的分离的核酸序列，例如丙氨酸2，3-氨基变位酶，其中该序列是至少大约12个碱基的长度(例如，至少大约13，14，15，16，17，18，19，20，25，30，40，50，60，100，250，500，750，1000，1500，2000，3000，4000或5000个碱基长度)并在杂交条件下与编码酶的核酸的有义链或反义链杂交。杂交条件可以是中等或高度的严谨杂交条件。
多肽和编码多肽的核酸可通过标准的DNA诱变技术来产生，例如M13引物诱变。这些技术的细节提供于Sambrook等人(ed.)，分子克隆实验室手册，第二版，vol.1-3，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989，CH.15中。核酸分子可包含编码区域的变化以适合被导入分子的特定生物体对密码子使用的偏好。
可选择地，该编码区域可通过利用遗传密码的简并性来改变编码序列，同时以这种方式基本上改变了核酸序列，它仍然编码具有相同氨基酸序列或基本上与天然的氨基酸序列相似的多肽。例如，由于遗传密码的简并性，丙氨酸通过4种核苷酸密码子的三联体编码GCT、GCA、GCC和GCG。因此，开放阅读框的核酸序列可以在丙氨酸位置变化为任何这些密码子而不影响编码多肽的氨基酸序列或该多肽的特性。基于遗传密码的简并性，核酸变体可来源于使用如在此所描述的标准DNA诱变技术，或通过核酸序列的合成的核酸序列。因此，本发明也包含编码相同多肽但借助遗传密码的简并性而在核酸序列方面不同的核酸分子。
具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的细胞本发明公开了具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的细胞。这种细胞可以由α-丙氨酸产生β-丙氨酸。在一个实例中，这种细胞具有取决于天然存在的突变，和/或该细胞染色体中引发的突变，例如通过将细胞暴露于化学或紫外的诱变，的丙氨酸2，3-氨基变位酶活性。包括丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的细胞可以是真核或原核的。这种细胞的实例包括但不限于，乳杆菌、乳球菌、芽胞杆菌、埃希氏杆菌、Geobacillus、棒状杆菌(Corynebacterium)、梭状芽胞杆菌、真菌、植物和酵母细胞。在一个实例中，植物细胞是植物，诸如转基因植物的一部分。
在一个实例中，具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的细胞是转化的细胞。这种细胞可包括编码丙氨酸2，3-氨基变位酶，例如包含SEQ ID NO20或29的序列，或其保持编码具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的蛋白质的能力的变体、片段或融合体的至少一个外源核酸分子。在一个实例中，该外源的核酸分子是突变的赖氨酸2，3-氨基变位酶，例如突变的原核的赖氨酸2，3-氨基变位酶。在特异的实例中，该突变的原核生物的赖氨酸2，3-氨基变位酶是突变的枯草芽孢杆菌、耐放射异常球菌、近端梭菌、粪产碱菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌或牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸2，3-氨基变位酶。其它的赖氨酸2，3-氨基变位酶可通过使用本领域已知的方法鉴定，例如通过在BLAST上搜索相似的序列和/或通过使用杂交的方法。在特异的实例中，突变的赖氨酸2，3-氨基变位酶是突变的枯草芽孢杆菌或突变的牙龈卟啉单胞菌赖氨酸2，3-氨基变位酶。在另一个实例中，外源的核酸分子是突变的赖氨酸5，6-氨基变位酶，例如突变的原核的赖氨酸5，6-氨基变位酶。可选择地，外源的核酸分子是突变的亮氨酸2，3-氨基变位酶，或突变的赖氨酸5，6-氨基变位酶，例如突变的斯氏梭菌(C.sticklandii)赖氨酸5，6-氨基变位酶。
在特定的实例中，突变的赖氨酸2，3-氨基变位酶是在L103、D339和/或M136位具有取代突变的枯草芽孢杆菌赖氨酸2，3-氨基变位酶。例如，取代可包括L103M、L103K、L103R、L103E或L103S的取代。在另一个或附加的实例中，取代包括D339H、D339Q、D339T或D339N的取代。在又一个实例中，取代可包括L103M、M136V的取代，D339H的取代或其任意组合。
本发明公开了包括丙氨酸2，3-氨基变位酶活性以及其它酶活性的细胞。可使用这种细胞生产β-丙氨酸、3-HP、泛酸、CoA和有机酸、多元醇，诸如1，3-丙二醇、丙烯酸、聚合的丙烯酸酯、丙烯酸的酯、聚合的3-HP、3-HP和诸如丁酸的其它化合物的共聚合物、戊酸酯或盐和其它化合物以及3-HP的酯。
在一个实例中，这种细胞也包括丙氨酸脱氢酶或丙酮酸/谷氨酸转氨酶活性、CoA转移酶活性或CoA合成酶、β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性、3-HP-CoA脱水酶活性、谷氨酸脱氢酶活性、3-羟丙酰基-CoA水解酶或3-羟异丁酰-CoA水解酶活性。在另一个实例中，这种细胞也包括丙氨酸脱氢酶或丙酮酸-谷氨酸转氨酶活性、4-氨基丁酸和/或β-丙氨酸-2-氧化戊二酸氨基转移酶活性、谷氨酸脱氢酶活性，以及3-HP或3-羟基异丁酸脱氢酶活性。在这些实例中，可使用细胞来产生3-HP。
在另一个实例中，细胞也包括丙氨酸脱氢酶或丙酮酸/谷氨酸转氨酶活性、CoA转移酶或CoA合成酶活性、β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性、3-HP-CoA脱水酶活性、谷氨酸脱氢酶活性，以及3-羟丙酰基-CoA水解酶3-羟异丁酰-CoA水解酶活性。在另一个实例中，这种细胞也包括丙氨酸脱氢酶或丙酮酸-谷氨酸转氨酶活性、4-氨基丁酸和/或β-丙氨酸-2-氧化戊二酸氨基转移酶活性、谷氨酸脱氢酶活性，以及3-HP或3-羟基异丁酸脱氢酶活性；以及脂肪酶或酯酶活性。可使用这种细胞生产3-HP的酯，诸如3-羟基丙酸甲酯、3-羟基丙酸乙酯、3-羟基丙酸丙酯、3-羟基丙酸丁酯或3-羟基丙酸2-乙基己基酯。
在另一个实例中，细胞也包括丙氨酸脱氢酶或丙酮酸/谷氨酸转氨酶活性、CoA合成酶活性、β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性、3-HP-CoA脱水酶活性、谷氨酸脱氢酶活性；以及聚醇酸合酶活性。可使用这种细胞生产聚合的3-HP。
在又一个实例中，细胞也包括丙氨酸脱氢酶或丙酮酸/谷氨酸转氨酶活性、CoA合成酶活性、β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性、谷氨酸脱氢酶活性以及聚羟酸合酶活性。可使用这种细胞生产聚合的丙烯酸酯。
在另一个实例中，细胞也包括丙氨酸脱氢酶或丙酮酸/谷氨酸转氨酶活性、CoA转移酶或CoA合成酶活性、β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性、谷氨酸脱氢酶活性，以及脂肪酶或酯酶活性，其中可使用该细胞生产丙烯酸的酯，例如丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯或丙烯酸丁酯。
可选择地，这种细胞也包括丙氨酸脱氢酶或丙酮酸-谷氨酸转氨酶活性、CoA转移酶或CoA合成酶活性、β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性、3-HP-CoA脱水酶活性、谷氨酸脱氢酶活性、3-羟丙酰基-CoA水解酶或3-羟异丁酰-CoA水解酶活性，以及醛或乙醇脱氢酶活性。可使用这种细胞生产1，3-丙二醇。
在一个实例中，细胞也具有α-酮泛酸羟甲基转移酶(E.C.2.1.2.11)、α-酮泛酸还原酶(E.C.1.1.1.169)，以及泛酸合成酶(E.C.6.3.2.1)活性。可使用这种细胞生产泛酸。可选择地或另外地，该细胞也具有泛酸激酶(E.C.2.7.1.33)、4′-磷酸羟泛酰基-1-半胱氨酸合成酶(E.C.6.3.2.5)、4′-磷酸羟泛酰基半胱氨酸脱羧酶(E.C.4.1.1.36)、ATP4‘-磷酸泛酰巯基乙胺腺嘌呤转移酶(E.C.2.7.7.3)，以及脱磷酸-CoA激酶(E.C.2.7.1.24)活性。可使用这种细胞生产辅酶A(CoA)。
鉴定具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的细胞的方法本发明公开了鉴定具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的细胞的方法。该方法包括在含有α-丙氨酸而不是β-丙氨酸或泛酸的培养基中，或在其中细胞可由培养基来源的碳、氧、氢和氮产生α-丙氨酸，但不包括β-丙氨酸或泛酸的培养基中，培养功能性缺失panD的细胞，例如原核细胞，以及鉴定能够在缺乏β-丙氨酸或泛酸的培养基中生长的细胞。在特定的实例中，该细胞也是功能性缺失panF的。细胞的生长表明细胞由α-丙氨酸产生β-丙氨酸，也表明该细胞具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性。相反，如果细胞不在缺乏β-丙氨酸或泛酸得培养基上生长和/或生存，表明该细胞不能由α-丙氨酸产生β-丙氨酸，也表明该细胞不具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性。
在一个实例中，功能性缺失panD的细胞用一或多种突变的氨基变位酶转化，诸如包括突变的赖氨酸2，3-氨基变位酶、突变的亮氨酸2，3-氨基变位酶和/或突变的赖氨酸5，6-氨基变位酶的文库。在特定的实例中，该细胞在培养和筛选前用突变的赖氨酸2，3-氨基变位酶的文库转化。酶赖氨酸2，3-氨基变位酶先前已经从近端梭菌SB4(Chirpich等人，生物化学杂志J.Bio1.Chem.2451778-89，1970)和枯草芽孢杆菌(Chen等人，生物化学杂志Biochem.J.348539-49，2000)中克隆出来，并且已经显示催化赖氨酸和β-赖氨酸的相互转化。突变的氨基变位酶，诸如突变的赖氨酸2，3-氨基变位酶，可筛选其赋予的丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的能力。此外，尽管具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的多肽先前没有描述，这样的酶可能存在于自然界中。因此，功能性缺失panD的细胞可用包括编码丙氨酸2，3-氨基变位酶的基因的文库转化，并且通过赋予这些细胞在包含α-丙氨酸，或碳、氧、氢，和氮源的培养基中生长的能力以使得该细胞可产生α-丙氨酸，而不包含β-丙氨酸或泛酸来分离该基因。
在另一个实例中，该方法进一步包括在突变的氨基变位酶中鉴定突变体，随后鉴定该突变的氨基变位酶赋予该细胞丙氨酸2，3-氨基变位酶活性因而能在培养基中生长的细胞。为了鉴定该突变，氨基变位酶的核酸或氨基酸可被测序并且与非突变的氨基变位酶序列相比，以鉴定赋予细胞丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的突变。
生产具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的肽的方法本发明公开了生产具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的丙氨酸2，3-氨基变位酶肽的方法。该方法包括在允许细胞生产丙氨酸2，3-氨基变位酶肽的条件下培养所公开的具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的细胞。在一个实例中，该方法包括培养具有一或多种编码丙氨酸2，3-氨基变位酶(例如包括SEQ ID NO20和/或29或保持丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的其变体、融合体或片段的序列)的外源核酸分子的细胞，从而生产丙氨酸2，3-氨基变位酶。
本发明也公开了从α-丙氨酸制备β-丙氨酸的方法。在一个实例中，该方法包括在允许细胞由α-丙氨酸产生β-丙氨酸的条件下培养具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的细胞。在一个实例中，该方法包括培养具有一或多种编码丙氨酸2，3-氨基变位酶的外源核酸分子的细胞，以使得该丙氨酸2，3-氨基变位酶能够由α-丙氨酸产生β-丙氨酸。在一个实例中，外源的核酸包括SEQ ID NO20和/或29或保持其丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的变体、融合体或片段的序列。
在特定的实例中，该细胞功能性缺失panD或panD和panF。
产生3-HP、泛酸及其衍生物的途径本发明公开了涉及通过丙氨酸2，3-氨基变位酶，例如使用所公开的丙氨酸2，3-氨基变位酶序列和所公开的具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的丙氨酸细胞从α-丙氨酸生产β-丙氨酸的方法和材料。此外公开了涉及由β-丙氨酸产生泛酸和3-HP，以及CoA和例如1，3-丙二醇、丙烯酸、聚合的丙烯酸盐、丙烯酸的酯、聚合的3-HP、3-HP和其它化合物的共聚合物，诸如丁酸酯、戊酸酯及其它化合物，以及3-HP的酯的其它有机化合物的方法和材料。具体地，本发明提供了用于由α-丙氨酸产生β-丙氨酸的丙氨酸2，3-氨基变位酶的核酸(诸如SEQID NO20和29)、多肽(例如SEQ ID NO21和30)、宿主细胞，以及方法和材料，其中可使用α-丙氨酸更有效地制备β-丙氨酸泛酸和3-HP及其衍生物，诸如CoA和诸如1，3-丙二醇、丙烯酸、聚合的丙烯酸盐、丙烯酸的酯、聚合的3-HP和3-HP的酯的有机化合物。
可使用几个代谢途径从已经由α-丙氨酸产生的β-丙氨酸生产有机化合物(图1和3)。
3-HP和其衍生物的途径如图1所示，β-丙氨酸可通过使用具有CoA转移酶活性(EC 2.8.3.1)或CoA合酶活性(E.C.6.2.1.-)的多肽转化为β-丙氨酰基-CoA。β-丙氨酸可从α-丙氨酸通过宿主细胞转化α-丙氨酸为β-丙氨酸的内源多肽，和/或通过使用用重组的丙氨酸2，3-氨基变位酶，诸如包括SEQID NO20和/或29或其保持丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的片段、变体或融合体的序列转化的细胞来产生。β-丙氨酰基-CoA可随后通过使用具有β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性(EC 4.3.1.6)的多肽转化为烯丙酰-CoA。烯丙酰-CoA可随后通过使用具有3-HP-CoA脱水酶活性(EC 4.2.1.-)的多肽转化为3-羟丙酰基-CoA(3-HP-CoA)。3-HP-CoA可随后通过几个酶转化为3-HP，这几个酶包括但不限于具有CoA转移酶活性(EC 2.8.3.1)的多肽、具有3-羟丙酰基-CoA水解酶活性(EC 3.1.2.-)的多肽，和具有3-羟异丁酰-CoA水解酶活性(EC 3.1.2.4)的多肽，可使用这些酶将3-HP-CoA转化为3-HP。
如图1所示，可通过利用具有4-氨基丁酸和/或β-丙氨酸-2-酮戊二酸氨基转移酶活性的多肽从β-丙氨酸产生3-HP，其中从β-丙氨酸产生丙二酸半醛。该丙二酸半醛可用具有3-HP脱氢酶活性(EC 1.1.1.59)的多肽或具有3-羟基异丁酸脱氢酶活性(EC 1.1.1.31)的多肽转化为3-HP。
3-HP的衍生物可如图1所示从β-丙氨酸来产生。所得的3-HP-CoA可通过具有多醇酸合酶活性(EC 2.3.1.-)的多肽转化为聚合的3-HP。可选择地或另外地，3-HP-CoA可通过具有氧化还原酶活性或还原酶活性的多肽转化为1，3-丙二醇。
所得到的烯丙酰-CoA可通过具有多醇酸合酶活性(EC 2.3.1.-)的多肽转化为聚合的丙烯酸。可选择地或另外地，烯丙酰-CoA可通过具有CoA转移酶活性和/或CoA水解酶活性的多肽转化为丙烯酸；并且所得的丙烯酸可通过具有脂肪酶或酯酶活性的多肽转化为丙烯酸的酯。
所得到的3-HP可通过具有脂肪酶或酯酶活性(EC 3.1.1.-)的多肽转化为3-HP的酯。可选择地或另外地，可通过具有醛脱氢酶活性的多肽和具有乙醇脱氢酶活性的多肽的组合从3-HP产生1，3-丙二醇。
泛酸及其衍生物的途径如图3所示，可通过转化β-丙氨酸为泛酸具有α-酮泛酸羟甲基转移酶(E.C.2.1.2.11)、α-酮泛酸还原酶(E.C.1.1.1.169)和泛酸合酶(E.C.6.3.2.1)活性的肽从β-丙氨酸来产生泛酸。
泛酸的衍生物可从β-丙氨酸产生如下。所得到的泛酸可被通过具有泛酸激酶(E.C.2.7.1.33)、4′-磷酸泛醇酰-1-半胱氨酸合成酶(E.C.6.3.2.5)、4′-磷酸泛醇酰半胱氨酸脱羧酶(E.C.4.1.1.36)、ATP4′-磷酸泛酰巯基乙胺腺嘌呤转移酶(E.C.2.7.7.3)和脱磷酸-CoA激酶(E.C.2.7.1.24)活性的多肽转化为CoA。
酶具有赖氨酸2，3-氨基变位酶活性的多肽以及编码该多肽的核酸可以从多种种属中获得，包括但不限于近端梭菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、耐放射异常球菌、牙龈卟啉单胞菌、嗜热产液菌(Aquifex aolicus)，或流感嗜血杆菌。例如，具有赖氨酸2，3-氨基变位酶活性的氨基酸序列显示在枯草芽孢杆菌的SEQ ID NO31和牙龈卟啉单胞菌的SEQ ID NO28中。
在另一个实例中，编码具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的多肽的核酸显示于枯草芽孢杆菌的SEQ ID NO20(相应的氨基酸序列显示于SEQ ID NO21)，以及显示于牙龈卟啉单胞菌的SEQ ID NO29(相应的氨基酸序列显示于SEQ ID NO30)。此外，其它具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的多肽和编码这种多肽的核酸，可使用在此描述的方法获得。例如，可使用丙氨酸2，3-氨基变位酶变体编码如上所述具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的多肽。
具有CoA转移酶活性的多肽和编码这种多肽的核酸可从多种种属中获得，包括但不限于，埃氏巨球型菌、丙酸梭菌、克氏梭菌(Clostridium kluyveri)和大肠杆菌。例如，编码具有CoA转移酶活性的多肽的核酸显示于埃氏巨球型菌的SEQ ID NO24。此外，具有CoA转移酶活性的多肽(SEQ ID NO25)和编码这种多肽的核酸(SEQ ID NO24)可如在此所描述的获得。例如，可使用CoA转移酶变体编码具有CoA转移酶活性的多肽。例如，可对CoA转移酶的核酸序列(SEQ ID NO24)进行下列变化49位的″a″可用″c″取代；590位的″a″可用″atgg″取代；可在393位的″g″前插入″aaac″；或736位的″gaa″可被缺失。可以理解序列表中所列出的序列可包含许多变化和任何类型变化的组合，只要该肽保持CoA转移酶活性。此外，可对显示于SEQ ID NO25的CoA转移酶的氨基酸序列进行下列变化17位的″k″可用″p″或″h″取代；125位的″v″可用″i″或″f″取代。
具有β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性的多肽和编码这种多肽的核酸可从包括但不限于丙酸梭菌的多种种属中获得。例如，编码具有β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性的多肽复合物的核酸可从如实施例10中所描述的丙酸梭菌获得。编码β-丙氨酰基CoA氨裂解酶的核酸可包含如SEQ ID NO22中列出的序列。此外，具有β-丙氨酰基CoA氨裂解酶活性的多肽(SEQ ID NO23)以及编码这种多肽的核酸(SEQ ID NO22)可如在此所描述的获得。例如，可使用显示于SEQ ID NO22的β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶序列的变体编码具有β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性的多肽。
具有3-羟丙酰基-CoA脱水酶活性(也称为烯丙酰基-CoA水合酶活性)的多肽和编码这种多肽的核酸可获自包括但不限于，橙色绿屈挠菌(Chloroflexus auranticus)、皱褶假丝酵母(Candida Rugosa)、深红红螺菌(Rhodosprillium rubrum)和荚膜红细菌(Rhodobacter capsulates)。例如，编码具有3-羟丙酰基-CoA脱水酶活性的多肽的核酸在WO02/42418中公开。
具有谷氨酸脱氢酶活性的多肽和编码这种多肽的核酸可从多种种属获得。
具有3-羟丙酰基-CoA或3-羟异丁酰-CoA水解酶活性的多肽和编码这种多肽的核酸可从包括但不限于荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、黑家鼠(Rattus rattus)和人(Homo sapiens)的多种种属获得。例如，编码具有3-羟异丁酰基-CoA水解酶活性的多肽的核酸可从人属获得并且已经具有如GenBank登录号U66669所列出的序列。
具有4-氨基丁酸和/或β-丙氨酸-2-酮戊二酸氨基转移酶活性、3-HP脱氢酶活性和3-羟基异丁酸脱氢酶活性的多肽以及编码这种多肽的核酸可从多种种属获得。
具有多醇酸合酶活性的多肽和编码这种多肽的核酸可从包括但不限于，类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、食酸丛毛单胞菌(Comamonas acidororans)、(Ralstonia eutropha)和食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)的多种种属获得。例如，编码具有多醇酸合酶活性的多肽的核酸可从类球红细菌和如GenBank登录号X97200列出的序列获得。关于多醇酸合成酶的辅助信息可在Song等人(Biomacromolecules 1433-9，2000)中找到。
具有乙酰化醛NAD(+)氧化还原酶活性(EC1.2.1.10)的多肽和编码这种多肽的核酸可从但不限于大肠杆菌的多种种属获得。例如，编码具有酰化的醛脱氢酶活性的多肽的核酸可获自大肠杆菌且具有GenBank登录号Y09555所示的序列。
醛NAD(+)氧化还原酶活性和醇NAD(+)氧化还原酶活性可通过如上所述两种不同的多肽携带，或通过单个多肽携带，例如来自大肠杆菌的多官能的醛乙醇脱氢酶(EC1.2.1.10)(Goodlove等人Gene 85209-14，1989；GenBank登录号No.M33504)。
具有醛脱氢酶(NAD(P)+)(EC1.2.1.-)活性的多肽和编码这种多肽的核酸可从包括但不限于，啤酒酵母的多种种属中获得。例如，编码具有醛脱氢酶活性的多肽的核酸可从啤酒酵母(S.cerevisiae)中获得并具有GenBank登录号No.Z75282所示的序列(Tessier等人，FEMS Microbiol.Lett.16429-34，1998)。
具有乙醇脱氢酶活性(EC1.1.1.1)的多肽和编码这种多肽的核酸可从包括但不限于运动发酵单胞菌(Z.mobilis)的多种种属中获得。例如，编码具有乙醇脱氢酶活性的多肽的核酸可从运动发酵单胞菌中获得并具有GenBank登录号No.M32100所示的序列。
具有脂肪酶活性的多肽和编码这种多肽的核酸可从包括但不限于，皱褶假丝酵母、热带假丝酵母(Candida tropicalis)和白色假丝酵母(Candida albicans)的多种种属获得。例如，编码具有脂肪酶活性的多肽的可从皱褶假丝酵母中获得并具有GenBank登录号A81171所示的序列。
具有α-酮泛酸羟甲基转移酶和泛酸合酶活性的多肽和编码这种多肽的核酸可从包括但不限于大肠杆菌的多种种属获得。例如，编码具有α-酮泛酸羟甲基转移酶和泛酸合酶活性的多肽的核酸可从大肠杆菌中获得并具有GenBank登录号L17086所示的序列。
具有α-酮泛酸还原酶、泛酸激酶、4′-磷酸泛醇酰-L-半胱氨酸合成酶、4′-磷酸泛醇酰半胱氨酸脱羧酶、ATP4′-磷酸泛酰巯基乙胺腺嘌呤转移酶和脱磷酸-CoA激酶活性的多肽和编码这种多肽的核酸可从包括但不限于大肠杆菌的多种种属中获得。例如，编码具有α-酮泛酸还原酶泛酸激酶、4′-磷酸泛醇酰-1-半胱氨酸合成酶、4′-磷酸泛醇酰半胱氨酸脱羧酶、ATP4′-磷酸泛酰巯基乙胺腺嘌呤转移酶和脱磷酸-CoA激酶活性的多肽的核酸可从大肠杆菌中获得并具有GenBank登录号NC000913所列出的序列。
术语″具有酶活性的多肽″是指催化其它物质的化学反应而在完成该反应的过程中本身并不被破坏或改变的任何多肽。一般地，具有酶活性的多肽催化从一或多种底物形成一或多种产物。这种多肽可具有任何类型的酶活性包括但不限于，酶活性或与下列酶相关的酶活性，诸如丙氨酸2，3-氨基变位酶、脱水酶/水合酶、3-羟丙酰基-CoA脱水酶/水合酶、丙氨酸脱氢酶、CoA转移酶、3-羟丙酰基-CoA水解酶、3-羟异丁酰-CoA水解酶、CoA水解酶、多醇酸合酶、β-丙氨酸氨裂解酶、4-氨基丁酸或β-丙氨酸-2-酮戊二酸氨基转移酶、3-HP脱氢酶、3-羟基异丁酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、脂肪酶、酯酶、乙酰化醛NAD(+)氧化还原酶、醇NAD(+)氧化还原酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶羟甲基转移酶、还原酶、合酶、激酶、合成酶、脱羧酶、α-酮泛酸羟甲基转移酶、α-酮泛酸还原酶、泛酸合成酶、泛酸激酶、4′-磷酸泛醇酰-1-半胱氨酸合成酶、4′-磷酸泛醇酰半胱氨酸脱羧酶、ATP4′-磷酸泛酰巯基乙胺腺嘌呤转移酶、脱磷酸-CoA激酶、乙酰化醛NAD(+)氧化还原酶、醇NAD(+)氧化还原酶、醛脱氢酶(NAD(P)+)、醇脱氢酶和腺嘌呤转移酶。
制备3-HP、泛酸及其衍生物的方法图1和3中描述的途径所提供的每个步骤都可在细胞内(体内)或细胞外(体外，例如，在容器或柱中)进行。此外，有机化合物产物可通过体内合成和体外合成的组合来产生。另外，体外步骤可经过化学反应或酶促反应来进行。
例如，可使用在此提供的细胞或微生物进行图1和3中提供的步骤，或可使用包含具有所显示的酶活性的多肽的提取物进行图1和3提供的步骤。此外，可使用化学处理进行图1和3中的转化。例如，可通过水解将烯丙酰-CoA转化为丙烯酸。其它的化学处理包括但不限于，将丙烯酸转化为丙烯酸酯的反式酯化作用。
多肽的表达在此所描述的多肽，诸如图1中所列出的酶可以在宿主细胞或组合的宿主细胞中分别生产。此外，具有特定酶活性的多肽可以是天然存在或非天然存在的多肽。天然存在的多肽是具有在自然界中发现的氨基酸序列，包括野生型和多态型多肽的任何多肽。天然存在的多肽可获自包括但不限于，动物(例如，哺乳动物)、植物、真菌和细菌的任何种属。非天然存在的多肽是具有未在自然界中发现的氨基酸序列的任何多肽。因此，非天然存在的多肽可以是天然存在的多肽的突变形式或工程化的多肽。例如，具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的非天然存在的多肽可以是具有赖氨酸2，3-氨基变位酶活性，以及至少一些丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的天然存在的多肽的突变体(例如SEQID NO21和/或30)。多肽可以通过例如序列的添加、缺失、置换或其组合来进行突变。
本发明公开了遗传改变的细胞，可使用该细胞实施在这里所描述途径中的一个或多个步骤或可使用该遗传改变的细胞用于后续的在体外生产所公开的多肽。例如，单独的微生物可包含编码为实施图1和3中描述的步骤所必需的每一多肽的外源核酸。这种细胞可包含许多外源核酸分子。例如，特定的细胞可包含1、2、3或4种不同的外源核酸分子，其中每种编码如图1所示将丙酮酸转化成为3-HP所必需的多肽，或当包含编码为转化烯丙酰-CoA成为3-HP所必需的多肽的外源核酸时，特定的细胞可内源地生产为转化丙酮酸成为烯丙酰-CoA所必需的多肽。
此外，单个外源核酸分子可编码一个或多于一个的多肽。例如，单个外源核酸分子可包含编码2、3乃至4种不同多肽的序列。进一步地，在此所描述的细胞可包含特定外源核酸分子，例如特定酶的单拷贝或多拷贝(例如，大约5，10，20，35，50，75，100或150个拷贝)。在此所描述的细胞可包含多于一个特定的外源核酸。例如，特定的细胞可包含大约50个拷贝的外源核酸分子X和大约75个拷贝的外源核酸分子Y。
在另一个实例中，细胞可包含编码具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的多肽(或其保持丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的变体、片段或融合体)的外源核酸分子，例如SEQ ID NO20和/或29。这种细胞可具有任何可检测水平的丙氨酸2，3-氨基变位酶活性，包括通过β-丙氨酸的代谢产物，例如泛酸的产生来检测的活性。例如，包含编码具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的多肽的外源核酸分子的细胞可具有大于约每克干细胞重量每小时形成1μgβ-丙氨酸的比活性的丙氨酸2，3-氨基变位酶活性(例如，大于每克干细胞重量每小时形成大约10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，125，150，200，250，300，350，400，500或更多μg的β-丙氨酸)。可选择地，细胞可具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性以使得来自1×106的细胞的细胞抽提物具有大于每毫克总蛋白每分钟形成大约1ngβ-丙氨酸(例如，大于每毫克总蛋白每分钟形成大约10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，125，150，200，250，300，350，400，500或更多ng的β-丙氨酸)的比活性。
可使用在此所描述的任何方法鉴定和获得编码具有酶活性的多肽的核酸分子。例如，编码具有酶活性的多肽的核酸分子可使用常规的分子克隆或化学核酸合成方法和技术，包括PCR来鉴定和获得。此外，可使用根据遗传密码将核酸序列转化为氨基酸序列的标准核酸测序技术和软件程序确定特定核酸是否与已知的酶性多肽具有任何序列同源性。可使用例如MEGALIGN(DNASTAR，Madison，WI，1997)的序列比对软件比较多种序列。
此外，编码已知酶性多肽的核酸分子可使用常规的分子克隆技术(例如，定位诱变)来突变。可能的突变包括但不限于，缺失、插入和碱基替换以及缺失、插入和碱基替换的组合。进一步地，可使用核酸和氨基酸数据库(例如，GenBank)鉴定编码具有酶活性多肽的核酸序列。简而言之，可使用任何与具有酶活性的多肽具有一些同源性的氨基酸序列，或任何与编码具有酶活性多肽的序列具有一些同源性的核酸序列作为查询而搜索GenBank。随后可分析该鉴定的多肽以确定它们是否显示酶活性。
此外，可使用核酸杂交技术来鉴定和获得编码具有酶活性的多肽的核酸分子。简而言之，可使用任何编码已知的酶性多肽的核酸分子、或其片段作为探针以在中等至高度严谨的条件下通过杂交而鉴定相似的核酸分子。这种相似的核酸分子随后可被分离、测序和分析以确定该编码的多肽是否具有酶活性。
也可使用表达克隆技术来鉴定和获得编码具有酶活性的多肽的核酸分子。例如，可使用与已知的特定酶性多肽相互作用的底物来筛选包含酶性多肽的噬菌体显示文库。噬菌体显示文库可如所描述的产生(Burritt等人，生物化学分析Anal.Biochem.2381-13，1990)，或可从的商品供应商诸如Novagen(Madison，WI)处获得。
进一步地，可使用多肽测序技术鉴定和获得编码具有酶活性多肽的核酸分子。例如，可通过凝胶电泳分离纯化的多肽，并且通过例如氨基酸微测序技术确定其氨基酸序列。一旦确定，可使用该氨基酸序列来设计退火的寡核苷酸引物。可使用退火的寡核苷酸引物通过PCR获得编码该多肽的核酸。一旦获得，该核酸可被测序、克隆到合适的表达载体中，并导入微生物中。
可使用任何方法将外源核酸分子导入细胞。例如，热休克、脂质转染法、电穿孔、接合作用、原生质体的融合和生物传输是用于将核酸导入细菌和酵母细胞的常规方法。(参见，例如，Ito等人，J.Bacterol.1531638，1983；Durrens等人，Curr.Genet.187-12，1990；Sambrook等人分子克隆实验室指手册，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989；和Becker和Guarente，Methods in Enzynology 194182-7，1991)。其它用于从外源核酸分子表达氨基酸序列的方法包括但不限于，构建核酸以使得调控元件促进编码多肽的核酸序列的表达。一般地，调控元件是调节其它DNA序列在转录水平表达的DNA序列。因此，调控元件包括但不限于，启动子、增强子等。可使用任何类型的启动子从外源核酸分子表达氨基酸序列。启动子的实例包括但不限于，组成型启动子、组织-特异性的启动子和对特定刺激(例如，光、氧、化学浓度)反应或无反应的启动子。用于将核酸转移到哺乳动物细胞中的方法也是已知的，例如使用病毒载体。
本发明的特定细胞内包含的外源核酸分子可以任何形式保持在细胞内部。例如，外源核酸分子可整合到细胞的基因组中或保持游离状态。也就是说，细胞可以是稳定或瞬时的转染子。微生物可包含单或多拷贝(例如，，大约5，10，20，35，50，75，100或150个拷贝)的特定外源核酸分子，诸如编码酶的核酸。
通过宿主细胞制备有机酸及相关的产物可使用在此提供的核酸和氨基酸序列与细胞一起来生产β-丙氨酸、泛酸和3-HP及其衍生物诸如CoA其，以及有机化合物诸如1，3-丙二醇、丙烯酸、聚合的丙烯酸、丙烯酸的酯、3-HP的酯和聚合的3-HP。这种细胞可来自于任何种属，诸如在国家健康研究所的分类学网页内所列出的。该细胞可以是真核或原核的。例如，遗传改变的细胞可以是哺乳动物细胞(例如，人类、鼠的和牛的细胞)，植物细胞(例如，，玉米、小麦、稻和大豆细胞)，真菌细胞(例如，曲霉(Aspergillus)和根霉(Rhizopus)细胞)，酵母细胞或细菌细胞(例如，乳杆菌、乳球菌、芽胞杆菌、埃希氏杆菌和梭菌细胞)。在一个实例中，细胞是一种微生物。术语″微生物″指任何微观的生物体包括但不限于，细菌、藻类、真菌和原生动物。因此，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、啤酒酵母、Kluveromyces lactis、Candida blankii、皱褶假丝酵母和巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)是微生物并且可如在此所描述的使用。在另一个实例中，细胞是较大的生物体的一部分，诸如植物，诸如转基因植物。可被使用而由β-丙氨酸制备3-HP、泛酸或其它有机化合物的植物的实例包括但不限于遗传工程化的植物农作物诸如玉米、稻、小麦和大豆。
在一个实例中，细胞被遗传改变以使得产生特定的有机化合物。在一个实施方案中，细胞由β-丙氨酸产生3-HP和/或泛酸，诸如图1和3中所显示的途径。在另一个实施方案中，细胞产生3-HP和/或泛酸的衍生物，诸如CoA，以及有机化合物，诸如1，3-丙二醇、丙烯酸、聚合的丙烯酸、丙烯酸的酯、3-HP的酯和聚合的3-HP。
在一个实例中，被遗传改变以合成特定有机化合物的细胞含有一或多种编码具有特异酶活性的多肽的外源核酸分子。例如，微生物可包含编码具有3-羟丙酰基-CoA脱水酶活性的多肽的外源核酸。在该情况下，烯丙酰-CoA可转化为产生3-HP的3-羟丙酸-CoA。可提供给细胞一种编码具有催化化合物产生的酶活性多肽的该细胞不产生的的外源核酸分子。可选择地，可供给细胞编码具有催化化合物产生的酶活性多肽的该细胞通常产生的外源核酸分子。在该情况下，遗传改变的细胞可生产更多的化合物，或比不具有该遗传改变的类似细胞更有效地生产该化合物。
在另一个实例中，公开了包含编码具有导致3-HP、泛酸和/或其衍生物的生成的酶活性多肽的外源核酸分子的细胞。产生的产物可从该细胞分泌出来，而不需要破坏细胞膜来回收该有机化合物。在一个实例中，细胞以至少大约每升100mg的产物浓度(例如，至少大约1g/L、5g/L、10g/L、25g/L、50g/L、75g/L、80g/L、90g/L、100g/L或120g/L)产生3-HP、泛酸和/或其衍生物。当确定特定细胞中诸如3-HP、泛酸和/或其衍生物的化合物的产率时，可使用任何方法。参见，例如，Applied Environmental Microbiology 59(12)4261-51993)。本发明内容范围内的细胞可以利用各种碳源。
细胞可包含一或多种编码具有导致3-HP、泛酸和/或其衍生物，例如CoA、1，3-丙二醇、丙烯酸、聚丙烯酸、丙烯酸-酯、3-HP-酯以及包含3-HP的聚合物和共聚物生成的酶活性多肽的外源核酸分子。鉴定包含外源核酸的细胞的方法是公知的。这种方法包括但不限于，PCR和核酸杂交技术，例如Northern和Southern分析(参见在此所描述的杂交)。有时，可使用免疫组织-化学和生物化学技术通过检测由特定核酸分子编码的多肽的表达确定细胞是否包含特定的核酸。例如，可使用对多肽具有特异性的抗体确定特定细胞是否包含编码该多肽的核酸。进一步地，可使用生物化学技术通过检测由于具有酶活性多肽的表达而产生的有机产物而确定细胞是否包含编码具有酶活性多肽的特定核酸分子。例如，在将编码具有3-羟丙酰基-CoA脱水酶活性多肽的外源核酸导入不正常表达这种多肽的细胞后检测到3-HP可表明该细胞不仅包含导入的外源核酸分子而且该导入的外源核酸分子表达编码的多肽。用于检测存在特异性酶活性或特定有机产物的方法是公知的，例如，有机化合物诸如3-HP的存在可通过Sullivan和Clarke(J.ASSOC.Offic.Agr.Chemists，38514-8，1955)所描述的来测定。
具有减少的多肽活性的细胞本发明公开了具有减少的多肽活性的遗传改变细胞。在此使用的关于细胞和特定多肽的活性的术语″减少的″或″降低的″是指比在相同种属的可比较细胞中所测量的活性水平要低。例如，如果可比较的微生物具有至少一些酶活性X，则缺乏酶活性X的特定微生物具有减少的酶活性X。
细胞可具有任意类型减少的多肽活性包括但不限于，酶、转录因子、转运体、受体、信号分子等。例如，细胞可包含破坏具有panD活性多肽的调控和/或编码序列的外源核酸分子。破坏panD可以阻止细胞产生β-丙氨酸。
减少的多肽活性可以是多肽浓度下降，多肽的比活性下降或其组合的结果。可使用许多不同的方法产生具有减少的多肽活性的细胞。例如，可使用常规的诱变或敲除技术工程化细胞使其具有被破坏的调控序列或多肽编码序列。(Methods in Yeast Genetics(1997版本)，Adams，Gottschling，Kaiser，和Sterns，冷泉港出版社，1998；Datsenko和Wanner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 976640-5，2000)。可选择地，可使用反义技术减少特定多肽的活性。例如，可工程改造细胞使其包含编码反义分子的cDNA从而阻止多肽的翻译。术语″反义分子″包括任何包含与内源多肽的编码链相应的核酸分子或核酸类似物(例如，肽核酸)。反义分子也可具有侧接序列(例如，调控序列)。因此，反义分子可以是核糖酶或反义的寡核苷酸。核糖酶可具有任何通用结构，包括但不限于，发夹、锤头或斧头状结构，提供分子切割RNA。进一步地，可用基因沉默来减少特定多肽的活性。
可使用任何方法鉴定具有减少的多肽活性的细胞。例如，可使用在此所描述的酶活分析鉴定具有减少酶活性的细胞。
经体外技术制备有机酸及相关产物可单独或与细胞联合使用纯化的具有酶活性的多肽来生产泛酸、3-HP和/或其衍生物，诸如CoA，以及有机化合物诸如1，3-丙二醇、丙烯酸、聚合的丙烯酸、丙烯酸的酯、3-HP的酯和聚合的3-HP。例如，可使用包括具有3-羟丙酰基-CoA脱水酶活性的基本上纯的多肽的制剂催化3-HP的前体3-HP-CoA的生成。
进一步地，可单独或与纯化的多肽和/或细胞联合使用包含具有酶活性的多肽的无细胞抽提物以生产泛酸、3-HP和/或其衍生物。例如，可使用包括具有CoA转移酶活性的多肽的无细胞抽提物来由β-丙氨酸形成β-丙氨酰基-CoA，同时可使用包含多肽的微生物生产3-HP，其中该多肽具有催化由β-丙氨酰基-CoA形成3-HP所需的反应所必需的酶活性。在另一个实例中，可使用包括α-酮泛酸羟甲基转移酶(E.C.2.1.2.11)、α-酮泛酸还原酶(E.C.1.1.1.169)，以及泛酸合酶(E.C.6.3.2.1)的无细胞抽提物从β-丙氨酸形成泛酸。可使用任何方法来生产无细胞抽提物。例如，可使用渗压休克、超声处理和/或重复的冻融循环，随后通过过滤和/或离心作用来从完整细胞生产无细胞抽提物。
可使用细胞、纯化的多肽，和/或无细胞抽提物生产3-HP，依次化学处理来产生另一种化合物。例如，可使用微生物生产3-HP，同时使用化学方法将3-HP改变为衍生物，诸如聚合的3-HP或3-HP的酯。同样地，可使用化学方法利用在此所描述的细胞、基本上纯的多肽和/或无细胞抽提物生产特定的化合物，该化合物依次被转化为3-HP或其它有机化合物(例如，1，3-丙二醇、丙烯酸、聚合的丙烯酸、丙烯酸的酯、3-HP的酯以及聚合的3-HP)。例如，可通过化学方法生产烯丙酰-CoA，同时可使用微生物将烯丙酰-CoA转化为3-HP。
类似地，可使用细胞、纯化的多肽和/或无细胞抽提物生产泛酸，该泛酸依次被化学处理来生产另一种化合物。例如，可使用微生物生产泛酸，同时使用化学方法将泛酸改变为衍生物，诸如CoA。同样地，可使用化学方法，利用在此所描述的细胞、基本上纯的多肽和/或无细胞抽提物来产生特定的化合物，该化合物依次被转化为泛酸或其它化合物(例如，CoA)。例如，可使用化学方法生产泛酸，同时可使用微生物将泛酸转化为CoA。
细胞发酵来生产有机酸本发明公开了生产泛酸、3-HP和/或其衍生物的方法，通过在培养基中培养生产细胞，诸如微生物以生产泛酸、3-HP和/或其衍生物。通常，培养基和/或培养条件可适合微生物生长到充足的密度并有效的产生产物。对于大规模生产的方法，可使用例如在别处所描述的任何方法(Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology，第二版，编辑Demain和Davies，ASM出版社；Principles of Fermentation Technology，Stanbury和Whitaker，Pergamon)。
简而言之，包含具有例如葡萄糖碳源的合适培养基的大罐(例如，100加仑、200加仑、500加仑、或以上的罐)被接种特定的微生物。接种后，培养该微生物以允许产生生物量。一旦达到所需的生物量，可将包含微生物的发酵液转入第二个罐。这第二个罐可以是任何大小的。例如，第二个罐可以是比第一个罐大的、小的，或一样大小的。通常，第二个罐比第一个大，以使得可将另外的培养基加入第一个罐中的发酵液。此外，第二个罐内的培养基可与第一个罐中使用的培养基相同或不同。例如，第一个罐可以包含具有木糖的培养基，而第二个罐包含具有葡萄糖的培养基。
一旦转移，可培养该微生物以允许生产泛酸、3-HP和/或其衍生物。一旦生产，可使用任何方法来分离所生成的产物。例如，可使用常规的分离技术从发酵液除去生物量，并且可使用常规的分离方法(例如，提取、蒸馏和离子交换方法)从无微生物的发酵液获得泛酸、3-HP和/或其衍生物。可选择地，该产物可在当它正在生产时被分离，或它可在该产物的生产阶段已经被终止后从发酵液中分离。
从所公开的生物合成途径产生产物由图1和3中任何步骤产生的化合物可被化学转化为其它有机化合物。例如，3-HP可被加氢来形成有价值的聚酯单体，1，3-丙二醇。有机酸诸如3-HP可利用例如用于氢化琥珀酸和/或乳酸的任何方法来进行氢化。例如，3-HP可利用金属催化剂来加氢。在另一个实例中，3-HP可被脱水以形成丙烯酸。可使用任何方法进行脱水反应。例如，可在存在催化剂(例如，金属或无机酸催化剂)时加热3-HP以形成丙烯酸。也可利用具有氧化还原酶活性的多肽(例如，酶分类1.1.1.-的酶)在体外或体内产生1，3-丙二醇。
在另一个实例中，可用泛酸形成辅酶A。可用具有泛酸激酶(E.C.2.7.1.33)、4′-磷酸泛醇酰-1-半胱氨酸合成酶(E.C.6.3.2.5)、4′-磷酸泛醇酰半胱氨酸脱羧酶(E.C.4.1.1.36)、ATP4′-磷酸泛酰巯基乙胺腺嘌呤转移酶(E.C.2.7.7.3)，和脱磷酸-CoA激酶(E.C.2.7.1.24)活性的多肽生产辅酶A。
1，3-丙二醇的制备本发明公开了用于生产1，3-丙二醇的方法和细胞。1，3-丙二醇可从3HP-CoA或3-HP来产生。可通过克隆编码具有氧化还原酶/脱氢酶型活性的酶的基因工程改造产生3-HP-CoA或3-HP的细胞或微生物来制备1，3-丙二醇。
例如，可在存在具有乙酰化醛NAD+)氧化还原酶和醇NAD(+)氧化还原酶活性的酶时将3-HP-CoA转化为1，3-丙二醇。这种转化可在体内、体外或其组合来进行。这些活性可通过单个多肽或通过两种不同的多肽来携带。单个酶包括来自大肠杆菌的多功能醛-乙醇脱氢酶(EC 1.2.1.10)Goodlove等人，Gene 85209-14，1989；GenBank登录号No.M33504)。具有乙酰化醛NAD(+)氧化还原酶EC1.2.1.10)或醇NAD(+)氧化还原酶EC 1.1.1.1)的单一活性的酶已经被描述。来自大肠杆菌的编码酰化醛脱氢酶的基因(GenBank登录号No.Y09555)和来自运动发酵单胞菌的编码乙醇脱氢酶的基因(GenBank登录号No.M32100)已被分离并测序。编码这些酶的基因可通过众所周知的分子生物学技术克隆到生产3-HP-CoA的生物体或细胞中。这些酶在产生3-HP-CoA的生物体或细胞中的表达将赋予细胞转化3-HP-CoA为1，3-丙二醇的能力。这些酶对于3-HPCoA的底物特异性可利用众所周知的技术，诸如易错PCR或突变基因大肠杆菌菌株来变化或改进。
可通过将3-HP与具有醛脱氢酶(NAD(P)+)(EC 1.2.1.)和乙醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)活性的酶接触来实现3-HP到1，3-丙二醇的转化。这种转化可在体内、体外或其组合来进行。例如，在生产3-HP的微生物或细胞中克隆和表达这些基因将赋予细胞或生物体转化3-HP为1，3-丙二醇的能力。这些酶对于3-HP-CoA的底物特异性可利用如上所述众所周知的技术变化改进。
利用高效液相色谱法(HPLC)分析发酵期间或在体外分析中生成的1，3-丙二醇。色谱分离可通过使用Bio-Rad87H离子交换柱实现。将0.01N硫酸的流动相以0.6ml/min的流速通过并且保持柱的温度为45-65℃。样品中存在的1，3-丙二醇可使用折光率检测器(Skraly等人，Appl.Environ.Microbiol.6498-105，1998)来检测。
实施例1克隆枯草芽孢杆菌赖氨酸2，3-氨基变位酶(KAM基因)为了鉴定产生用于丙氨酸的β-丙氨酸的丙氨酸2，3-氨基变位酶，对进行相似反应但不接受丙氨酸β-丙氨酸作为底物的酶进行随机突变并随后进行筛选以鉴定具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的突变的酶。本实施例描述了从枯草芽孢杆菌(SEQ ID NO3和31)克隆赖氨酸2，3-氨基变位酶(E.C.5.4.3.2)。本领域的技术人员将理解类似的方法可用于从任何所需的生物体中克隆赖氨酸2，3-氨基变位酶。
选择枯草芽孢杆菌赖氨酸2，3-氨基变位酶是因为据报道它对空气是稳定的，因此允许在厌氧和需氧的条件下用于筛选活性。此外，因为该酶比近端梭菌的赖氨酸2，3氨基变位酶具有较低的特异活性，可减少超表达活性赖氨酸2，3-氨基变位酶或丙氨酸2，3-氨基变位酶对大肠杆菌宿主的有害效应。
为了克隆编码赖氨酸2，3-氨基变位酶的枯草芽孢杆菌KAM基因，使用下列的方法。枯草芽孢杆菌ATCC 6051从ATCC(美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA)获得，使用Genomic Tip 20/G(Qiagen，Valencia，CA)按照制造商推荐的方法制备染色体DNA。通过PCR扩增KAM基因的引物是以完整的枯草芽孢杆菌基因组序列(GenBank登记号NoNC000964)为基础来设计的，而该序列在Chen等人(Biochem.J.348539-49，2000)和美国专利No.6,248,874中公开。使用PCR引物GCGCGAGGAGGAGTTCATATGAAAAACAAATGGTATAAAC(SEQ ID NO1)，和CGGGCACCGCTTCGAGGCGGCCGCACCATTCGCATG(SEQ IDNO2)，其中加下划线的核苷酸是用来将PCR产物克隆到质粒中的NdeI和NotI位点。
PCR反应液(总体积100μl)包含0.5μg枯草芽孢杆菌染色体DNA、0.2μM的每种引物(SEQ ID NOS1和2)、10μL10×Pfu Turbo反应缓冲液(Stratagene，Inc.，La Jolla，CA)、0.2mM的每种三磷酸核苷酸和5个单位的Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene)。该PCR反应在95℃加热2分钟，然后经受95℃ 30秒、58℃ 30秒，72℃ 2分钟的30个循环，随后在72℃另外保持10分钟。
所得到的PCR产物通过加入3μl的颗粒染色共沉淀剂(Novagen，Inc.Madison，WI)，100μl 5M的乙酸铵和400μl乙醇沉淀。重悬反应液用NdeI和NotI(New England Biolabs，Inc.Beverly，MA)消化，用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化，以及用快速DNA连接试剂盒(Roche Molecμlar Biochemicals，Indianapolis，IN)连接到用相同的酶消化的pET-22b(+)(Novagen)或pPRONde中以分别产生质粒pET-KAM1和pPRO-KAM1。质粒pPRONde是pPROLar.A122(Clontech Laboratories，Inc.，PaloAlto，CA)的衍生物，其中NdeI位点使用Stratagene的QuikChange定点诱变试剂盒通过寡核苷酸-定点诱变构建于起始ATG密码子。这些载体中的赖氨酸2，3-氨基变位酶的表达受pET22(b)中的T7启动子或pPRO-Nde中的混合lac/ara启动子驱动。将连接物转化入大肠杆菌DH5α(Life Technologies，Gaithersburg，MD)，并通过测序来验证克隆。枯草芽孢杆菌KAM基因显示在SEQ ID NO3(氨基酸序列显示在SEQ ID NO31中)中，并且如下所述进行诱变处理，以鉴定具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的突变体。
实施例2枯草芽孢杆菌KAM基因的体外诱变为了在体外向枯草芽孢杆菌KAM基因(SEQ ID NO3)中导入突变，使用易错PCR的方法。类似的方法可用于将突变导入任何编码赖氨酸2，3-氨基变位酶的KAM基因，诸如来自放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)的KAM基因(GenBank登记号NoRDR02336)，其与枯草芽孢杆菌KAM蛋白序列，近端梭菌(Clostridium subterminale)(GenBank登录号NoAF159146)或牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)(不完全基因组，基因组研究机构，参见实施例5)有52％的同一性。
在一个方法中，如下使用GeneMorph PCR Mutagenesis试剂盒(Stratagene)。用10、1、0.1或0.01ng的模板pET-KAM1 DNA和125ng的每种T7启动子引物及T7终止子引物(Novagen产品目录中所给出的序列)按照制造商所推荐的，建立50μl的反应物，94℃加热30秒，经受94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 2分钟的30个循环，随后在72°另外保持10分钟。
所得到的PCR产物用3μl的颗粒染色共沉淀剂(Novagen)，50μl5M的乙酸铵、200μl乙醇沉淀，用NdeI和NotI重悬、消化，并且将120ng各种诱变的PCR产物用快速DNA连接试剂盒(Roche MolecμlarBiochemicals)连接到用相同的内切核酸酶消化的pPRONde中。连接混合物用限制性内切核酸酶BamHI(New England Biolabs)消化以线性化剩余的未插入的载体DNA，如所描述的用乙醇沉淀，并且被转化入电感受态的ElectroMax DH10B大肠杆菌细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。来自每一文库的包含15,000-20,000克隆的卡那霉素-抗性的转化体被从选定的平板上刮下并且使用Plasmid Midi试剂盒(Qiagen)制备诱变的质粒文库。
在第二个方法中，基于Xu等人(BioTechniques 271102-8，1999)的Mn-dITP PCR方法，使用pET-KAM1 DNA作为模板和与T7启动子和T7终止子区域同源的引物进行初始轮的锰-诱导的易错PCR。该反应混合物(50μL)包含具有2mM MgCl2的1×TaqPCR缓冲液、100ng的DNA、40μM MnCl2、0.2μM的各种引物、200μM的各种dNTP和5个单位的Taq聚合酶(Roche Molecμlar Biochemicals)。PCR程序包括在94℃下2分钟的起始变性；94℃ 30秒，54℃ 1分钟和72℃ 2.25分钟的20个循环；以及72℃ 7分钟的最终延伸。
以3微升的PCR产物作为使用dITP在扩增期间增加错配的第二轮PCR的模板。第二轮PCR混合物(100μL)包含具有2mM MgCl2的1×Taq聚合酶PCR缓冲液、40μM的dITP、0.2μM的各引物、200μM的各种dNTP和10个单位的TaqDNA聚合酶。PCR程序与用于第一轮的程序相同，但是由30个循环组成。PCR产物在1％TAE-琼脂糖凝胶上分离并使用QIAquick凝胶纯化方法(Qiagen)纯化。纯化的PCR产物用限制酶NdeI和NotI消化并且连接到已经用相同的酶消化的pPRO-Nde载体中，凝胶纯化，并且用虾碱性磷酸酶(Roche)去磷酸。连接反应使用T4 DNA连接酶(New England BioLabs)于16℃进行16小时，其后加入另外体积的1×连接缓冲液和连接酶，并且该反应在室温下再继续2小时。
用QIAquick PCR纯化柱纯化连接反应液并在30μL的水中洗提。将2微升的反应物转化入大肠杆菌ElectromaxTMDH10BTM(Life Technologies，Inc.)细胞并且接种到包含25μg/mL卡那霉素的LB培养基中。对照连接表明背景水平(没有插入的载体)小于3％。进行重复的转化以获得大约40,000个克隆。从平板上刮下克隆并使用Qiagen MiniSpin质粒方法来制备质粒DNA。质粒DNA用乙酸铵和乙醇沉淀以提高它在转化入所筛选的宿主前的浓度。质粒DNA也从单个克隆中分离并测序以获得估计的突变率。该方法的平均突变率是1.3个改变的核苷酸/Kb。
在第三个方法中，基于Cadwell和Joyce(PCR Methods Appl.228-33，1992)的方法进行诱变PCR。该方法使用包含21.2mM MgCl2、2.0mM MnCl2、3.2mM dTTP和3.2mM dCTP的诱变缓冲液的多种稀释液。除具有1.5mM的MgCl2的1×Taq PCR缓冲液、0.25μM的各个引物、200μM的各个dNTP、50ng的pET-KAM1模板DNA和10个单位的Taq DNA聚合酶(Roche)外，加入下列体积的诱变缓冲液以分离PCR反应物(每个的终体积为100μL)0、1.56、3.13、6.25、12.5和25μL。PCR程序包括94℃ 2分钟的起始变性；94℃ 30秒，54℃ 1分钟和72℃ 2.25分钟的30个循环；和72℃ 7分钟的最终延伸。
PCR后，通过加入EDTA至终浓度为5mM、SDS至0.5％和蛋白酶K至50μg/mL处理反应物以除去Taq聚合酶(MatsμMura和Ellington，PCR Mutagenic PCR of Protein-Coding Genes for In Vitro Evolution.Methods in Molecμlar Biology.，Vol 182In Vitro Mutagenesis，2nded.Ed.J.Braman Hamana.Press Inc.Totowa，NJ，2001)。将反应物加热至65℃ 15分钟并且如上所述用凝胶纯化。第一个四步处理产生了充足的克隆的PCR产物。消化PCR产物，连接入pPRO-Nde并且转化入大肠杆菌ElectromaxTMDH10BTM细胞中。从单个克隆中分离质粒DNA并测序以获得估计的突变率。1-4处理的平均突变率在0-0.47％间变化(每Kb0-4.7个改变的核苷酸)。进行重复转化以获得所选处理的大约50,000个克隆。从平板上刮下克隆并使用Qiagen MiniSpin质粒方法制备质粒DNA。用乙酸铵和乙醇沉淀质粒DNA以增加它在转化入所筛选的宿主前的浓度。
实施例3枯草芽孢杆菌KAM基因的体内诱变为了在体内将突变导入枯草芽孢杆菌KAM基因(SEQ ID NO3)，将pPRO-KAM1传递到大肠杆菌XL1 Red(Stratagene)突变菌株中。将大约50ng的质粒pPRO-KAM1按照制造商的指导转化入感受态的XL1-Red细胞并且将转化体接种到包含25μg/mL卡那霉素的LB培养基中。随机选择大约200个转化体，从转化平板上刮下并接种到2份包含25μg/ml卡那霉素的5ml LB肉汤中。一份在30℃，另一份在37℃生长过夜。
将各份的一小等分样品接种到包含25μg/ml卡那霉素的新鲜LB肉汤中，同时从1.5ml各个培养物中使用QiaSpin Mini试剂盒(Qiagen)提取诱变处理的质粒DNA。过夜生长和质粒DNA提取被重复2次或更多次，从两种不同的温度和增加暴露于突变菌株的3个循环而产生诱变处理的质粒文库。质粒DNAs在转化入所选择的菌株之前，通过乙醇沉淀进行浓缩。
实施例4大肠杆菌ΔpanD∷CAT菌株的构建为了鉴定编码可实现丙氨酸2，3-氨基变位酶反应的多肽的基因，需要有效的筛选或选择所需的活性。因此，通过识别使用β-丙氨酸合成依次为辅酶A(CoA)和酰基载体蛋白(ACP)的成分的泛酸的大肠杆菌而改进了筛选方法。CoA和ACP是活生物机体中主要的酰基载体，并且对生长是必不可少的。
在大肠杆菌中，β-丙氨酸的主要途径来自于由panD基因编码的天冬氨酸脱羧酶(E.C.4.1.1.11)催化的反应中的天冬氨酸(图3)。panD的功能性缺失突变导致β-丙氨酸营养缺陷以及生长抑制，这可通过加入外源的泛酸或β-丙氨酸，或通过从另外的来源生产β-丙氨酸来缓解。
两个大肠杆菌菌株被用于在β-丙氨酸合成中两者都缺乏的筛选。菌株DV1(#6865，大肠杆菌遗传原种中心，New Haven CT；Vallari和Rock，J.Bacteriol 164136-42，1985)是通过化学物诱变作用制备的，panF和panD两个基因都变得无功能的宿主(染色体)突变的大肠杆菌突变体。panF基因编码从培养基对泛酸的摄取，因此panD和panF的组合为用于生长的β-丙氨酸提供了更严格的必要条件。因此，尽管DV1菌株是已知的，其用于选择具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的细胞的用途以前并非已知的。
另一个选择的菌株，BW25113ΔpanD∷CAT，包括panD基因座的缺失，以阻止能够在无外源的β-丙氨酸时panD突变的回复突变。这些通过CAT基因进入panD基因座而具有被赋予氯霉素抗性标记的插入物的菌株，被通过Datsenko和Wanner(Proc.Natl.ACAD.Sci.美国976640-5，2000)的基因失活方法，使用大肠杆菌遗传原种中心的大肠杆菌菌株BW25113/pKD46和BW25141/pKD3来构建。
pKD3的CAT基因被使用引物TATCAATTCGTTACAGGCGATACATGGCACGCTTCGGCGCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO4)和GATGTCGCGGCTGGTGAGTAACCAGCCGCAGGGATAACAACATATGAATATCCTCCTTAG(SEQ ID NO5)进行扩增，其中加下划线的序列分别对应于大肠杆菌染色体中紧接panD基因座上游和下游的区域，而非加下划线的区域是pKD3中允许扩增包含基因的片段的同源区域。PCR反应液包括在300μl终体积中的30μl 10×浓缩的PCR缓冲液(Roche Molecμlar Biochemicals)、质粒pKD3、0.2mM的各种dNTP、0.2μM的每种引物和15个单位的Taq聚合酶(Roche Molecμlar Biochemicals)。PCR反应在95℃温育30秒，然后是95℃ 30秒，45℃ 30秒，72℃ 1分钟的30个循环，然后于72℃ 10分钟。PCR产物用乙醇沉淀，用DpnI消化，用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化，并转化入表达重组功能的BW 25113/pKD46中。将转化体接种到包含25μg/ml氯霉素和5μM β-丙氨酸的LB平板上。
通过补充有5μM β-丙氨酸的非选择性LB培养基，于43℃单克隆纯化氯霉素-抗性的转化体，并且检验单克隆氯霉素抗性的保持状况、氨苄青霉素抗性的损失(表明pKD46的消除)以及在M9-葡萄糖基本培养基中生长所需要的β-丙氨酸。CAT基因正确插入panD基因座的证实是通过使用侧接于插入位点的引物(TTACCGAGCAGCGTTCAGAG，SEQ ID NO6和CACCTGGCGGTGACAACCAT，SEQ ID NO7)产生的ΔpanD∷CAT菌株的克隆PCR来进行的。当预期野生型panD基因座产生713个碱基对的PCR产物，ΔpanD∷CAT构建体产生1215个碱基对的产物。如上所述(Datsenko和Wanner，Proc.Natl.Acad.Sci.美国976640-5，2000)构建ΔpanD∷CAT菌株的衍生物，其中插入的CAT基因通过由质粒pCP20编码的FLP重组酶的活性而除去。这些菌株称为ΔpanD。
β-丙氨酸的第二途径存在于基于尿嘧啶代谢的还原途径的大肠杆菌中(West，Can.J.Microbiol.441106-9，1998，图2)。在该途径中，尿嘧啶通过酶二氢嘧啶脱氢酶(E.C.1.3.1.2)还原成二氢尿嘧啶。然后二氢尿嘧啶通过二氢嘧啶酶(E.C.3.5.2.2)转化为N-氨甲酰基-β-丙氨酸，它依次通过N-氨甲酰基-β-丙氨酸氨基水解酶(E.C.3.5.1.6)水解为β-丙氨酸、CO2和NH3。为了防止通过该途径形成β-丙氨酸，将编码二氢嘧啶脱氢酶的基因，yeiA(GenBank登记号No.AAC75208)通过如上所述的Datsenko和Wanner的方法插入缺失。pKD3的CAT基因使用引物GCGGCGTGAAGTTTCCCAACCCGTTCTGCCTCTCTTCTTCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO8)，和TTACAACGTTACCGGGTGTTCTTTCTCGCCTTTCTTAAACCATATGAATATCCTCCTTAG(SEQ ID NO9)扩增，其中加下划线的序列分别对应于大肠杆菌染色体紧接yeiA基因座上游和下游的区域，而不加下划线的序列是与pKD3中允许包含CAT基因的片段的扩增的区域同源的。如上所述分离氯霉素-抗性的插入突变体，并且将抗性标记转导入ΔpanD菌株以产生双重突变的ΔpanD/ΔyeiA∷CAT。
产生大肠杆菌BW 25115ΔpanD∷CAT、ΔpanD或ΔpanD/ΔveiA∷CAT的电感受态细胞并且用作转化如实施例6中所述的突变赖氨酸2，3-氨基变位酶DNAs文库的宿主。
实施例5牙龈卟啉单胞菌KAM基因的克隆和体外诱变通过从基因组DNA PCR扩增来自牙龈卟啉单胞菌的赖氨酸2，3氨基变位酶基因并克隆到载体pET22B(Novagen)的NdeI和NotI位点。诱变PCR是通过Cadwell和Joyce(PCR Methods Appl.228-33，1992)的方法，使用用于扩增的T7启动子和T7终止子引物和每100μl反应物中6.25μl或9.38μl的诱变缓冲液来进行的。PCR产物经凝胶纯化(Qiagen)并随后用NdeI和NotI消化。消化的PCR产物被连接到pPRONde载体中并如实施例2中所述转化入大肠杆菌ElectromaxTMDH10BTM。进行重复的转化以获得每个突变处理至少60,000个克隆。从平板上刮下克隆并制备和沉淀质粒DNA以提高它的浓度。所得到的文库具有0.3％和0.35％的突变率。
实施例6具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的克隆的鉴定将上述实施例2中产生的诱变处理的赖氨酸2，3-氨基变位酶质粒文库转化入电感受态的大肠杆菌菌株DV1细胞。将转化体接种到包含25μg/ml卡那霉素的适当稀释的LB中以获得总转化体的估计值，并接种到补充有0.4％葡萄糖、0.2％维生素测定酪蛋白氨基酸(DIFCO/Becton Dickinson，Sparks，MD)和25μg/ml卡那霉素(Sigma，St.Louis，MO)的M9基本培养基中。为进行一些筛选，加入IPTG至0.25mM。
将实施例4中所述的大肠杆菌的ΔpanD∷CAT菌株用实施例2，3和5中产生的文库以类似的方式转化，除了将转化体接种到补充有0.4％葡萄糖和25μg/ml卡那霉素(Sigma，St.Louis，MO)的M9基本培养基中。为筛选枯草芽孢杆菌文库，加入IPTG至0.25mM，加入Fe2(NH4)2SO4至50μM并加入氯霉素至25μg/ml。文进行筛选牙龈卟啉单胞菌库，IPTG加入至50μM，Fe2(NH4)2SO4加入至50μM，氯霉素加入至25μg/ml，L-丙氨酸加入至1mg/ml并且L-赖氨酸加入至2mg/ml。
通过在添加25μg/ml卡那霉素的LB上生长的克隆数目测定，在基本培养基平板上生长的相对于转化子总数大约为1×10-4频率的转化子。使用Qiagen Miniprep试剂盒从生长于基本培养基上的克隆制备质粒DNA并将其再转化入大肠杆菌的ΔpanD∷CAT菌株以证实能够在缺乏β-丙氨酸的情况下生长的能力是通过质粒携带的功能而被赋予的。从再转化的克隆制备质粒DNA并对kam基因测序以决定相对于野生型枯草芽孢杆菌或牙龈卟啉单胞菌kam基因序列的任何变化。
编码丙氨酸2，3-氨基变位酶的突变的枯草芽孢杆菌kam基因序列显示在SEQ ID NO20中并且相应的氨基酸序列显示在SEQ ID NO21中。携带这些序列的质粒被称为pLC4-7LC1。同野生型枯草芽孢杆菌kam基因序列(图4)相比，在突变的序列中观察到3种氨基酸变化。在丙氨酸2，3-氨基变位酶蛋白中有L103M取代、M136V取代和D339H取代(其中第一氨基酸是野生型序列，数字是氨基酸的位置，而第二氨基酸是在丙氨酸2，3-氨基变位酶序列中观察到的序列)。FeS簇-结合基序(SEQ ID NO21的氨基酸134-146)和推定的PLP-结合基序(SEQ ID NO21的氨基酸288-293)也显示在图4中。这是丙氨酸2，3-氨基变位酶核酸和氨基酸序列的第一个示证。编码丙氨酸2，3-氨基变位酶的突变的牙龈卟啉单胞菌kam基因序列显示在SEQ ID NO29中并且相应的氨基酸序列显示在SEQ ID NO 30中。同野生型牙龈卟啉单胞菌序列(图5)相比，在突变的序列中观察到5种氨基酸变化。在丙氨酸2，3-氨基变位酶蛋白中有N19Y取代、L53P取代、H85Q取代、D331G取代和M342T取代。然而，可能并非所有的这些突变是具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性所必需的。在枯草芽孢杆菌和牙龈卟啉单胞菌突变蛋白的序列比对中，牙龈卟啉单胞菌D331G取代位于与枯草芽孢杆菌D339H取代一致的蛋白内部的位置(图6)，此表明可能是特别重要的。FeS簇-结合基序(SEQ ID NO30的氨基酸126-138)和推定的PLP-结合基序(SEQ ID NO30的氨基酸280-285)也显示在图5中。这是丙氨酸2，3-氨基变位酶核酸和氨基酸序列的另一个示证。
突变的kam基因能够将α-丙氨酸转化为β-丙氨酸并因此允许产生泛酸的能力，是通过将ΔpanD转化体在包含泛酸的基本培养基中的生长与在缺乏泛酸的培养基中的生长相比较的液体生长测试来确定的。起始接种物包括来自生长培养物的洗涤细胞或从平板刮下的细胞。
作为使用洗涤的细胞作为接种物的实例，3-5mL培养物由单克隆开始并在添加40μg/ml卡那霉素的LB肉汤中于30℃生长过夜。读取培养物的OD600并通过离心收获每种培养物的等量数目的细胞(大约600总的OD×μl，例如OD4.0×150μl)。细胞用0.85％的NACl洗涤两次，重悬于200μl 0.85％的NaCl中，并使用30μl在直径为13mm的玻璃试管中以大约0.05的起始OD600接种于3ml的基于M9的基本培养基中(6g/L Na2HPO4、3g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、1g/L NH4Cl、2mM MgSO4、4g/L葡萄糖、1mM CaCl2、250μM IPTG、40μg/ml卡那霉素、50μM Fe(NH4)2(SO4)2)。对照培养物包含补充有20μM泛酸的基本培养基或有40μg/ml卡那霉素的LB肉汤。培养物于37℃不摇动生长大约18小时并测量OD600。
如表1中所示，尽管携带载体对照的细胞在不加有泛酸或β-丙氨酸的基本培养基中使用残余保存的泛酸或β-丙氨酸生长至0.21的平均OD600(存在泛酸时所获得OD600的大约30％)，携带2，3-氨基变位酶克隆的细胞生长至0.50的平均OD600，是存在泛酸时所获得的大约90％。添加Fe2+没有增加载体对照细胞的生长，但是允许丙氨酸2，3-氨基变位酶-耐受细胞获得与存在泛酸或在富含LB肉汤培养基中所获得的相等的生长密度。这表明丙氨酸2，3-氨基变位酶基因提供了补充panD突变的β-丙氨酸的来源。
表1生长测试


作为使用平板培养物作为接种物的实例，从平板刮下克隆并重悬于50μl缺乏泛酸的基本培养基中。使用重悬浮液(20μl)接种在1.5mL微试管中的1mL基本培养基而使用20μl接种入补充有泛酸的1mL基本培养基中。后者的培养物作为接种物加入的变化数量的对照。无泛酸生长的培养物的反应可以表示为在缺乏泛酸的培养基上的生长与在包含泛酸的培养基上的生长的比率。培养物于25-37℃无摇动生长1-3天并测量OD600。通过填充试管至更大的程度来获得更多厌氧生长的测试。这在牙龈卟啉单胞菌突变体的测试中是有用的。
表2刮下的克隆/半厌氧的测试。

Pg aam＝具有携带突变的牙龈卟啉单胞菌kam基因的质粒和丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的细胞Bs aam＝具有携带突变的枯草芽孢杆菌kam基因的质粒和丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的细胞
Pg kam＝具有携带野生型牙龈卟啉单胞菌kam基因的质粒的细胞实施例7枯草芽孢杆菌赖氨酸2，3-氨基变位酶中个体突变的产生在上述实施例5的野生型枯草芽孢杆菌赖氨酸2，3-氨基变位酶基因中鉴定的突变是在野生型枯草芽孢杆菌赖氨酸2，3-氨基变位酶基因(SEQ ID NO3)中使用Stratagene QuikChangeTMSite-Directed试剂盒单独构建的。用于产生L103M突变的寡聚核苷酸是CACAAAACAAAATACGATATGGAAGACCCGCTCCATGAGGATGAAGATTCA(SEQ ID NO10)，和TGAATCTTCATCCTCATGGAGCGGGTCTTCCATATCGTATTTTGTTTTGTG(SEQ ID NO11)。
用于产生M136V突变的寡核苷酸是GAATCAATGTTCCGTATACTGCCGCTAC(SEQ ID NO12)，和GTAGCGGCAGTATACGGAACATTGATTC(SEQ ID NO13)。
用于产生D339H突变的寡聚核苷酸是GTTCCTACCTTTGTTGTACACGCACCAGGCG(SEQ ID NO14)，和CGCCTGGTGCGTGTACAACAAAGGTAGGAAC(SEQ ID NO15)。
使用实施例6中描述的液体生长测试，具有单独携带L103M突变的质粒的细胞能够在没有添加泛酸或β-丙氨酸的基本培养基中生长，然而与具有pLC4-7LC1质粒的细胞程度不同，单独携带M136V或D339H突变的细胞具有宿主的ΔpanD表型。在野生型枯草芽孢杆菌kam序列中L103M突变与M136V和D339H突变的组合产生与pLC4-7LC1相同的，赋予在缺乏β-丙氨酸或泛酸中生长的能力的基因，证实这3个突变或其亚组合对于赋予丙氨酸2，3-氨基变位酶活性是充分的。
本领域的技术人员可以理解在这些位置可产生可选择的取代。因此使用与SEQ ID NOS10和11相似的，且其中相应于L103的密码子是随机的寡核苷酸，可获得具有L103K、L103R、L103E和L103S取代的赋予ΔpanD菌株能在缺乏β-丙氨酸或泛酸时生长的能力的突变体。进一步地，使用与SEQ ID NO14和15相似的，其中相应于D339的密码子是随机的寡核苷酸，获得具有D339Q、D339T、D339N取代的赋予ΔpanD菌株能在缺乏β-丙氨酸或泛酸时生长的能力的突变体。
实施例8不使用诱变处理的赖氨酸2，3-氨基变位酶对丙氨酸2，3-氨基变位酶活性进行的筛选鉴定具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的细胞的可选择的方法是将如上所述的诸如DV1或ΔpanD∷CAT细胞接种到如上所述的培养基中，而不用诱变处理的赖氨酸2，3-氨基变位酶库转染它们。如上所述筛选这种细胞，并如实施例6和9中所描述的验证丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的存在。
细胞可在接种前诱变处理，例如通过将细胞暴露于紫外线照射或化学制品(例如MES)。这允许分离具有在一或多个导致细胞具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的其它基因中的突变。
可选择地，细胞在接种前可以是未改变的(例如未转化的，未诱变处理的)。该方法允许分离自然发生的具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的菌株。
实施例9丙氨酸2，3-氨基变位酶的证明检验通过上述筛选法获得的细胞的丙氨酸2，3-氨基变位酶活性。对于用诱变处理的库(实施例2，3和5)转化的细胞而言，使用标准的分子生物学方法从所选择的宿主分离质粒。将所得到的质粒再转化到所选择的宿主中，再分离质粒，并且如实施例中所述对所得到的克隆进行测序。对于未转化的细胞(实施例8)，使用例如鸟枪法克隆赋予丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的基因。
可使用一些测定方法检测丙氨酸2，3-氨基变位酶活性，诸如由[3-13C]丙氨酸经过[3-13C]β-丙氨酸测定[13C]辅酶A的生物合成，通过使用测量转化α-丙氨酸到β-丙氨酸的的酶活测定，或测量携带丙氨酸2，3-氨基变位酶的细胞获细胞提取物中β-丙氨酸的存在进行的测定。
从[3-13C]α-丙氨酸经过[3-13C]β-丙氨酸进行[13C]辅酶A的生物合成其基因产物(天冬氨酸1-脱羧酶)催化从天冬氨酸生产β-丙氨酸的ΔpanD基因的插入缺失，导致泛酸的缺乏并由此不能生产辅酶A。然而，具有丙氨酸2，3-氨基变位酶而能够由α-丙氨酸产生β-丙氨酸的ΔpanD细胞能够绕过这种缺乏；尤其是，当这些细胞在存在[3-13C]α-丙氨酸生长时，可将[13C]标记掺入辅酶A。此测试证实在实施例6中分离的枯草芽孢杆菌丙氨酸2，3-氨基变位酶序列(SEQ ID NOS20和21)可催化α-丙氨酸到β-丙氨酸的转化。
用pPRONde、pPRO-KAM1或pLC4-7LC1转化的大肠杆菌ΔpanD/ΔyeiA∷CAT细胞在除25μg/ml卡那霉素和10μM Fe(NH4)2(SO4)2和1mM丙氨酸(未标记的)和10μMβ-丙氨酸之外的基本培养基中(实施例6)于37℃生长过夜。将该培养物在具有25μg/ml卡那霉素、10μM Fe(NH4)2(SO4)2和11mM[3-13C]α-丙氨酸(99％，剑桥同位素实验室，Andover，MA)但是没有未标记的α-丙氨酸或β-丙氨酸的基本培养基稀释100倍。30℃生长大约20小时后，通过离心回收细胞并通过Jaskowski和Rock(细菌学杂志J.Bacteriol.148926-32，1981)的方法产生提取物，在存在10mM二硫苏糖醇时将辅酶A的硫酯转化为自由巯基的形式。
该提取物使用包括具有串联于色谱仪和三重四极质谱仪系列之间的Waters996光电二级管阵列(PDA)吸光率监测器的Waters2690液相色谱仪Micromass Ultima LC/MS系统进行分析。使用4.6×150mm的YMC ODS-AQ(3μM粒子，120_孔)反相分配色谱法柱在室温下产生LC分离。使用包含0.5％(v/v)乙酸的含水的25mM乙酸铵(BufferA)和包含0.5％(v/v)乙酸的乙腈(BufferB)进行分析物的梯度洗脱。该洗提在等浓度10％B中0-10分钟，然后在线性10％B到100％B中10-12分钟。流速是0.250mL/min，并且调控光电二极管阵列的UV吸光率从200nm到400nm。该电喷射MS系统的所有参数是最优化的，并且基于产生目的分析物的质子化分子离子([M+H]+)和生产特征性片段离子来进行选择。使用下列仪器参数进行辅酶A的阳离子方式的ESI-MS检测毛细管4.0V；锥体80V；六边形1∶25V；孔0V；六边形2∶0V；辐射源温度100℃；脱溶温度350℃；脱溶气体500L/h；锥体气体40L/h；低质分辨率15.0；高质分辨率15.0；离子能量0；倍增650。报道质量/电荷比率(m/z)和分子质量的测不准性是0.01％。m/z 769([13C]辅酶A)的峰面积与m/z 768(未标记的辅酶A)的比率显示在表3中。
表3[13C]辅酶A的生物合成

表3中显示的结果证实具有携带丙氨酸2，3-氨基变位酶活性(SEQID NOS20和21)突变的质粒的细胞，当生长于[13C]α-丙氨酸中时，与正常丰度的[13C]辅酶A或具有载体或野生型枯草芽孢杆菌赖氨酸2，3-氨基变位酶基因的细胞相比产生更高的[13C]辅酶A比[12C]辅酶A的比率。这证明丙氨酸2，3-氨基变位酶序列可产生在辅酶A生物合成中必需的中间产物，β-丙氨酸。
酶测定测定α-丙氨酸到β-丙氨酸的转化或测定β-丙氨酸存在来确定细胞是否具有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性。例如，可应用Chen等人(生物化学杂志Biochem.J.348539-49，2000)描述的确定赖氨酸2，3-氨基变位酶活性的方法通过与还原性预温育的酶或细胞抽提物温育，取代L-[U-13C]丙氨酸为L-[U-13C]赖氨酸，以及通过纸电泳分离放射性的α-丙氨酸和β-丙氨酸，随后分别闪烁计数相当于α-丙氨酸和β-丙氨酸的斑点，从而确定丙氨酸2，3-氨基变位酶活性。可选择地，纯化的和还原性预温育的丙氨酸2，3-氨基变位酶可以与α-丙氨酸温育，并且该反应混合物通过高效液相色谱法分离来从α-丙氨酸分离产物β-丙氨酸，并对产物进行定量分析(Abe等人，J.Chromatography B，71243-9，1998)。
也可在大肠杆菌ΔpanDCAT菌株的完全细胞中监测由α-丙氨酸形成β-丙氨酸，通过将细胞在包含0.4％(w/v)葡萄糖、25μg/ml卡那霉素(赋予卡那霉素抗性的质粒)、0.25mM IPTG和1mg/ml[13C]-标记的α-丙氨酸的M9基本培养基中(Sambrook等人，分子克隆实验室手册Molecμlar CloningAlaboratory Manual，冷泉港，纽约，1989)培养，并用表达丙氨酸2，3-氨基变位酶的质粒转化，提取该细胞并通过本领域技术人员公知的高效液相色谱/质谱方法检测[13C]-β丙氨酸。
实施例10来自β-丙氨酸用于3-HP生产的合成操纵子产生允许经过β-丙氨酸产生3-HP的生物合成途径(图.1)。从β-丙氨酸到3-HP的一种途径包括利用具有CoA转移酶活性的多肽，即来自将CoA基团从一种代谢物传递到另一种的酶类的酶。如图1所示，β-丙氨酸可使用具有CoA转移酶活性的多肽和例如乙酰-CoA或丙酰-CoA的CoA供体而被转化为β-丙氨酰基-CoA。可选择地，β-丙氨酰基-CoA可以在具有CoA合成酶活性的多肽的作用下产生。β-丙氨酰基-CoA可通过具有β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性的多肽被去氨基以形成丙烯酰-CoA。可通过具有3-HP-CoA脱水酶活性的多肽进行丙烯酰基-CoA在β位置的水合作用来产生3-HP-CoA。3-HP-CoA可以作为用于β-丙氨酸的CoA供体，该反应可用具有CoA转移酶活性的多肽催化来产生3-HP产物。可选择地，3-HP-CoA可通过具有特异的CoA水解酶活性的多肽水解产生3-HP。
这些途径使用如WO02/42418(在此引入作为参考)中或下列所述克隆和表达的一些酶。使用埃氏巨球型菌(Megasphaera elsdenii)细胞(ATCC 17753)、橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)细胞(ATCC 29365)、丙酸梭菌(Clostridium propionicum)(ATCC 25522)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)(ATCC 824)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC 17933)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(ATCC 23857)、粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)(ATCC 25094)，和大鼠cDNA(Clontech，Palo Alto，CA)作为DNA的来源。本领域的技术人员将理解可使用类似的方法从任何生物体获得这些酶的序列。
在操纵子的构建前，克隆、表达和分析单独的基因。将用于在大肠杆菌中生产3-HP的合成操纵子克隆到位于T7启动子(Novagen)控制下的pET-11a(5.7kb)表达载体中，具有lac/ara-1启动子(Clontech，Palo Alto，CA)的pPROLar.A(2.6kb)载体中，以及具有trc启动子(Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)的pTrc99A(4.2kb)载体中。一些具有不同组合的相关基因的操纵子产生如下。对于丙酰-CoA转移酶和丙烯酰-CoA水合酶(或3-HP脱水酶)的分析描述在WO02/42418(在此引入作为参考)中。
来自粪产碱菌M3A的3-HP脱氢酶基因的分离粪产碱菌(ATCC #700596)是经3-HP代谢丙烯酸酯的盐碱细菌。由丙烯酸酯产生的3-HP可通过3-HP脱氢酶转化为丙二酸半醛。为了分离编码这些脱氢酶的基因，如下分离粪产碱菌基因组DNA。5mL的粪产碱菌培养物在胰胨豆胨培养液中于37℃生长，然后将收获的细胞重悬于400mL TE缓冲液中。随后将20mL的10％SDS、100μl 10mg/ml的蛋白酶K和10mL 100mg/ml溶菌酶加入细胞悬液并将混合物在42℃与临时混合物温育2小时。向该混合物加入150mL酚并且将该混合物于37℃摇动至少2小时，然后加入大约800mL氯仿。该混合物通过涡旋混合并15000rpm离心30分钟。将上层水相转入干净的微离心试管中，用60mL 3M的NaOAc和大约1mL的乙醇沉淀DNA并且通过转子回收。该DNA用400mL TE缓冲液重悬浮并加入20mL 200mg/ml的RNase，然后该混合物于37℃温育1小时。该DNA用NaOAC和乙醇再沉淀，用70％的乙醇漂洗几次并重悬于TE缓冲液中。
根据公开的3-脱氢酶基因已知氨基酸序列的保守区域设计下列变性的引物，该基因预期与所需的3-HP脱氢酶同源。APHPDHF15′TTYATYGGBYTSGGBAAYATGGG3(SEQ ID NO16)；AFHPDHF25′GAYGCNCCNGTBWSSGGBGG3′(SEQ ID NO17)；和AFHPDHR25′CATRTTRTTRCARATYTTNGC3′(SEQ ID NO18)。使用粪产碱菌基因组DNA作为模板按照制造商的说明使用Taq DNA聚合酶(Roche)，使用SEQ ID NOS16和18(反应A)或SEQ ID NOS17和18(反应B)进行PCR反应。PCR程序包括94℃ 2分钟的起始温育，4个循环的94℃，30秒；56℃，45秒，72℃3分钟；4个循环的94℃，30秒；54℃，45秒，72℃ 3分钟；4个循环的94℃，30秒；52℃，45秒，72℃3分钟；4个循环的94℃，30秒；50℃，45秒，72℃3分钟；和16个循环的94℃，30秒；47℃，45秒，72℃ 3分钟，然后是72℃ 7分钟的最后温育。两个反应都产生大约500bp的产物。反应A的PCR产物用凝胶分离，克隆到pCR11中并转化入TOP10化学感受态的细胞中，在包含50mg/ml卡那霉素的LB培养基上筛选。选择具有正确大小插入的克隆，分离其质粒并测序。根据这些序列设计下列基因的特异性巢式引物GWHPDF15′GGTTTACGAGGGCGAGAACGGCTTGCT3′(SEQ ID NO19)；GWHPDF25′CAAGCTGGGTCTGTTCATGCTGGATG3′(SEQ ID NO26)；GWHPDR15′AAGCGGTTCTCGCCCTCGTAAACCTGA3′(SEQ ID NO27)；和GWHPDR25′CGCATTCAAGTCAAAGACGTTCAGGCTA3′(SEQID NO32)，并且使用基因组步测技术分离编码3-HP脱氢酶的基因的完整ORF。该ORF的序列显示在SEQ ID NO33中，而相应的蛋白序列显示在SEQ ID NO34中。3-HP脱氢酶的起始密码子在SEQ IDNO33的408位并通过位于SEQ ID NO33的397-403位的核糖体-结合位点进行下去。终止密码子位于SEQ ID NO33的1304位。
丙氨酸-COA氨裂解酶(ACL)的克隆、表达和分析从丙酸梭菌克隆两个acl基因，acl-1(SEQ ID NO22)编码145个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO23)且acl-2(SEQ ID NO53)编码144个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO54)。这两种蛋白是高度同源的并且只有C-末端的8个氨基酸不同。acl-1和acl-2基因使用下列引物来克隆用于克隆acl-1的OsaclNdeF5′-GGGAATTCCATATGGTAGGTAAAAAGGTTGTACATC-3′(SEQ ID NO35)，和OsaclBamR5′-GACGGATCCATTCGTCCGCTTGAATAACTAAAG-3′(SEQ IDNO.36)，和用于克隆acl-2的SEQ ID NO35和OSacl2BamR5′-CGACGGATCCCGAAAATGTCACCAAAAATTATTGAG-3′(SEQ ID NO37)。所得到的序列被克隆到用Ndel和BamHI消化的pET11a载体中。将所得到的质粒pACL-1和pACL-2转化入BL21(DE3)细胞中。携带pET 11a(对照)、pACL-1和pACL-2的BL21(DE3)生长在补充有50μg/ml羧苄青霉素的10ml LB培养基中至OD600-0.5并且用100μM IPTG诱导4小时。通过在Avanti J20离心机(Beckman，Fullerton，CA)中以3500rpm离心收集诱导的细胞，并且按照制造商的说明用Bug Buster(Novagen，Madison，WI)处理。在丙烯酰-CoA转化为β-丙氨酸-CoA(逆反应相应于图1中的途径)后，将所得到的细胞提取物用于酶活测定。
分析混合物包含10μl 1M的TAE、20μl 1M的NH4Cl、2μl 100μM的丙烯酰-COA、10μl细胞抽提物和158μl的H2O。酶促反应物在37℃温育5分钟并通过加入200μl 10％的TFA终止。将混合物加载到C18 Sep-Pak Vac Icc柱(Waters，Milford，MA)上，用200μl 40％的乙腈、0.1％的TFA洗提并且通过在Speed Vac(Savant InstrμMents，Holbrook，NY)中离心，使体积减小到100μl。β-丙氨酰基-CoA的形成通过LC-MS使用标准的方法来检测。ACL-1和ACL-2酶都有活性并且被用于β-丙氨酸操纵子的构建。
来自大肠杆菌的CoA转移酶的克隆、表达和分析通过PCR扩增开放阅读框yfdE(在PubMed数据库中确定为假设的蛋白)。
因为该开放阅读框具有两个潜在的起始位点，使用下列引物克隆和表达两个基因用于yfdE-1的yfdE gtg nde sen(5′-AGAGAGCATATGTCTTTTCACCTTCGGC-3′；SEQ ID NO38)，和yfdE atg nde sen(5′-AGAGAGGGATCCGCGGCTCCCACAATGTTGAAATG-3′SEQID NO39)，和yfdE-2的yfdE gtg nde sen(SEQ ID NO38)，和yfdE bam反义(5′-AGAGAGCATATGACAAATAATGAAAGCAAAGG-3′，SEQID NO40)。
使用来自大肠杆菌MG1655的染色体DNA被用作利用Pfu Turbo(Stratagene)进行的PCR的模板，使用下列PCR条件进行94℃5分钟；25个循环的94℃ 30秒，55℃ 30秒，和72℃ 2分钟20秒，然后在72℃温育7分钟。PCR反应物使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化，用NdeI和BamHI消化而克隆到用相同限制酶消化的pET28b(Novagen)中，并转化入化学感受态的TOP10细胞(Invitrogen)中。分离来自阳性克隆的质粒并转化入BL21(DE3)表达细胞(Novagen)中。细胞在LB培养基中于37℃生长到OD600.6，用100μM的IPTG诱导并且在诱导后温育另外的3小时。通过离心收获该细胞并用0.85％NaCl洗涤一次。细胞颗粒沉淀贮存于-80℃直到进一步使用。
细胞颗粒沉淀在冰上解冻，并重悬于4ml结合缓冲液(NovagenHisBind纯化试剂盒)中。该细胞用三步法通过French Pressure Cell(SLM Aminco)(10000psi)来裂解。细胞碎片通过离心(30,000×g 30分钟)除去。该提取物在按照制造商的说明加载到Quick900柱体(Novagen)前用0.45μm的针筒过滤器过滤。纯化的蛋白使用PD-10柱(Pharmacia)按照制造商的说明脱盐。所使用的缓冲液是5mM的硼酸、5mM的Tris、5mM的柠檬酸、5mM的NaH2PO4pH7.0。
使用包含100mM磷酸钾，pH7.0，100mM的β-丙氨酸，1mM乙酰-CoA和20μl纯化的CoA转移酶，总分析体积为200μl的反应混合物分析纯化的蛋白。反应物在室温下温育20分钟，随后用100μl 10％的三氟乙酸(TFA)终止。反应物使用1 cc SepPak Vac柱体(WatersMilford，MA)用1ml甲醇纯化，并用1ml 0.1％的TFA洗涤两次。施加样品并且用1ml 0.1％的TFA洗涤柱体两次。样品用包含0.1％TFA的200μl 40％的乙腈洗提，在旋转蒸发器中干燥到1/2的体积，并且通过液体色谱/质谱法分析。用yfdE-1或yfdE-2蛋白分析对应于β-丙氨酰基-CoA的预期质量的峰，且该峰在缺失该纯化蛋白的对照物中不存在，此表明CoA转移酶决定了β-丙氨酰基-CoA的合成。
操纵子1和2ACL-丙酰-CoA转移酶-丙烯酰-CoA水合酶构建用于下列转化β-丙氨酸到β-丙氨酰基-CoA到丙烯酰-CoA到3-HP的操纵子。通过PCR从埃氏巨球型菌的基因组DNA中扩增编码CoA转移酶的基因，使用引物OSNBpctF(5′-GGGAATTCCATATGAGAAAAGTAGAAATCATTACAGCTG-3′；SEQ ID NO41)和OSHTR(OSHTR5′-ACGTTGATCTCCTTCTACATTATTTTTTCAGTCCCATG-3′；SEQ ID NO42)。
通过PCR从橙色绿屈挠菌的基因组DNA中扩增CoA水合酶基因，使用引物OSTHF(5′-CATGGGACTGAAAAAATAATGTAGAAGGAGATCAACGT-3′；SEQ ID NO43)和OSHBR(5′-CGACGGATCCTCAACGACCACTGAAGTTGG-3′；SEQ ID NO44)。
从丙酮梭菌基因组DNA克隆ACL-1和ACL-2(β-丙氨酸-CoA氨裂解酶)基因，扩增acl-1的引物对OsaclXbaF(5′-CTAGTCTAGAGCTTTCTAAGAAACGATTTCCG-3′；SEQ ID NO45)和OSaclNdeR(5′-GGGAATTCCATATGCGTAACTTCCTCCTGCTATCATTCACCGGGGTGCTTTCT-3′；SEQ ID NO46)；扩增acl-2的引物对OSacl2XbaF(5′-CTAGTCTAGAGGAAACCGCTTAACGAACTC-3′；SEQ ID NO47)和OSacl2-2NdeR(5′-GGGAATTCCATATGCGTAACTTCCTCCTGCTATTATTGAGGGTGCTTTGCATCC-3′；SEQ ID NO48)。
在Perkin Elmer 2400热循环仪中按照制造商的指导使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)进行PCR。PCR在下列条件下进行94℃ 2分钟的起始变性步骤；25个循环的94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 2分钟；最后72℃延伸7分钟。所得到的PCR产物使用Qiagen Gel Extraction试剂盒(Qiagen，Inc.)进行凝胶纯化。
CoA-转移酶和CoA水合酶的PCR产物是在组装PCR中共同组装的。OSTHF和OSHTR引物(SEQ ID NOS42和43)是彼此互补的，这就允许互补的DNA末端在PCR中相互退火和双向延伸DNA。为了保证组装及其后扩增的效率，将两个末端引物OSNBpctF和OSHBR(SEQ ID NOS41和44)加入包含100ng纯化的CoA-转移酶和CoA-水合酶的PCR产物以及比率为8∶1的rTth聚合酶(Applied Biosystems，Foster City、CA)和Pfu Turbo聚合酶(stratagene)混合物的组装PCR混合物中。聚合酶混合物确保PCR反应的高保真度。组装PCR在下列条件下进行94℃ 1分钟的起始变性步骤；20个循环的94℃ 30秒，54℃ 30秒，68℃ 2.5分钟；68℃ 7分钟的最终延伸。如上所述用凝胶纯化组装PCR产物并用NdeI和BamHI消化。这些限制性酶的位点用OSNBpctF(NdeI)和OSHBR(BamHI)引物(SEQ ID NOS41和44)引入组装PCR产物。消化的PCR产物在80℃温育30分钟(使限制性酶失活)并直接连接到pET 11a载体中。
载体pET 11A用NdeI和BamHI消化，使用Qiagen Gel Extraction试剂盒凝胶纯化，如制造商(Roche Molecular Biochemicals)所建议的用虾碱性磷酸酶处理，并与组装PCR的产物连接。在16℃使用T4连接酶(Roche Molecular Biochemicals)进行连接过夜。将连接混合物转化到化学感受态的NovaBlue细胞(Novagen)中，并接种到补充有50μg/ml羧苄青霉素的LB平板上。选择单独的克隆用于提纯质粒DNA；使用QiagenSpinMiniprep试剂盒获得质粒DNA。质粒用NdeI和BamHI消化并通过凝胶电泳进行分析。
所获得的质粒命名为pTH，用XbaI和NdeI消化，如上所述使用凝胶电泳和Qiagen Gel Extraction试剂盒纯化，并作为后面克隆用相同的酶消化的ACL-1和ACL-2 PCR产物的载体。连接如上所述进行，并如上所述将连接混合物转化入化学感受态的NovaBlue细胞。选择单独的克隆用于提纯质粒DNA；质粒DNA使用QiagenSpinMiniprep试剂盒获得。质粒用XbaI和NdeI消化并通过凝胶电泳分析。将所得的携带构建的操纵子的pATH质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中以测定克隆基因的表达。
为了测定基因表达和3-HP的产生，携带pATH-1和pATH-2质粒的BL21(DE3)细胞在补充有10g/l葡萄糖、5g/lβ-丙氨酸和50μg/ml羧苄青霉素的M9CA培养基(Difco Laboratories，Sparks，MA)中生长到OD600～0.5，并用100μM的IPTG在有氧条件下诱导。用携带pET11a载体的BL21(DE3)细胞作为对照。在IPTG诱导2和4小时后取细胞样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。所有3种酶被显示为凝胶上显示的合适大小的条带。用操纵子构建体pATH-1和pATH-2通过LC-MS分析检测由β-丙氨酸生成的3-HP，但不在对照细胞中进行分析。
操纵子34-氨基丁酸氨基转移酶-3-羟异丁酸脱氢酶在可选择的或另外的途径中，β-丙氨酸可通过具有β-丙氨酸-酮戊二酸氨基转移酶活性的多肽脱氨基来生产丙二酸半醛，其可进一步通过具有3-HP脱氢酶活性的多肽或具有3-羟基异丁酸脱氢酶活性的多肽还原成3-HP。
用于分离、测序、表达和测试这种多肽的活性的方法描述在WO02/42418(在此引入作为参考)中。本领域的技术人员将理解可使用相似的方法从任何生物体中获得任何这种多肽的序列。
通过PCR用OsabatF(5′-CCGGAATTCTTTAATATGCGATTTGGAGGAG-3′；SEQ ID NO49)和OSDATR(5′-GTCCGTCTCCCTTTCAGCTTAAATCGCTATTCTTATAGC-3′；SEQ ID NO50)引物自丙酮丁醇梭菌扩增编码4-氨基丁酸氨基转移酶的基因。
通过PCR用OSATDF(5′-GCTATAAGAATAGCGATTTAAGCTGAAAGGGAGACGGAC-3′；SEQ ID NO51)和OSibdR(5′-CGACGGATCCGCAGTGAGTGAGCCTTGGAG-3′；SEQ ID NO52)引物自铜绿假单胞菌扩增编码3-羟基异丁酸脱氢酶的基因。PCR在PerkinElmer2400热循环仪中根据制造商的说明使用Pfu Turbo聚合酶在下列条件下进行94℃ 2分钟的起始变性步骤；25个循环的94℃ 30秒，56℃ 30秒，72℃ 1.5分钟；72℃ 10分钟的最终延伸。所得的PCR产物使用QiagenGel Extraction试剂盒进行凝胶纯化。
4-氨基丁酸氨基转移酶和3-羟基异丁酸脱氢酶的PCR产物在组装PCR中共同组装。SEQ ID NOS50和51中显示的引物是彼此互补的，因此互补的DNA末端可在PCR反应中相互退火，并且双向延伸DNA。为了保证组装及其后扩增的效率，将两个末端引物OSabatF和OSibdR(SEQ ID NOS49和52)加入包含100ng纯化的4-氨基丁酸氨基转移酶和3-羟基异丁酸脱氢酶的PCR产物以及以8∶1比率混合的rTth聚合酶和Pfu Turbo聚合酶的组装PCR混合物中。组装PCR在下列条件下进行94℃ 1分钟的起始变性步骤；25个循环的94℃ 30秒，55℃ 30秒，68℃ 3分钟；最终68℃延伸7分钟。组装PCR产物如上所述用凝胶纯化并用EcoRI和BamHI消化。这些限制性酶的位点用OSabatF(EcoRI)(SEQ ID NO49)和OSibdR(BamHI)(SEQ ID NO52)引物引入组装PCR产物。消化的PCR产物在80℃加热30分钟，使用Qiagen Gel Extraction试剂盒进行凝胶纯化，并连接到pPROLar.A载体中。
载体pPROLar.A用EcoRI和BamHI消化，使用Qiagen Gel Extraction试剂盒凝胶纯化，如制造商所建议的用虾碱性磷酸酶处理，并与组装PCR的产物连接。如上所述进行连接，转化入化学感受态的TOP10细胞(Novagen)并接种到补充有25μg/ml卡那霉素的LB平板上。选择单独的克隆用于提纯质粒DNA；使用QiagenSpinMiniprep试剂盒来获得质粒DNA。质粒用EcoRI和BamHI消化并通过凝胶电泳分析。所获得的携带4-氨基丁酸氨基转移酶和3-羟基异丁酸脱氢酶基因的质粒被称为pATD。
为了观察基因表达和生产3-HP，携带pATD质粒或无质粒(对照)的TOP 10细胞在补充有5g/l葡萄糖、5g/lβ丙氨酸和25μg/ml卡那霉素的培养基中生长到OD600～0.5并且在有氧条件下用100μM的IPTG和0.5％阿拉伯糖诱导。通过用携带pATD的细胞进行LC-MS分析来检测由β-丙氨酸产生3-HP，但不在对照细胞中进行。在IPTG诱导6和24小时后的细胞上清液中观察到3-HP。
实施例11用于从α-丙氨酸产生3-HP的合成操纵子在实施例10中产生了允许通过几个可选择的途径经β-丙氨酸生产3-HP的几个操纵子。在该实施例中公开的方法详述了通过包括在此操纵子中公开的丙氨酸2，3-氨基变位酶序列的方法。这允许经α-丙氨酸生产3-HP。
操纵子4α-丙氨酸氨基变位酶-ACL-丙酰-CoA转移酶-烯丙酰-CoA水合酶用于转化α-丙氨酸到β-丙氨酸到β-丙氨酰基-CoA到-CoA到3-HP的操纵子构建如下。使用携带丙氨酸2，3-氨基变位酶(实施例6；SEQ ID NOS20和21)的质粒pLC4-7LC1质粒构建pLCATH2-1。ATH-2操纵子被通过用下列引物OSacl2NotF25′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCAGATTAAAGGAGGAATTCTCAATGG-3′(SEQ ID NO55)和OShydXbaR5′CTAGTCTAGATCAACGACCACTGAAGTTGG-3′(SEQ IDNO56)扩增自pATH-2(实施例10)。如上所述使用以8∶1的比率混合的rTth聚合酶和Pfu Turbo聚合酶，在下列条件下进行PCR94℃ 2分钟的起始变性步骤；25个循环的94℃ 30秒，56℃ 30秒，68℃ 2分钟；68℃ 7分钟的最终延伸。
所得的PCR产物使用Qiagen PCR Purification试剂盒纯化并用NotI和XbaI消化。消化的DNA在65℃加热30分钟以使酶失活，使用Qiagen Gel Extraction试剂盒凝胶纯化，并克隆到用相同酶消化的pLC4-7LC-1质粒中。在16℃使用T4连接酶进行连接过夜。将连接混合物转化入化学感受态的Tuner细胞(Novagen)并接种到补充有25μg/ml卡那霉素的LB平板上。选择单独的克隆用于提纯质粒DNA；使用QiagenSpinMiniprep试剂盒来获得质粒DNA。质粒用NotI和XbaI消化并通过凝胶电泳分析。所得的Tuner(pLCATH2-1)细胞被用于观察克隆基因的表达和从α-丙氨酸和β-丙氨酸产生3-HP。
操纵子5α-丙氨酸氨基变位酶-4氨基丁酸氨基转移酶-3-羟基异丁酸脱氢酶用于α-丙氨酸到β丙氨酸到丙二酸半醛3-HP的转化的操纵子构建如下。使用携带丙氨酸2，3-氨基变位酶(实施例6；SEQ ID NOS20和21)的质粒pLC4-7LC1构建pLCATD1。ATD操纵子用OSabatNotF5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTTAATATGCGATTTGGAGGAG-3′(SEQ ID NO57)和OsibdXbaR5′-CTAGTCTAGAGCAGTGAGTGAGCCTTGGAG-3′(SEQ ID NO58)扩增自pATD质粒(实施例10)。如上所述对操纵子4进行PCR，并且纯化所得的PCR产物，用NotI和XbaI消化，克隆到pLC4-7LC-1质粒中，转化入化学感受态的Tuner细胞，并如对操纵子4所描述的，选择单独的克隆。
操纵子的诱导和3-HP的生产为了观察基因表达和3-HP的生产，携带pLCATH2-1、pLCATD1质粒或pPROLar载体(对照)的Tuner细胞在补充有5g/l葡萄糖、5g/lα-丙氨酸或5g/lβ-丙氨酸和25μg/ml卡那霉素的LB培养基中生长到OD600-0.5，并且在有氧条件下用100μM的IPTG和0.5％的阿拉伯糖诱导。使用携带pLCATH2-1和pLCATD1的细胞通过LC-MS分析来检测由β-丙氨酸产生3-HP，但不在对照细胞中进行。在诱导22小时后的细胞上清液中观察到3-HP。
操纵子6丙氨酸氨基变位酶-β丙氨酸转氨酶-3-hp脱氢酶-α-丙氨酸氨基转移酶用于转化丙酮酸到α-丙氨酸到β-丙氨酸到丙二酸半醛到3-HP的操纵子构建如下。编码丙氨酸2，3-氨基变位酶的基因通过PCR用引物KAM10F(5′-CACACAGAATTCATTAAAGAGGAG-3′；SEQ ID NO59)和KAMRBATR 5′-CATAATCAAACTCAAAGTCAACCATATAAGATCTCCTCCTTACTTCATGAAGAATCCCCTCC-′；SEQ ID NO60)扩增自pLC4-7LC1。
β-丙氨酸氨基转移酶的基因通过PCR用引物KAMRBATF(5′-GGAGGGGATTCTTCATGAAGTAAGGAGGAGATCTTATATGGTTGACTTTGAGTTTGATTG-3′；SEQ ID NO61)和RBATAFDR(5′-CGTGTTACTCATTTTGTCTCCTCGTCATTTACTTGAAGTCTGCTAAGATAC-3′；(SEQ ID NO62)扩增自大鼠cDNA。
3-HP脱氢酶通过PCR用引物RBATAFDF(5′-GTATCTTAGCAGACTTCAAGTAAATGACGAGGAGACAAAATGAGTAACACG-3′；SEQID NO63)和(5′-TCATTCACCCGTGAGGCCATGAATATATCTCCTTCTTAAGCTTAGTGCTTCTGACGGTAC-3′；SEQ ID NO64)扩增自粪产碱菌DNA。
α-丙氨酸氨基转移酶基因用引物AFDRAATF(5′-GTACCGTCAGAAGCACTAAGCTTAAGAAGGAGATATATTCATGGCCTCACGGGTGAATGA-3′；SEQ ID NO65)和RATGPTOR(5’-GACTAGATATCTCAGGAGTACTCATGGGTGAA-3′(SEQ ID NO66)扩增自大鼠cDNA。
在下列条件下进行上述PCR94℃ 2分钟的起始变性步骤；10个循环的94℃ 30秒，48℃ 30秒，72℃ 2分钟；5个循环的94℃ 30秒，52℃ 30秒，72℃ 2分钟；10个循环的94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 2分钟；72℃ 7分钟的最终延伸。所得的PCR产物使用Qiagen Gel Extraction试剂盒进行凝胶纯化。
丙氨酸2，3-氨基变位酶和β丙氨酸氨基转移酶的PCR产物，以及3-HP脱氢酶和α-丙氨酸氨基转移酶的PCR产物是在两个组装PCR中成对组装的。SEQ ID NOS60和61以及SEQ ID NOS64和65中的引物对是彼此互补的，因此互补DNA的末端可以在PCR反应中相互退火并双向延伸DNA。为了保证组装及其后扩增的效率，将两个末端引物(SEQ ID NOS59和62)加入包含100ng两个纯化的丙氨酸氨基变位酶和β-丙氨酸氨基转移酶的PCR产物以及以8∶1比率混合的rTth聚合酶和Pfu Turbo聚合酶的组装PCR混合物中。将另外两个末端引物，SEQ ID NOS63和66加入包含100ng纯化的3-HP脱氢酶和α-丙氨酸氨基转移酶以及以8∶1的比率混合的rTth聚合酶和Pfu Turbo聚合酶的组装PCR混合物中。组装PCR在下列条件下进行94℃ 2分钟的起始变性步骤；5个循环的94℃ 30秒，48℃ 30秒，68℃ 4分钟；5个循环的94℃ 30秒，52℃ 30秒，68℃ 4分钟；5个循环的94℃ 30秒，55℃ 30秒，68℃ 4分钟；10个循环的94℃ 30秒，50℃ 30秒，68℃ 4分钟；68℃ 7分钟的最终延伸。
进行第二个组装PCR以联合组装的对来产生包含所有4个基因的操纵子6。将两个末端引物(SEQ ID NOS59和66)加入到包含100ng纯化的丙氨酸氨基变位酶/β-丙氨酸氨基转移酶对；100ng纯化的3-HP脱氢酶/α-丙氨酸氨基转移酶对以及以8∶1的比率混合的rTth聚合酶和Pfu Turbo聚合酶的PCR混合物中。组装PCR在下列条件下进行94℃ 2分钟的起始变性步骤；15个循环的94℃ 30秒，50℃ 30秒，70℃ 5分钟；10个循环的94℃ 30秒，55℃ 30秒，70℃ 5分钟；70℃ 7分钟的最终延伸。
如上所述凝胶纯化组装的PCR产物并用EcoRI和EcoRV消化。用SEQ ID NO59(EcoRI)和SEQ ID NO66(EcoRV)引物将这些限制性酶的位点引入组装的PCR产物中。消化的PCR产物在65℃加热30分钟，使用Qiagen Gel Extraction试剂盒进行凝胶纯化，并连接到用EcoRI和SmaI消化的pTrc99A载体中。连接在16℃使用T4连接酶进行过夜，将混合物转化入化学感受态的Tuner细胞中，并接种到补充有50μg/ml羧苄青霉素的LB平板上。选择单独的克隆用于质粒DNA提纯；使用QiagenSpinMiniprep试剂盒来获得质粒DNA。通过PCR用SEQ ID NOS59和66引物及凝胶电泳分析进行筛选质粒。所获得的质粒被命名为pTrcβ-ala。
使用Tuner(pTrcβ-ala)细胞确定克隆基因的表达和从葡萄糖、α-丙氨酸和β-丙氨酸进行的3-HP的生产。Tuner(pTrc99A)被用作对照。细胞在补充有5g/l葡萄糖和50μg/ml羧苄青霉素；或5g/l葡萄糖、5g/lα-丙氨酸和50μg/ml羧苄青霉素；或5g/l葡萄糖、5g/lβ-丙氨酸和50羧苄青霉素的M9CA培养基(Difco Laboratories)中生长到OD600～0.5；并且在有氧条件下用100μM的IPTG和0.5％的阿拉伯糖诱导。来自β-丙氨酸的3-HP的生产用携带pTrcβ-ala的细胞通过LC-MS分析进行检测，但不在对照细胞中进行。在诱导22小时后的细胞上清液中观察到3-HP。
实施例12由β-丙氨酸产生泛酸泛酸可由β-丙氨酸通过具有α-酮泛酸羟甲基转移酶(E.C.2.1.2.11)、α-酮泛酸还原酶(E.C.1.1.1.169)和泛酸合酶(E.C.6.3.2.1)活性的多肽来产生(图3)。
使用实施例10和11中描述的克隆方法，α-酮泛酸羟甲基转移酶(E.C.2.1.2.11)、α-酮泛酸还原酶(E.C.1.169)和泛酸合酶(E.C.6.3.)的多肽可被分离、测序、表达和测试。本领域的技术人员将理解可使用相似的方法从任何生物体中获得任何这种多肽的序列。
实施例13重组表达使用公众可利用的酶的cDNA和氨基酸顺序以及在此公开的酶和序列，诸如丙氨酸2，3-氨基变位酶、CoA转移酶、β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶、3-HP CoA脱水酶、4-氨基丁酸氨基转移酶、β-丙氨酸-2-氧化戊二酸氨基转移酶、3-羟丙酸脱氢酶、3-羟基异丁酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、3-HP-COA水解酶、3-羟异丁酰基-CoA水解酶多醇酸合酶、脂肪酶、酯酶、CoA水解酶、α-酮泛酸羟甲基转移酶、α-酮泛酸还原酶、泛酸合酶、泛酸激酶、4′-磷酸泛酰巯基乙胺腺嘌呤转移酶、脱磷酸-CoA激酶乙酰化醛NAD(+)氧化还原酶、醇NAD(+)氧化还原酶、醛脱氢酶(NAD(P)+)和乙醇脱氢酶、及其变体、多态型、突变体、片段和融合体，任何蛋白诸如酶的表达和提纯，是能够通过标准的实验室技术来得到的。本领域的技术人员将理解其酶和片段可在任何目的细胞或生物体中重组生产以及在使用前，例如在3-HP、泛酸及其衍生物的生产前进行纯化。
用于生产重组蛋白的方法是本领域公知的。因此本发明的范围包括任何蛋白或其片段诸如酶的重组表达。例如，参见Johnson等人的美国专利No5,342,764；Pausch等人的美国专利No5,846,819；Fleer等人的美国专利No5,876,969以及Sambrook等人(分子克隆实验室手册，冷泉港，纽约，1989，第17章)。
简而言之，编码蛋白质或肽的部分的、全长的或变化的cDNA序列可被连接到表达载体诸如细菌表达载体中。蛋白质和/或肽可通过将启动子置于cDNA序列的上游而生产。启动子的实例包括但不限于，lac，trp，tac，trc，噬菌体λ的主要操作子和启动子区域，fd外壳蛋白的调控区域，SV40的早期和晚期启动子，源自多形瘤、腺病毒、反向病毒、杆状病毒和猿猴病毒的启动子，3-磷酸甘油酸激酶的启动子，酵母酸性磷酸酶的启动子，酵母α-接合因子的启动子及其组合。
适合完整天然蛋白质生产的载体包括pKC30(Shimatake和Rosenberg，1981，Nature 292128)、pKK177-3(Amann和Brosius，1985Gene40183)和pET-3(Studier和Moffatt，1986，J.Mol.Biol.189113)。DNA序列可被转入其它克隆载体，例如其它的质粒、细菌噬菌体、柯斯质粒、动物病毒和酵母人工染色体(YACs)(Burke等人，1987，Science 236806-12)。这些载体可导入多种宿主，包括体细胞和简单或复杂生物体中，诸如细菌、真菌(Timberlake和Marshall，1989，Science 2441313-7)，无脊椎动物、植物(Gasser和Fraley，1989，Science 2441293)和哺乳动物(Pursel等人，1989，Science 2441281-8)，它们是通过导入异源的cDNA而提供转基因的。
为了在哺乳动物细胞中表达，cDNA序列可连接到异源的启动子上，例如猿猴病毒SV40、pSV2载体中的启动子(Mulligan和Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.美国782072-6)并导入例如猴子COS-1细胞的细胞中(Gluzman，1981，细胞Cell 23175-82)以实现瞬时或长期的表达。嵌合基因构建体的稳定整合可在哺乳动物细胞中通过诸如新霉素(Southern和Berg，1982，J.Mol.Aool.Genet.1327-41)和霉酚酸(Mulligan和Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.美国782072-6)的生物化学筛选而保持。
将DNA转入诸如人类或其它哺乳动物的真核细胞中是一种常规技术。载体以纯的DNA导入受体细胞(转染)通过，例如，磷酸钙沉淀(Graham和vander Eb，1973，Virology 52466)，磷酸锶沉淀(Brash等人，1987，Mol.Cell Biol.72013)、电穿孔(Neumann等人，1982，EMBO.J.1841)、脂质转染法(Felgner等人，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.美国847413)、DEAE葡聚糖(McCuthan等人，1968，J.Natl.CancerInst.41351)、微注射(Mueller等人，1978，Cell 15579)、原生质体融合(Schafner，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.美国772163-7)或颗粒枪(Klein等人，1987，Nature 32770)。可选择地，cDNA可通过用病毒载体感染来导入，例如逆转录病毒(Bernstein等人，1985，Gen.Engrg.7235)，诸如腺病毒(Ahmad等人，1986，J.Virol.57267)或疱疹(Spaete等人，1982，Cell 30295)。
实施例14肽的合成和纯化在此公开的酶，诸如丙氨酸2，3-氨基变位酶、CoA、β丙氨酰基CoA氨裂解酶、3-HP-CoA脱水酶、4-氨基丁酸氨基转移酶、β-丙氨酸-2-氧化戊二酸氨基转移酶、3-羟丙酸脱氢酶、3-羟基异丁酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、3-HP-CoA水解酶、3-羟异丁酰基CoA水解酶、多醇酸合酶、脂肪酶、酯酶、CoA水解酶、α-酮泛酸羟甲基转移酶、α-酮泛酸还原酶、泛酸合酶、泛酸激酶、4′-磷酸泛醇酰-1-半胱氨酸合成酶、4-磷酸泛醇酰半胱氨酸脱羧酶、ATP4′-磷酸泛酰巯基乙胺腺嘌呤转移酶、脱磷酸-CoA激酶乙酰化醛NAD(+)氧化还原酶、醇NAD(+)氧化还原酶、醛脱氢酶(NAD(P)+)和乙醇脱氢酶(及其变体、融合体、多态型、片段和突变体)可通过本领域已知的许多人工或自动化合成的任何方法进行化学合成。例如，使用Applied Biosystems Model 431A肽合成仪以及使用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)氨基-末端保护，与二环己基碳二亚胺/羟基苯并三唑或2-(1氢-苯并-三唑-1基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯/羟基苯并三唑(HBTU/HOBT)偶联，以及使用羧基-末端酸的p-羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯(HMP)或Sasrin树脂或者羧基-末端酰胺的Rink氨化树脂以0.25毫摩尔(mmole)的刻度进行固相肽合成(SPPS)。
通过在三氟乙酸中三苯甲基化和三苯甲醇化，随后通过如Atherton等人(固相肽合成Solid Phase Peptide Synthesis，IRL PressOxford，1989)所描述的Fmoc衍生化，从合适的前体氨基酸来制备Fmoc-衍生的氨基酸。
使用1％的TFA二氯甲烷溶液切割Sasrin树脂-结合的肽以产生受保护的肽。当合适时，受保护肽的前体在氨基和羧基末端之间被通过使用二苯磷酸叠氮化物在新生成肽的氨基末端的自由胺和羧基末端自由酸进行反应中而环化，其中氨基酸侧链是受保护的。
HMP或Rink氨化物树脂-结合产物通常被切割且包含环化肽的受保护侧链被利用含有三氟乙酸(TFA)的溶液，任意也包含水、苯硫基甲烷和乙二硫醇，以100∶5∶5∶2.5的比率于室温0.5-3小时而去保护。
粗制的肽通过预高压液相色谱法(HPLC)来纯化，例如使用WaterDelta-PAKC18柱和用乙腈缓和的含0.1％TFA的水梯度洗脱。柱洗提后，从洗脱级分中蒸发乙腈，然后冻干该洗脱级分。如此生产和纯化的各种产物的同一性可通过快速原子轰击质谱法(FABMS)或电喷射质谱法(ESMS)进行验证。
鉴于我们公开的原理可应用于许多可能的实施方案，应该理解举例说明的实施方案只是公开的特定实施例而不应该作为本发明范围的限制。相应的，所公开内容的范围与下列权利要求是一致的。因此我们要求保护所有在这些权利要求的范围和精神内的发明。
序列表<110>卡吉尔公司(CARGIL，INCORPORATED)<120>丙氨酸2，3-氨基变位酶(ALANINE 2，3-AMINOMUTASE)<130>SCT042701-47<150>US 60/350,727<151>2002-01-18<150>US 60/375,785<151>2002-04-25<160>66<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>1gcgcgaggag gagttcatat gaaaaacaaa tggtataaac 40<210>2<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>2cgggcaccgc ttcgaggcgg ccgcaccatt cgcatg 36<210>3<211>1416<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)<400>3ttgaaaaaca aatggtataa accgaaacgg cattggaagg agatcgagtt atggaaggac 60gttccggaag agaaatggaa cgattggctt tggcagctga cacacactgt aagaacgtta120
gatgatttaa agaaagtcat taatctgacc gaggatgaag aggaaggcgt cagaatttct 180accaaaacga tccccttaaa tattacacct tactatgctt ctttaatgga ccccgacaat 240ccgagatgcc cggtacgcat gcagtctgtg ccgctttctg aagaaatgca caaaacaaaa 300tacgatctgg aagacccgct tcatgaggat gaagattcac cggtacccgg tctgacacac 360cgctatcccg accgtgtgct gtttcttgtc acgaatcaat gttccatgta ctgccgctac 420tgcacaagaa ggcgcttttc cggacaaatc ggaatgggcg tccccaaaaa acagcttgat 480gctgcaattg cttatatccg ggaaacaccc gaaatccgcg attgtttaat ttcaggcggt 540gatgggctgc tcatcaacga ccaaatttta gaatatattt taaaagagct gcgcagcatt 600ccgcatctgg aagtcatcag aatcggaaca agagctcccg tcgtctttcc gcagcgcatt 660accgatcatc tgtgcgagat attgaaaaaa tatcatccgg tctggctgaa cacccatttt 720aacacaagca tcgaaatgac agaagaatcc gttgaggcat gtgaaaagct ggtgaacgcg 780ggagtgccgg tcggaaatca ggctgtcgta ttagcaggta ttaatgattc ggttccaatt 840atgaaaaagc tcatgcatga cttggtaaaa atcagagtcc gtccttatta tatttaccaa 900tgtgatctgt cagaaggaat agggcatttc agagctcctg tttccaaagg tttggagatc 960attgaagggc tgagaggtca tacctcaggc tatgcggttc ctacctttgt cgttgacgca1020ccaggcggag gaggtaaaat cgccctgcag ccaaactatg tcctgtcaca aagtcctgac1080aaagtgatct taagaaattt tgaaggtgtg attacgtcat atccggaacc agagaattat1140atccccaatc aggcagacgc ctattttgag tccgttttcc ctgaaaccgc tgacaaaaag1200gagccgatcg ggctgagtgc catttttgct gacaaagaag tttcgtttac acctgaaaat1260gtagacagaa tcaaaaggag agaggcatac atcgcaaatc cggagcatga aacattaaaa1320gatcggcgtg agaaaagaga tcagctcaaa gaaaagaaat ttttggcgca gcagaaaaaa1380cagaaagaga ctgaatgcgg aggggattct tcatga 1416<210>4<211>60<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物<400>4tatcaattcg ttacaggcga tacatggcac gcttcggcgc gtgtaggctg gagctgcttc 60<210>5<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>5gatgtcgcgg ctggtgagta accagccgca gggataacaa catatgaata tcctccttag 60<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>6ttaccgagca gcgttcagag 20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>7cacctggcgg tgacaaccat 20<210>8<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物
<400>8gcggcgtgaa gtttcccaac ccgttctgcc tctcttcttc gtgtaggctg gagctgcttc 60<210>9<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>9ttacaacgtt accgggtgtt ctttctcgcc tttcttaaac catatgaata tcctccttag 60<210>10<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>10cacaaaacaa aatacgatat ggaagacccg ctccatgagg atgaagattc a 51<210>11<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>11tgaatcttca tcctcatgga gcgggtcttc catatcgtat tttgttttgt g 51<210>12<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>16
ttyatyggby tsggbaayat ggg 23<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>17gaygcnccng tbwssggbgg 20<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>CDS<222>(1)..(1416)<223>
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145 150 155 160gct gca att gct tat atc cgg gaa aca ccc gaa atc cgc gat tgt tta 528Ala Ala Ile Ala Tyr Ile Arg Glu Thr Pro Glu Ile Arg Asp Cys Leu165 170 175att tca ggc ggt gat ggg ctg ctc atc aac gac caa att tta gaa tat 576Ile Ser Gly Gly Asp Gly Leu Leu Ile Asn Asp Gln Ile Leu Glu Tyr180 185 190att tta aaa gag ctg cgc agc att ccg cat ctg gaa gtc atc aga atc 624Ile Leu Lys Glu Leu Arg Ser Ile Pro His Leu Glu Val Ile Arg Ile195 200 205gga aca aga gct ccc gtc gtc ttt ccg cag cgc att acc gat cat ctg 672Gly Thr Arg Ala Pro Val Val Phe Pro Gln Arg Ile Thr Asp His Leu210 215 220tgc gag ata ttg aaa aaa tat cat ccg gtc tgg ctg aac acc cat ttt 720Cys Glu Ile Leu Lys Lys Tyr His Pro Val Trp Leu Asn Thr His Phe225 230 235 240aac aca agc atc gaa atg aca gaa gaa tcc gtt gag gca tgt gaa aag 768Asn Thr Ser Ile Glu Met Thr Glu Glu Ser Val Glu Ala Cys Glu Lys245 250 255ctg gtg aac gcg gga gtg ccg gtc gga aat cag gct gtc gta tta gca 816Leu Val Asn Ala Gly Val Pro Val Gly Asn Gln Ala Val Val Leu Ala260 265 270ggt att aat gat tcg gtt cca att atg aaa aag ctc atg cat gac ttg 864Gly Ile Asn Asp Ser Val Pro Ile Met Lys Lys Leu Met His Asp Leu275 280 285gta aaa atc aga gtc cgt cct tat tat att tac caa tgt gat ctg tca 912Val Lys Ile Arg Val Arg Pro Tyr Tyr Ile Tyr Gln Cys Asp Leu Ser290 295 300gaa gga ata ggg cat ttc aga gct cct gtt tcc aaa ggt ttg gag atc 960Glu Gly Ile Gly His Phe Arg Ala Pro Val Ser Lys Gly Leu Glu Ile305 310 315 320att gaa ggg ctg aga ggt cat acc tca ggc tat gcg gtt cct acc ttt 1008Ile Glu Gly Leu Arg Gly His Thr Ser Gly Tyr Ala Val Pro Thr Phe325 330 335gtc gtt cac gca cca ggc gga gga ggt aaa atc gcc ctg cag ccg aac 1056Val Val His Ala Pro Gly Gly Gly Gly Lys Ile Ala Leu Gln Pro Asn340 345 350tat gtc ctg tca caa agt cct gac aaa gtg atc tta aga aat ttt gaa 1104
Tyr Val Leu Ser Gln Ser Pro Asp Lys Val Ile Leu Arg Asn Phe Glu355 360 365ggt gtg att acg tca tat ccg gaa cca gag aat tat atc ccc aat cag 1152Gly Val Ile Thr Ser Tyr Pro Glu Pro Glu Asn Tyr Ile Pro Asn Gln370 375 380gca gac gcc tat ttt gag tcc gtt ttc cct gaa acc gct gac aaa aag 1200Ala Asp Ala Tyr Phe Glu Ser Val Phe Pro Glu Thr Ala Asp Lys Lys385 390 395 400gag ccg atc ggg ctg agt gcc att ttt gct gac aaa gaa gtt tcg ttt 1248Glu Pro Ile Gly Leu Ser Ala Ile Phe Ala Asp Lys Glu Val Ser Phe405 410 415aca cct gaa aat gta gac aga atc aaa agg aga gag gca tac atc gca 1296Thr Pro Glu Asn Val Asp Arg Ile Lys Arg Arg Glu Ala Tyr Ile Ala420 425 430aat ccg gag cat gaa aca tta aaa gat cgg cgt gag aaa aga gat cag 1344Asn Pro Glu His Glu Thr Leu Lys Asp Arg Arg Glu Lys Arg Asp Gln435 440 445ctc aaa gaa aag aaa ttt ttg gcg cag cag aaa aaa cag aaa gag act 1392Leu Lys Glu Lys Lys Phe Leu Ala Gln Gln Lys Lys Gln Lys Glu Thr450 455 460gaa tgc gga ggg gat tct tca tga 1416Glu Cys Gly Gly Asp Ser Ser465 470<210>21<211>471<212>PRT<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)<400>21Met Lys Asn Lys Trp Tyr Lys Pro Lys Arg His Trp Lys Glu Ile Glu1 5 10 15Leu Trp Lys Asp Val Pro Glu Glu Lys Trp Asn Asp Trp Leu Trp Gln20 25 30Leu Thr His Thr Val Arg Thr Leu Asp Asp Leu Lys Lys Val Ile Asn35 40 45
Leu Thr Glu Asp Glu Glu Glu Gly Val Arg Ile Ser Thr Lys Thr Ile50 55 60Pro Leu Asn Ile Thr Pro Tyr Tyr Ala Ser Leu Met Asp Pro Asp Asn65 70 75 80Pro Arg Cys Pro Val Arg Met Gln Ser Val Pro Leu Ser Glu Glu Met85 90 95His Lys Thr Lys Tyr Asp Met Glu Asp Pro Leu His Glu Asp Glu Asp100 105 110Ser Pro Val Pro Gly Leu Thr His Arg Tyr Pro Asp Arg Val Leu Phe115 120 125Leu Val Thr Ash Gln Cys Ser Val Tyr Cys Arg Tyr Cys Thr Arg Arg130 135 140Arg Phe Ser Gly Gln Ile Gly Met Gly Val Pro Lys Lys Gln Leu Asp145 150 155 160Ala Ala Ile Ala Tyr Ile Arg Glu Thr Pro Glu Ile Arg Asp Cys Leu165 170 175Ile Ser Gly Gly Asp Gly Leu Leu Ile Asn Asp Gln Ile Leu Glu Tyr180 185 190Ile Leu Lys Glu Leu Arg Ser Ile Pro His Leu Glu Val Ile Arg Ile195 200 205Gly Thr Arg Ala Pro Val Val Phe Pro Gln Arg Ile Thr Asp His Leu210 215 220Cys Glu Ile Leu Lys Lys Tyr His Pro Val Trp Leu Asn Thr His Phe225 230 235 240Asn Thr Ser Ile Glu Met Thr Glu Glu Ser Val Glu Ala Cys Glu Lys245 250 255
Leu Val Asn Ala Gly Val Pro Val Gly Asn Gln Ala Val Val Leu Ala260 265 270Gly Ile Asn Asp Ser Val Pro Ile Met Lys Lys Leu Met His Asp Leu275 280 285Val Lys Ile Arg Val Arg Pro Tyr Tyr Ile Tyr Gln Cys Asp Leu Ser290 295 300Glu Gly Ile Gly His Phe Arg Ala Pro Val Ser Lys Gly Leu Glu Ile305 310 315 320Ile Glu Gly Leu Arg Gly His Thr Ser Gly Tyr Ala Val Pro Thr Phe325 330 335Val Val His Ala Pro Gly Gly Gly Gly Lys Ile Ala Leu Gln Pro Ash340 345 350Tyr Val Leu Ser Gln Ser Pro Asp Lys Val Ile Leu Arg Asn Phe Glu355 360 365Gly Val Ile Thr Ser Tyr Pro Glu Pro Glu Asn Tyr Ile Pro Asn Gln370 375 380Ala Asp Ala Tyr Phe Glu Ser Val Phe Pro Glu Thr Ala Asp Lys Lys385 390 395 400Glu Pro Ile Gly Leu Ser Ala Ile Phe Ala Asp Lys Glu Val Ser Phe405 410 415Thr Pro Glu Asn Val Asp Arg Ile Lys Arg Arg Glu Ala Tyr Ile Ala420 425 430Asn Pro Glu His Glu Thr Leu Lys Asp Arg Arg Glu Lys Arg Asp Gln435 440 445Leu Lys Glu Lys Lys Phe Leu Ala Gln Gln Lys Lys Gln Lys Glu Thr450 455 460
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Gln Arg Gly Pro Gln Glu Ser Ser Phe Lys Glu Arg Lys His Pro Gly130 135 140gaa tga 438Glu145<210>23<211>145<212>PRT<213>丙酸梭菌(Clostridium propionicum)<400>23Met Val Gly Lys Lys Val Val His His Leu Met Met Ser Ala Lys Asp1 5 10 15Ala His Tyr Thr Gly Asn Leu Val Asn Gly Ala Arg Ile Val Asn Gln20 25 30Trp Gly Asp Val Gly Thr Glu Leu Met Val Tyr Val Asp GIy Asp Ile35 40 45Ser Leu Phe Leu Gly Tyr Lys Asp Ile Glu Phe Thr Ala Pro Val Tyr50 55 60Val Gly Asp Phe Met Glu Tyr His Gly Trp Ile Glu Lys Val Gly Asn65 70 75 80Gln Ser Tyr Thr Cys Lys Phe Glu Ala Trp Lys Val Ala Thr Met Val85 90 95Asp Ile Thr Asn Pro Gln Asp Thr Arg Ala Thr Ala Cys Glu Pro Pro100 105 110Val Leu Cys Gly Arg Ala Thr Gly Ser Leu Phe Ile Ala Lys Lys Asp115 120 125Gln Arg Gly Pro Gln Glu Ser Ser Phe Lys Glu Arg Lys His Pro Gly130 135 140
Glu145<210>24<211>1554<212>DNA<213>埃氏巨球型菌(Megasphaera elsdenii)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1554)<223>
<400>24atg aga aaa gta gaa atc att aca gct gaa caa gca gct cag ctc gta 48Met Arg Lys Val Glu Ile Ile Thr Ala Glu Gln Ala Ala Gln Leu Val1 5 10 15aaa gac aac gac acg att acg tct atc ggc ttt gtc agc agc gcc cat 96Lys Asp Asn Asp Thr Ile Thr Ser Ile Gly Phe Val Ser Ser Ala His20 25 30ccg gaa gca ctg acc aaa gct ttg gaa aaa cgg ttc ctg gac acg aac 144Pro Glu Ala Leu Thr Lys Ala Leu Glu Lys Arg Phe Leu Asp Thr Asn35 40 45acc ccg cag aac ttg acc tac atc tat gca ggc tct cag ggc aaa cgc 192Thr Pro Gln Asn Leu Thr Tyr Ile Tyr Ala Gly Ser Gln Gly Lys Arg50 55 60gat ggc cgt gcc gct gaa cat ctg gca cac aca ggc ctt ttg aaa cgc 240Asp Gly Arg Ala Ala Glu His Leu Ala His Thr Gly Leu Leu Lys Arg65 70 75 80gcc atc atc ggt cac tgg cag act gta ccg gct atc ggt aaa ctg gct 288Ala Ile Ile Gly His Trp Gln Thr Val Pro Ala Ile Gly Lys Leu Ala85 90 95gtc gaa aac aag att gaa gct tac aac ttc tcg cag ggc acg ttg gtc 336Val Glu Ash Lys Ile Glu Ala Tyr Asn Phe Ser Gln Gly Thr Leu Val100 105 110cac tgg ttc cgc gcc ttg gca ggt cat aag ctc ggc gtc ttc acc gac 384His Trp Phe Arg Ala Leu Ala Gly His Lys Leu Gly Val Phe Thr Asp115 120 125atc ggt ctg gaa act ttc ctc gat ccc cgt cag ctc ggc ggc aag ctc 432Ile Gly Leu Glu Thr Phe Leu Asp Pro Arg Gln Leu Gly Gly Lys Leu130 135 140
aat gac gta acc aaa gaa gac ctc gtc aaa ctg atc gaa gtc gat ggt 480Asn Asp Val Thr Lys Glu Asp Leu Val Lys Leu Ile Glu Val Asp Gly145 150 155 160cat gaa cag ctt ttc tac ccg acc ttc ccg gtc aac gta gct ttc ctc 528His Glu Gln Leu Phe Tyr Pro Thr Phe Pro Val Asn Val Ala Phe Leu165 170 175cgc ggt acg tat gct gat gaa tcc ggc aat atc acc atg gac gaa gaa 576Arg Gly Thr Tyr Ala Asp Glu Ser Gly Asn Ile Thr Met Asp Glu Glu180 185 190atc ggg cct ttc gaa agc act tcc gta gcc cag gcc gtt cac aac tgt 624Ile Gly Pro Phe Glu Ser Thr Ser Val Ala Gln Ala Val His Asn Cys195 200 205ggc ggt aaa gtc gtc gtc cag gtc aaa gac gtc gtc gct cac ggc agc 672Gly Gly Lys Val Val Val Gln Val Lys Asp Val Val Ala His Gly Ser210 215 220ctc gac ccg cgc atg gtc aag atc cct ggc atc tat gtc gac tac gtc 720Leu Asp Pro Arg Met Val Lys Ile Pro Gly Ile Tyr Val Asp Tyr Val225 230 235 240gtc gta gca gct ccg gaa gac cat cag cag acg tat gac tgc gaa tac 768Val Val Ala Ala Pro Glu Asp His Gln Gln Thr Tyr Asp Cys Glu Tyr245 250 255gat ccg tcc ctc agc ggt gaa cat cgt gct cct gaa ggc gct acc gat 816Asp Pro Ser Leu Ser Gly Glu His Arg Ala Pro Glu Gly Ala Thr Asp260 265 270gca gct ctc ccc atg agc gct aag aaa atc atc ggc cgc cgc ggc gct 864Ala Ala Leu Pro Met Ser Ala Lys Lys Ile Ile Gly Arg Arg Gly Ala275 280 285ttg gaa ttg act gaa aac gct gtc gtc aac ctc ggc gtc ggt gct ccg 912Leu Glu Leu Thr Glu Asn Ala Val Val Asn Leu Gly Val Gly Ala Pro290 295 300gaa tac gtt gct tct gtt gcc ggt gaa gaa ggt atc gcc gat acc att 960Glu Tyr Val Ala Ser Val Ala Gly Glu Glu Gly Ile Ala Asp Thr Ile305 310 315 320acc ctg acc gtc gaa ggt ggc gcc atc ggt ggc gta ccg cag ggc ggt 1008Thr Leu Thr Val Glu Gly Gly Ala Ile Gly Gly Val Pro Gln Gly Gly325 330 335gcc cgc ttc ggt tcg tcc cgc aat gcc gat gcc atc atc gac cac acc 1056Ala Arg Phe Gly Ser Ser Arg Asn Ala Asp Ala Ile Ile Asp His Thr
340 345 350tat cag ttc gac ttc tac gat ggc ggc ggt ctg gac atc gct tac ctc 1104Tyr Gln Phe Asp Phe Tyr Asp Gly Gly Gly Leu Asp Ile Ala Tyr Leu355 360 365ggc ctg gcc cag tgc gat ggc tcg ggc aac atc aac gtc agc aag ttc 1152Gly Leu Ala Gln Cys Asp Gly Ser Gly Asn Ile Asn Val Ser Lys Phe370 375 380ggt act aac gtt gcc ggc tgc ggc ggt ttc ccc aac att tcc cag cag 1200Gly Thr Asn Val Ala Gly Cys Gly Gly Phe Pro Asn Ile Ser Gln Gln385 390 395 400aca ccg aat gtt tac ttc tgc ggc acc ttc acg gct ggc ggc ttg aaa 1248Thr Pro Asn Val Tyr Phe Cys Gly Thr Phe Thr Ala Gly Gly Leu Lys405 410 415atc gct gtc gaa gac ggc aaa gtc aag atc ctc cag gaa ggc aaa gcc 1296Ile Ala Val Glu Asp Gly Lys Val Lys Ile Leu Gln Glu Gly Lys Ala420 425 430aag aag ttc atc aaa gct gtc gac cag atc act ttc aac ggt tcc tat 1344Lys Lys Phe Ile Lys Ala Val Asp Gln Ile Thr Phe Asn Gly Ser Tyr435 440 445gca gcc cgc aac ggc aaa cac gtt ctc tac atc aca gaa cgc tgc gta 1392Ala Ala Arg Asn Gly Lys His Val Leu Tyr Ile Thr Glu Arg Cys Val450 455 460ttt gaa ctg acc aaa gaa ggc ttg aaa ctc atc gaa gtc gca ccg ggc 1440Phe Glu Leu Thr Lys Glu Gly Leu Lys Leu Ile Glu Val Ala Pro Gly465 470 475 480atc gat att gaa aaa gat atc ctc gct cac atg gac ttc aag ccg atc 1488Ile Asp Ile Glu Lys Asp Ile Leu Ala His Met Asp Phe Lys Pro lle485 490 495att gat aat ccg aaa ctc atg gat gcc cgc ctc ttc cag gac ggt ccc 1536Ile Asp Asn Pro Lys Leu Met Asp Ala Arg Leu Phe Gln Asp Gly Pro500 505 510atg gga ctg aaa aaa taa 1554Met Gly Leu Lys Lys515<210>25<211>517<212>PRT<213>埃氏巨球型菌(Megasphaera elsdenii)
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Thr Pro Asn Val Tyr Phe Cys Gly Thr Phe Thr Ala Gly Gly Leu Lys405 410 415Ile Ala Val Glu Asp Gly Lys Val Lys Ile Leu Gln Glu Gly Lys Ala420 425 430Lys Lys Phe Ile Lys Ala Val Asp Gln Ile Thr Phe Asn Gly Ser Tyr435 440 445Ala Ala Arg Asn Gly Lys His Val Leu Tyr Ile Thr Glu Arg Cys Val450 455 460Phe Glu Leu Thr Lys Glu Gly Leu Lys Leu Ile Glu Val Ala Pro Gly465 470 475 480Ile Asp Ile Glu Lys Asp Ile Leu Ala His Met Asp Phe Lys Pro Ile485 490 495Ile Asp Asn Pro Lys Leu Met Asp Ala Arg Leu Phe Gln Asp Gly Pro500 505 510Met Gly Leu Lys Lys515<210>26<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>PCR引物<400>27aagcggttct cgccctcgta aacctga 27<210>28<211>416<212>PRT<213>牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)<400>28Met Ala Glu Ser Arg Arg Lys Tyr Tyr Phe Pro Asp Val Thr Asp Glu1 5 10 15Gln Trp Asn Asp Trp His Trp Gln Val Leu Asn Arg Ile Glu Thr Leu20 25 30Asp Gln Leu Lys Lys Tyr Val Thr Leu Thr Ala Glu Glu Glu Glu Gly35 40 45Val Lys Glu Ser Leu Lys Val Leu Arg Met Ala Ile Thr Pro Tyr Tyr50 55 60Leu Ser Leu Ile Asp Pro Glu Asn Pro Asn Cys Pro Ile Arg Lys Gln65 70 75 80Ala Ile Pro Thr His Gln Glu Leu Val Arg Ala Pro Glu Asp Gln Val85 90 95Asp Pro Leu Ser Glu Asp Glu Asp Ser Pro Val Pro Gly Leu Thr His100 105 110Arg Tyr Pro Asp Arg Val Leu Phe Leu Ile Thr Asp Lys Cys Ser Met115 120 125Tyr Cys Arg His Cys Thr Arg Arg Arg Phe Ala Gly Gln Lys Asp Ala130 135 140Ser Ser Pro Ser Glu Arg Ile Asp Arg Cys Ile Asp Tyr Ile Ala Asn145 150 155 160
Thr Pro Thr Val Arg Asp Val Leu Leu Ser Gly Gly Asp Ala Leu Leu165 170 175Val Ser Asp Glu Arg Leu Glu Tyr Ile Leu Lys Arg Leu Arg Glu Ile180 185 190Pro His Val Glu Ile Val Arg Ile Gly Ser Arg Thr Pro Val Val Leu195 200 205Pro Gln Arg Ile Thr Pro Gln Leu Val Asp Met Leu Lys Lys Tyr His210 215 220Pro Val Trp Leu Asn Thr His Phe Asn His Pro Asn Glu Val Thr Glu225 230 235 240Glu Ala Val Glu Ala Cys Glu Arg Met Ala Asn Ala Gly Ile Pro Leu245 250 255Gly Asn Gln Thr Val Leu Leu Arg Gly Ile Asn Asp Cys Thr His Val260 265 270Met Lys Arg Leu Val His Leu Leu Val Lys Met Arg Val Arg Pro Tyr275 280 285Tyr Ile Tyr Val Cys Asp Leu Ser Leu Gly Ile Gly His Phe Arg Thr290 295 300Pro Val Ser Lys Gly Ile Glu Ile Ile Glu Asn Leu Arg Gly His Thr305 310 315 320Ser Gly Tyr Ala Val Pro Thr Phe Val Val Asp Ala Pro Gly Gly Gly325 330 335Gly Lys Ile Pro Val Met Pro Asn Tyr Val Val Ser Gln Ser Pro Arg340 345 350His Val Val Leu Arg Asn Tyr Glu Gly Val Ile Thr Thr Tyr Thr Glu
355 360 365Pro Glu Asn Tyr His Glu Glu Cys Asp Cys Glu Asp Cys Arg Ala Gly370 375 380Lys His Lys Glu Gly Val Ala Ala Leu Ser Gly Gly Gln Gln Leu Ala385 390 395 400Ile Glu Pro Ser Asp Leu Ala Arg Lys Lys Arg Lys Phe Asp Lys Asn405 410 415<210>29<211>1251<212>DNA<213>牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1251)<223>
<400>29atg gca gaa agt cgt aga aag tat tat ttc cct gat gtc acc gat gag 48Met Ala Glu Ser Arg Arg Lys Tyr Tyr Phe Pro Asp Val Thr Asp Glu1 5 10 15caa tgg tac gac tgg cat tgg cag gtc ctc aat cga att gag acg ctc 96Gln Trp Tyr Asp Trp His Trp Gln Val Leu Asn Arg Ile Glu Thr Leu20 25 30gac cag ctg aaa aag tac gtt aca ctc acc gct gaa gaa gaa gag gga 144Asp Gln Leu Lys Lys Tyr Val Thr Leu Thr Ala Glu Glu Glu Glu Gly35 40 45gta aaa gaa tcg ccc aaa gta ctc cga atg gct atc aca cct tat tat 192Val Lys Glu Ser Pro Lys Val Leu Arg Met Ala Ile Thr Pro Tyr Tyr50 55 60ttg agt ttg ata gac ccc gag aat cct aat tgt ccg att cgt aaa caa 240Leu Ser Leu lle Asp Pro Glu Asn Pro Asn Cys Pro Ile Arg Lys Gln65 70 75 80gcc att cct act caa cag gaa ctg gta cgt gct cct gaa gat cag gta 288Ala Ile Pro Thr Gln Gln Glu Leu Val Arg Ala Pro Glu Asp Gln Val85 90 95
gac cca ctt agt gaa gat gaa gat tcg ccc gta ccc gga ctg act cat 336Asp Pro Leu Ser Glu Asp Glu Asp Ser Pro Val Pro Gly Leu Thr His100 105 110cgt tat ccg gat cgt gta ttg ttc ctt atc acg gac aaa tgt tcg atg 384Arg Tyr Pro Asp Arg Val Leu Phe Leu Ile Thr Asp Lys Cys Ser Met115 120 125tac tgt cgt cat tgt act cgc cgt cgc ttc gca gga cag aaa gat gct 432Tyr Cys Arg His Cys Thr Arg Arg Arg Phe Ala Gly Gln Lys Asp Ala130 135 140tct tct cct tct gag cgc atc gat cga tgc att gac tat ata gcc aat 480Ser Ser Pro Ser Glu Arg Ile Asp Arg Cys Ile Asp Tyr Ile Ala Asn145 150 155 160aca ccg aca gtc cgc gat gtt ttg cta tcg gga ggc gat gcc ctc ctt 528Thr Pro Thr Val Arg Asp Val Leu Leu Ser Gly Gly Asp Ala Leu Leu165 170 175gtc agc gac gaa cgc ttg gaa tac ata ttg aag cgt ctg cgc gaa ata 576Val Ser Asp Glu Arg Leu Glu Tyr Ile Leu Lys Arg Leu Arg Glu Ile180 185 190cct cat gtg gag att gtt cgt ata gga agc cgt acg ccg gta gtc ctc 624Pro His Val Glu Ile Val Arg Ile Gly Ser Arg Thr Pro Val Val Leu195 200 205cct cag cgt ata acg cct caa ttg gtg gat atg ctc aaa aaa tat cat 672Pro Gln Arg Ile Thr Pro Gln Leu Val Asp Met Leu Lys Lys Tyr His210 215 220ccg gtg tgg ctg aac act cac ttc aac cac ccg aat gaa gtt acc gaa 720Pro Val Trp Leu Asn Thr His Phe Asn His Pro Asn Glu Val Thr Glu225 230 235 240gaa gca gta gag gct tgt gaa aga atg gcc aat gcc ggt att ccg ttg 768Glu Ala Val Glu Ala Cys Glu Arg Met Ala Asn Ala Gly Ile Pro Leu245 250 255ggt aac caa acg gtt tta ttg cgt gga atc aat gat tgt aca cat gtg 816Gly Asn Gln Thr Val Leu Leu Arg Gly Ile Asn Asp Cys Thr His Val260 265 270atg aag aga ttg gta cat ttg ctg gta aag atg cgt gtg cgt cct tac 864Met Lys Arg Leu Val His Leu Leu Val Lys Met Arg Val Arg Pro Tyr275 280 285tat ata tat gta tgc gat ctt tcg ctt gga ata ggt cat ttc cgc acg 912Tyr Ile Tyr Val Cys Asp Leu Ser Leu Gly Ile Gly His Phe Arg Thr290 295 300
ccg gta tct aaa gga atc gaa att atc gaa aat ttg cgc gga cac acc 960Pro Val Ser Lys Gly Ile Glu Ile Ile Glu Asn Leu Arg Gly His Thr305 310 315 320tcg ggc tat gca gtt cct acc ttt gtg gta ggt gct ccg ggg ggt ggt 1008Ser Gly Tyr Ala Val Pro Thr Phe Val Val Gly Ala Pro Gly Gly Gly325 330 335ggt aag ata cct gta acg ccg aac tat gtt gta tct cag tcc cca cga 1056Gly Lys Ile Pro Val Thr Pro Asn Tyr Val Val Ser Gln Ser Pro Arg340 345 350cat gtg gtt ctt cgc aat tat gaa ggt gtt atc aca acc tat acg gag 1104His Val Val Leu Arg Asn Tyr Glu Gly Val Ile Thr Thr Tyr Thr Glu355 360 365ccg gag aat tat cat gag gag tgc gat tgt gag gac tgt cga gcc ggt 1152Pro Glu Asn Tyr His Glu Glu Cys Asp Cys Glu Asp Cys Arg Ala Gly370 375 380aag cat aaa gag ggt gta gct gca ctt tcc gga ggt cag cag ttg gct 1200Lys His Lys Glu Gly Val Ala Ala Leu Ser Gly Gly Gln Gln Leu Ala385 390 395 400atc gag cct tcc gac tta gct cgc aaa aaa cgc aag ttt gat aag aac 1248Ile Glu Pro Ser Asp Leu Ala Arg Lys Lys Arg Lys Phe Asp Lys Ash405 410 415tga 1251<210>30<211>416<212>PRT<213>牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)<400>30Met Ala Glu Ser Arg Arg Lys Tyr Tyr Phe Pro Asp Val Thr Asp Glu1 5 10 15Gln Trp Tyr Asp Trp His Trp Gln Val Leu Asn Arg Ile Glu Thr Leu20 25 30Asp Gln Leu Lys Lys Tyr Val Thr Leu Thr Ala Glu Glu Glu Glu Gly35 40 45
Val Lys Glu Ser Pro Lys Val Leu Arg Met Ala Ile Thr Pro Tyr Tyr50 55 60Leu Ser Leu Ile Asp Pro Glu Asn Pro Asn Cys Pro Ile Arg Lys Gln65 70 75 80Ala Ile Pro Thr Gln Gln Glu Leu Val Arg Ala Pro Glu Asp Gln Val85 90 95Asp Pro Leu Ser Glu Asp Glu Asp Ser Pro Val Pro Gly Leu Thr His100 105 110Arg Tyr Pro Asp Arg Val Leu Phe Leu Ile Thr Asp Lys Cys Ser Met115 120 125Tyr Cys Arg His Cys Thr Arg Arg Arg Phe Ala Gly Gln Lys Asp Ala130 135 140Ser Ser Pro Ser Glu Arg Ile Asp Arg Cys Ile Asp Tyr Ile Ala Asn145 150 155 160Thr Pro Thr Val Arg Asp Val Leu Leu Ser Gly Gly Asp Ala Leu Leu165 170 175Val Ser Asp Glu Arg Leu Glu Tyr Ile Leu Lys Arg Leu Arg Glu Ile180 185 190Pro His Val Glu Ile Val Arg Ile Gly Ser Arg Thr Pro Val Val Leu195 200 205Pro Gln Arg Ile Thr Pro Gln Leu Val Asp Met Leu Lys Lys Tyr His210 215 220Pro Val Trp Leu Asn Thr His Phe Asn His Pro Asn Glu Val Thr Glu225 230 235 240Glu Ala Val Glu Ala Cys Glu Arg Met Ala Asn Ala Gly Ile Pro Leu245 250 255
Gly Asn Gln Thr Val Leu Leu Arg Gly Ile Asn Asp Cys Thr His Val260 265 270Met Lys Arg Leu Val His Leu Leu Val Lys Met Arg Val Arg Pro Tyr275 280 285Tyr Ile Tyr Val Cys Asp Leu Ser Leu Gly Ile Gly His Phe Arg Thr290 295 300Pro Val Ser Lys Gly Ile Glu Ile Ile Glu Asn Leu Arg Gly His Thr305 310 315 320Ser Gly Tyr Ala Val Pro Thr Phe Val Val Gly Ala Pro Gly Gly Gly325 330 335Gly Lys Ile Pro Val Thr Pro Asn Tyr Val Val Ser Gln Ser Pro Arg340 345 350His Val Val Leu Arg Asn Tyr Glu Gly Val Ile Thr Thr Tyr Thr Glu355 360 365Pro Glu Asn Tyr His Glu Glu Cys Asp Cys Glu Asp Cys Arg Ala Gly370 375 380Lys His Lys Glu Gly Val Ala Ala Leu Ser Gly Gly Gln Gln Leu Ala385 390 395 400Ile Glu Pro Ser Asp Leu Ala Arg Lys Lys Arg Lys Phe Asp Lys Asn405 410 415<210>31<211>471<212>PRT<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)<400>31Met Lys Asn Lys Trp Tyr Lys Pro Lys Arg His Trp Lys Glu Ile Glu1 5 10 15
Leu Trp Lys Asp Val Pro Glu Glu Lys Trp Asn Asp Trp Leu Trp Gln20 25 30Leu Thr His Thr Val Arg Thr Leu Asp Asp Leu Lys Lys Val Ile Asn35 40 45Leu Thr Glu Asp Glu Glu Glu Gly Val Arg Ile Ser Thr Lys Thr Ile50 55 60Pro Leu Asn Ile Thr Pro Tyr Tyr Ala Ser Leu Met Asp Pro Asp Asn65 70 75 80Pro Arg Cys Pro Val Arg Met Gln Ser Val Pro Leu Ser Glu Glu Met85 90 95His Lys Thr Lys Tyr Asp Leu Glu Asp Pro Leu His Glu Asp Glu Asp100 105 110Ser Pro Val Pro Gly Leu Thr His Arg Tyr Pro Asp Arg Val Leu Phe115 120 125Leu Val Thr Asn Gln Cys Ser Met Tyr Cys Arg Tyr Cys Thr Arg Arg130 135 140Arg Phe Ser Gly Gln Ile Gly Met Gly Val Pro Lys Lys Gln Leu Asp145 150 155 160Ala Ala Ile Ala Tyr Ile Arg Glu Thr Pro Glu Ile Arg Asp Cys Leu165 170 175Ile Ser Gly Gly Asp Gly Leu Leu Ile Asn Asp Gln Ile Leu Glu Tyr180 185 190Ile Leu Lys Glu Leu Arg Ser Ile Pro His Leu Glu Val Ile Arg Ile195 200 205Gly Thr Arg Ala Pro Val Val Phe Pro Gln Arg Ile Thr Asp His Leu210 215 220
Cys Glu Ile Leu Lys Lys Tyr His Pro Val Trp Leu Asn Thr His Phe225 230 235 240Asn Thr Ser Ile Glu Met Thr Glu Glu Ser Val Glu Ala Cys Glu Lys245 250 255Leu Val Asn Ala Gly Val Pro Val Gly Asn Gln Ala Val Val Leu Ala260 265 270Gly Ile Asn Asp Ser Val Pro Ile Met Lys Lys Leu Met His Asp Leu275 280 285Val Lys Ile Arg Val Arg Pro Tyr Tyr Ile Tyr Gln Cys Asp Leu Ser290 295 300Glu Gly Ile Gly His Phe Arg Ala Pro Val Ser Lys Gly Leu Glu Ile305 310 315 320Ile Glu Gly Leu Arg Gly His Thr Ser Gly Tyr Ala Val Pro Thr Phe325 330 335Val Val Asp Ala Pro Gly Gly Gly Gly Lys Ile Ala Leu Gln Pro Asn340 345 350Tyr Val Leu Ser Gln Ser Pro Asp Lys Val Ile Leu Arg Asn Phe Glu355 360 365Gly Val Ile Thr Ser Tyr Pro Glu Pro Glu Asn Tyr Ile Pro Asn Gln370 375 380Ala Asp Ala Tyr Phe Glu Ser Val Phe Pro Glu Thr Ala Asp Lys Lys385 390 395 400Glu Pro Ile Gly Leu Ser Ala Ile Phe Ala Asp Lys Glu Val Ser Phe405 410 415Thr Pro Glu Asn Val Asp Arg Ile Lys Arg Arg Glu Ala Tyr Ile Ala
420 425 430Asn Pro Glu His Glu Thr Leu Lys Asp Arg Arg Glu Lys Arg Asp Gln435 440 445Leu Lys Glu Lys Lys Phe Leu Ala Gln Gln Lys Lys Gln Lys Glu Thr450 455 460Glu Cys Gly Gly Asp Ser Ser465 470<210>32<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>CDS<222>(408)..(1304)<223>
<400>33cattacacag gctctgcagc agtggcaggg cagtgccgac ccctggttgt cccgtgccgc 60gcaaaccttc gccaaaggtg cgcctggttc ggctcgtttg tcctttgagc tgctggagag120ggtgcatcac ctgtctttgg ccgatgtttt ccgtctggaa tacattgtgt cgctgcaatg180tggcgtacag ggcgacttcc aggaaggcat acgggcactg ctgattgata aagacaaaca240gccgcgctgg aatcctgcct cgctggaaca ggcggatgca cgctgggtgg aacgtttttt300tgttcctgcc tggccggcag aaacgactca tcccttggct gacctgtaac ccaggcagac360
cgctgcggcg ccagacggcg ccgctttcat aatgacgagg agacaaa atg agt aac 416Met Ser Asn1acg att gca ttt atc ggg ctg ggc cat atg ggt aaa ccc atg gcg ctg 464Thr Ile Ala Phe Ile Gly Leu Gly His Met Gly Lys Pro Met Ala Leu5 l0 15aat ctg ctc aaa gcc ggt cat agc ctg aac gtc ttt gac ttg aat gcg 512Asn Leu Leu Lys Ala Gly His Ser Leu Asn Val Phe Asp Leu Asn Ala20 25 30 35caa gcc atg cag gaa ctg cag gca gca ggg gca cag gtg ggg gaa tcg 560Gln Ala Met Gln Glu Leu Gln Ala Ala Gly Ala Gln Val Gly Glu Ser40 45 50gcg gtg caa atc gcc caa gac gcg cag atg gtc ttt acc atg ctg cct 608Ala Val Gln Ile Ala Gln Asp Ala Gln Met Val Phe Thr Met Leu Pro55 60 65gct ggc cgc cat gtt cgt cag gtt tac gag ggc gag aac ggc ttg ctg 656Ala Gly Arg His Val Arg Gln Val Tyr Glu Gly Glu Asn Gly Leu Leu70 75 80cag act gtg gcc ccc ggt acg gtg ctg gtc gat tgc agc acc att gat 704Gln Thr Val Ala Pro Gly Thr Val Leu Val Asp Cys Ser Thr Ile Asp85 90 95gcg caa acc agc cag gat ctg gcg gcc aaa gcc agc aag ctg ggt ctg 752Ala Gln Thr Ser Gln Asp Leu Ala Ala Lys Ala Ser Lys Leu Gly Leu100 105 110 115ttc atg ctg gat gcg ccg gtc tcc ggt ggg acc ggt ggc gcc att gct 800Phe Met Leu Asp Ala Pro Val Ser Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ile Ala120 125 130ggc acc ttg acc ttt atg gtc ggg ggc gag gat cag gcc ctg gaa aag 848Gly Thr Leu Thr Phe Met Val Gly Gly Glu Asp Gln Ala Leu Glu Lys135 140 145gcg cgc cct tac ttg gat gcc atg ggc aag aac att ttc cac gcg ggt 896Ala Arg Pro Tyr Leu Asp Ala Met Gly Lys Asn Ile Phe His Ala Gly150 155 160aaa gcc ggt gcg ggt cag gtt gcc aag att tgc aac aat atg ctc ttg 944Lys Ala Gly Ala Gly Gln Val Ala Lys Ile Cys Asn Asn Met Leu Leu165 170 175ggg att ttg atg gcg ggt act gct gaa gcc ttg gct ttg ggc gtt gcc 992Gly Ile Leu Met Ala Gly Thr Ala Glu Ala Leu Ala Leu Gly Val Ala180 185 190 195
cac ggt ctg gac cct gcc gtg ctg tcg acc atc atg gcg cgc agt tcc 1040His Gly Leu Asp Pro Ala Val Leu Ser Thr Ile Met Ala Arg Ser Ser200 205 210ggt cga aac tgg gca acc gag ctg tac aac ccc tgg cct ggg gtg atg 1088Gly Arg Asn Trp Ala Thr Glu Leu Tyr Asn Pro Trp Pro Gly Val Met215 220 225ccg gat gta ccg gct tcg cgt gat tat cag ggc ggt ttt gcg acg ggc 1136Pro Asp Val Pro Ala Ser Arg Asp Tyr Gln Gly Gly Phe Ala Thr Gly230 235 240ctg atg ctc aaa gac ctg ggt ctg gca gcc gat gcg gct gtc agc cag 1184Leu Met Leu Lys Asp Leu Gly Leu Ala Ala Asp Ala Ala Val Ser Gln245 250 255aac agc gcg acg cct ttg ggc gaa ctg gca cgt aac ctg ttc gcc ttg 1232Asn Ser Ala Thr Pro Leu Gly Glu Leu Ala Arg Asn Leu Phe Ala Leu260 265 270 275cac gcc gca caa ggt cag aat gca ggg ctg gat ttc tcc agc att ctt 1280His Ala Ala Gln Gly Gln Asn Ala Gly Leu Asp Phe Ser Ser Ile Leu280 285 290aat ttg tac cgt cag aag cac taa gttctggcag tgcgtagggc aggggctgca1334Asn Leu Tyr Arg Gln Lys His295gttccagcgc ctgtccttgc tccaattgaa actggccttg ttccaggtcc gcc 1387<210>34<211>298<212>PRT<213>粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)<400>34Met Ser Asn Thr Ile Ala Phe Ile Gly Leu Gly His Met Gly Lys Pro1 5 10 15Met Ala Leu Asn Leu Leu Lys Ala Gly His Ser Leu Asn Val Phe Asp20 25 30Leu Asn Ala Gln Ala Met Gln Glu Leu Gln Ala Ala Gly Ala Gln Val35 40 45
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Val Ser Gln Asn Ser Ala Thr Pro Leu Gly Glu Leu Ala Arg Asn Leu260 265 270Phe Ala Leu His Ala Ala Gln Gly Gln Asn Ala Gly Leu Asp Phe Ser275 280 285Ser Ile Leu Asn Leu Tyr Arg Gln Lys His290 295<210>35<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
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<223>PCR引物
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<223>PCR引物<400>50gtccgtctcc ctttcagctt aaatcgctat tcttatagc39
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<221>CDS<222>(1)..(435)<223>
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50 55 60gtt ggt gat ttt atg gaa tac cac ggc tgg att gaa aaa gtt ggc aac 240Val Gly Asp Phe Met Glu Tyr His Gly Trp Ile Glu Lys Val Gly Asn65 70 75 80cag tcc tat aca tgt aaa ttt gaa gca tgg aaa gta gca aag atg gtt 288Gln Ser Tyr Thr Cys Lys Phe Glu Ala Trp Lys Val Ala Lys Met Val85 90 95gat atc aca aat cca cag gat aca cgt gca aca gct tgt gaa cct ccg 336Asp Ile Thr Asn Pro Gln Asp Thr Arg Ala Thr Ala Cys Glu Pro Pro100 105 110gta ctt tgt ggt act gca aca ggc agc ctt ttc atc gca aag gat aat 384Val Leu Cys Gly Thr Ala Thr Gly Ser Leu Phe Ile Ala Lys Asp Asn115 120 125cag aga ggt cct cag gaa tct tcc ttc aag gat gca aag cac cct caa 432Gln Arg Gly Pro Gln Glu Ser Ser Phe Lys Asp Ala Lys His Pro Gln130 135 140taa 435<210>54<211>144<212>PRT<213>丙酸梭菌(Clostridium propionicum)<400>54Met Val Gly Lys Lys Val Val His His Leu Met Met Ser Ala Lys Asp1 5 10 15Ala His Tyr Thr Gly Asn Leu Val Asn Gly Ala Arg Ile Val Asn Gln20 25 30Trp Gly Asp Val Gly Thr Glu Leu Met Val Tyr Val Asp Gly Asp Ile35 40 45Ser Leu Phe Leu Gly Tyr Lys Asp Ile Glu Phe Thr Ala Pro Val Tyr50 55 60Val Gly Asp Phe Met Glu Tyr His Gly Trp Ile Glu Lys Val Gly Asn65 70 75 80
Gln Ser Tyr Thr Cys Lys Phe Glu Ala Trp Lys Val Ala Lys Met Val85 90 95Asp Ile Thr Asn Pro Gln Asp Thr Arg Ala Thr Ala Cys Glu Pro Pro100 105 110Val Leu Cys Gly Thr Ala Thr Gly Ser Leu Phe Ile Ala Lys Asp Asn115 120 125Gln Arg Gly Pro Gln Glu Ser Ser Phe Lys Asp Ala Lys His Pro Gln130 135 140<210>55<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>PCR引物<400>66gactagatat ctcaggagta ctcatgggtg aa 3权利要求
1.一种含有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的细胞，其中所述细胞由α-丙氨酸产生β-丙氨酸。
2.根据权利要求1的细胞，其中所述细胞为转化的细胞。
3.根据权利要求2的细胞，所述细胞包含至少一种外源核酸分子，其中所述核酸分子包含编码丙氨酸2，3-氨基变位酶的核酸序列。
4.根据权利要求3的细胞，其中的外源核酸分子是突变的赖氨酸2，3-氨基变位酶。
5.根据权利要求3的细胞，其中的外源核酸分子是突变的亮氨酸2，3-氨基变位酶。
6.根据权利要求3的细胞，其中的外源核酸分子是突变的赖氨酸5，6-氨基变位酶。
7.根据权利要求3的细胞，其中编码丙氨酸2，3-氨基变位酶的核酸序列包含SEQ ID NO20中所示的核苷酸307-1017或SEQ ID NO29中所示的核苷酸55-1026。
8.根据权利要求7的细胞，其中包含SEQ ID NO20的核苷酸307-1017或SEQ ID NO29的核苷酸55-1026的核酸包括产生一或多个保守氨基酸取代的一或多个取代。
9.根据权利要求7的细胞，其中包含SEQ ID NO20的核苷酸307-1017或SEQ ID NO29的核苷酸55-1026的核酸包括产生不多于10个保守氨基酸取代的一或多个取代。
10.根据权利要求3的细胞，其中编码丙氨酸2，3-氨基变位酶的核酸序列包含与SEQ ID NO20或SEQ ID NO29具有至少90％同一性的序列。
11.根据权利要求10的细胞，其中编码丙氨酸2，3-氨基变位酶的核酸序列包含与SEQ ID NO20或SEQ ID NO29具有至少95％同一性的序列。
12.根据权利要求10的细胞，其中编码丙氨酸2，3-氨基变位酶的核酸序列包含SEQ ID NO20或SEQ ID NO29。
13.根据权利要求4的细胞，其中突变的赖氨酸2，3-氨基变位酶是突变的原核生物的赖氨酸2，3-氨基变位酶。
14.根据权利要求13的细胞，其中突变的原核生物的赖氨酸2，3-氨基变位酶是突变的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)、近端梭菌(Clostridium subterminale)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)或大肠杆菌(Escherichiacoli)赖氨酸2，3-氨基变位酶。
15.根据权利要求14的细胞，其中突变的赖氨酸2，3-氨基变位酶是突变的枯草芽孢杆菌赖氨酸2，3-氨基变位酶。
16.根据权利要求15的细胞，其中突变的枯草芽孢杆菌赖氨酸2，3-氨基变位酶包含L103M、L103K、L103R、L103E或L103S取代。
17.根据权利要求15的细胞，其中突变的枯草芽孢杆菌赖氨酸2，3-氨基变位酶包含L103M、M136V取代、D339H取代或其任意的组合。
18.根据权利要求15的细胞，其中突变的枯草芽孢杆菌赖氨酸2，3-氨基变位酶包含D339H、D339Q、D339T或D339N取代。
19.根据权利要求14的细胞，其中突变的赖氨酸2，3-氨基变位酶是突变的牙龈卟啉单胞菌赖氨酸2，3-氨基变位酶。
20.根据权利要求19的细胞，其中突变的牙龈卟啉单胞菌赖氨酸2，3-氨基变位酶包含N19Y取代、L53P取代、H85Q取代、D331G取代、M342T取代或其任意的组合。
21.根据权利要求6的细胞，其中突变的赖氨酸5，6-氨基变位酶是突变的斯氏梭菌(C.sticklandii)赖氨酸5，6-氨基变位酶。
22.根据权利要求1的细胞，其中细胞是原核的。
23.根据权利要求22的细胞，其中原核细胞是乳酸杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、芽孢杆菌(Bacillus)或埃希氏菌(Escherichia)细胞。
24.根据权利要求22的细胞，其中原核细胞是大肠杆菌或地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)细胞。
25.根据权利要求1的细胞，其中细胞是酵母细胞。
26.根据权利要求1的细胞，其中所述细胞产生3-羟丙酸(3-HP)。
27.根据权利要求26的细胞，其中细胞进一步含有CoA转移酶或CoA合成酶活性；β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性；和3HP-CoA脱水酶活性。
28.根据权利要求27的细胞，其中细胞进一步包含3-羟丙酰基-CoA水解酶，和/或3-羟异丁酰基-CoA水解酶活性。
29.根据权利要求26的细胞，其中细胞进一步包含4-氨基丁酸和/或β-丙氨酸-2-氧化戊二酸氨基转移酶活性；和3-HP脱氢酶活性或3-羟异丁酸脱氢酶活性。
30.根据权利要求1的细胞，其中细胞进一步包含CoA转移酶或CoA合成酶活性；β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性；3-羟丙酰基-CoA脱水酶活性；3-羟丙酰基-CoA水解酶，和/或3-羟异丁酰基-CoA水解酶活性；和脂肪酶和/或酯酶活性。
31.根据权利要求30的细胞，其中细胞产生3-HP的酯。
32.根据权利要求31的细胞，其中3-HP的酯是3-羟丙酸甲酯、3-羟丙酸乙酯、3-羟丙酸丙酯、3-羟丙酸丁酯或3-羟丙酸2-乙基己酯。
33.根据权利要求1的细胞，其中所述细胞进一步包含CoA转移酶活性；β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性；3-羟丙酰基-CoA脱水酶活性；和聚羟酸合酶活性。
34.根据权利要求33的细胞，其中所述细胞产生聚合的3-HP。
35.根据权利要求1的细胞，其中所述细胞进一步包含CoA转移酶活性；β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性；和聚羟酸合酶活性。
36.根据权利要求35的细胞，其中所述细胞产生聚合的丙烯酸。
37.根据权利要求1的细胞，其中所述细胞进一步包含CoA转移酶活性；β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性；和脂肪酶和/或酯酶活性。
38.根据权利要求37的细胞，其中所述细胞生产丙烯酸的酯。
39.根据权利要求38的细胞，其中丙烯酸的酯是丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯或丙烯酸丁酯。
40.根据权利要求1的细胞，其中所述细胞产生1，3-丙二醇。
41.根据权利要求40的细胞，其中所述细胞进一步包含CoA转移酶或CoA合成酶活性；β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性；3-羟丙酰基-CoA脱水酶活性；乙酰化醛NAD(+)氧化还原酶活性；和醇NAD(+)氧化还原酶活性。
42.根据权利要求40的细胞，其中所述细胞进一步包含CoA转移酶活性；β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性；3-羟丙酰基-CoA脱水酶活性；3-羟丙酰基-CoA水解酶，和/或3-羟异丁酰基-CoA水解酶活性；醛脱氢酶(NAD(P)+)活性；和醇脱氢酶活性。
43.根据权利要求1的细胞，其中所述细胞产生泛酸。
44.根据权利要求43的细胞，进一步包含α-酮泛酸羟甲基转移酶、α-酮泛酸还原酶和泛酸合酶活性。
45.根据权利要求43的细胞，其中所述细胞产生辅酶A(CoA)。
46.根据权利要求45的细胞，进一步包含泛酸激酶、4’-磷酸羟泛酰基-1-半胱氨酸合成酶、4’-磷酸泛酰半胱氨酸脱羧酶、ATP4’-磷酸泛酰巯基乙胺腺甘酰基转移酶和去磷酸基-CoA激酶活性。
47.一种包含丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的多肽。
48.根据权利要求47的多肽，其中所述多肽包含突变的赖氨酸2，3-氨基变位酶氨基酸序列。
49.根据权利要求48的多肽，其中突变的赖氨酸2，3-氨基变位酶的氨基酸序列是突变的枯草芽孢杆菌、耐放射异常球菌、近端梭菌、牙龈卟啉单胞菌或大肠杆菌赖氨酸2，3-氨基变位酶。
50.根据权利要求49的多肽，其中突变的赖氨酸2，3-氨基变位酶的氨基酸序列是突变的枯草芽孢杆菌或突变的牙龈卟啉单胞菌赖氨酸2，3-氨基变位酶。
51.根据权利要求47的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO21中所示的氨基酸50-390或SEQ ID NO30中所示的氨基酸15-390。
52.根据权利要求47的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO21或30具有至少90％序列同一性的序列。
53.根据权利要求52的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO21或30具有至少95％序列同一性的序列。
54.权利要求52的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO21或30。
55.权利要求52的多肽，其中所述多肽包含一或多个保守的氨基酸取代。
56.权利要求52的多肽，其中所述多肽包含不多于10个的保守氨基酸取代。
57.一种包含编码权利要求47多肽的核酸序列的分离核酸。
58.权利要求57的分离核酸，可操作地连接于启动子序列。
59.根据权利要求57的分离核酸，其中所述核酸包含SEQ IDNO20的核苷酸307-1017或SEQ ID NO29的核苷酸55-1026。
60.根据权利要求57的分离核酸，其中所述核酸包含与SEQ IDNO20或SEQ ID NO29具有至少90％同一性的序列。
61.根据权利要求57的分离核酸，其中所述核酸包含与SEQ IDNO20或SEQ ID NO29具有至少95％同一性的序列。
62.根据权利要求60的分离核酸，其中所述核酸序列包括导致一或多个保守的氨基酸取代的一或多个取代。
63.根据权利要求60的分离核酸，其中所述核酸序列包括导致不多于10个保守氨基酸取代的一或多个取代。
64.根据权利要求61的分离核酸，其中所述核酸包含SEQ IDNO20或29。
65.一种包含权利要求57德分离核酸的载体。
66.一种包含权利要求57德分离核酸的重组核酸。
67.一种用权利要求66的重组核酸转化的细胞。
68.一种包含权利要求57德重组核酸的非人转基因哺乳动物。
69.包含至少一种外源核酸分子的转化细胞，其中所述至少一种外源核酸分子包含编码权利要求47德多肽的核酸序列。
70.根据权利要求69的转化细胞，其中所述细胞由α-丙氨酸产生β-丙氨酸。
71.根据权利要求70的细胞，其中所述细胞生产3-HP。
72.根据权利要求71的细胞，其中所述细胞产生1，3-丙二醇。
73.根据权利要求70的细胞，其中所述细胞产生泛酸。
74.根据权利要求73的细胞，其中所述细胞产生CoA。
75.一种特异性结合权利要求47德多肽的特异性结合剂。
76.一种生产含由丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的多肽的方法，包括在使细胞产生含有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的多肽的条件下培养权利要求67的细胞。
77.一种由α-丙氨酸制备β-丙氨酸的方法，包括在使细胞由α-丙氨酸产生β-丙氨酸的条件下培养权利要求1的细胞。
78.根据权利要求77的方法，其中所述细胞包含至少一种编码丙氨酸2，3-氨基变位酶的外源核酸分子，其中所述丙氨酸2，3-氨基变位酶能够由α-丙氨酸产生β-丙氨酸。
79.根据权利要求78的方法，其中所述细胞是原核细胞。
80.根据权利要求78的方法，其中所述细胞是酵母、乳酸杆菌、乳球菌、芽孢杆菌或埃希氏菌细胞。
81.根据权利要求78的方法，其中所述细胞包含panD的功能性缺失。
82.一种鉴定含有丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的细胞的方法，包括在不含β-丙氨酸和泛酸的培养基中培养功能性缺失panD的细胞；和鉴定能够在培养基中生长的细胞，其中细胞的生长表明细胞由α-丙氨酸产生β-丙氨酸，这表明细胞包含丙氨酸2，3-氨基变位酶活性，且其中缺少细胞的生长则表明细胞未由α-丙氨酸产生β-丙氨酸，这表明细胞不包含丙氨酸2，3-氨基变位酶活性。
83.根据权利要求82的方法，进一步包括在培养细胞的步骤前用一种或多种突变的赖氨酸2，3-氨基变位酶转染细胞。
84.根据权利要求83的方法，其中一种或多种突变的原核生物的赖氨酸2，3-氨基变位酶是突变的枯草芽孢杆菌、耐放射异常球菌、近端梭菌、嗜热产液菌(Aquifex aeolicus)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenza)、大肠杆菌和/或牙龈卟啉单胞菌赖氨酸2，3-氨基变位酶。
85.根据权利要求83的方法，其中一种或多种突变的赖氨酸2，3-氨基变位酶是突变的枯草芽孢杆菌赖氨酸2，3-氨基变位酶。
86.根据权利要求83的方法，进一步包括在鉴定在培养基中生长的细胞之后，鉴定一种或多种赋予细胞丙氨酸2，3-氨基变位酶活性的突变赖氨酸2，3-氨基变位酶中的突变。
87.根据权利要求86的方法，对一种或多种突变赖氨酸2，3-氨基变位酶中的突变进行鉴定包括对一种或多种突变的赖氨酸2，3-氨基变位酶进行测序。
88.根据权利要求82的方法，其中细胞是原核细胞。
89.一种制备3-HP的方法，包括在细胞产生3-HP的条件下培养权利要求1的细胞。
90.根据权利要求89的方法，其中细胞包括至少一种编码丙氨酸2，3-氨基变位酶的外源核酸以使3-HP产生自β-丙氨酸，其中丙氨酸2，3-氨基变位酶由α-丙氨酸产生β-丙氨酸。
91.根据权利要求89的方法，其中细胞进一步包含CoA转移酶或CoA合成酶活性；β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性；3-HP-CoA脱水酶活性；和，3-羟丙酰基-CoA水解酶，和/或3-羟异丁酰基-CoA水解酶活性。
92.根据权利要求89的方法，其中细胞进一步包含4-氨基丁酸和/或β-丙氨酸-2-氧化戊二酸氨基转移酶活性；和3-HP脱氢酶活性和/或3-羟丁酸脱氢酶活性。
93.一种制备1，3-丙二醇的方法，包括在其中细胞产生1，3-丙二醇的条件下培养权利要求40的细胞。
94.一种制备泛酸的方法，包括在其中细胞产生泛酸的条件下培养权利要求43的细胞。
95.一种制备CoA的方法，包括在其中细胞产生CoA的条件下培养权利要求45的细胞。
96.一种制备3-HP的方法，包括从权利要求1的细胞纯化β-丙氨酸；将β-丙氨酸与包含CoA转移酶活性的多肽接触以形成β-丙氨酰基-CoA；将β-丙氨酰基-CoA与包含β-丙氨酰-CoA氨裂解酶活性的多肽接触以形成丙烯酰基-CoA；将丙烯酰基-CoA与包含3HP-CoA脱水酶活性的多肽接触以形成3-HP-CoA；和将3-HP-CoA与包含CoA转移酶活性、3-羟丙酰基-CoA水解酶，和/或3-羟异丁酰基-CoA水解酶活性的多肽接触以产生3-HP。
97.一种制备3-HP的方法，包括从权利要求1的细胞纯化β-丙氨酸；将β-丙氨酸与包含4-氨基丁酸氨基转移酶和/或β-丙氨酸-2-氧化戊二酸氨基转移酶活性的多肽接触以形成丙二酸半醛；和将丙二酸半醛与包含3-HP脱氢酶和/或3-羟异丁酸脱氢酶活性的多肽接触以产生3-HP。
98.一种制备3-HP的方法，包括用编码包含CoA转移酶活性的多肽的核酸，和编码包含β-丙氨酰基-CoA氨裂解酶活性的多肽的核酸，以及编码包含CoA转移酶活性、3-羟丙酰基-CoA水解酶，和/或3-羟异丁酰-CoA水解酶活性的多肽的核酸转染权利要求1的细胞；和培养转染的细胞以使转染细胞产生3-HP。
99.一种制备3-HP的方法，包括用编码包含4-氨基丁酸氨基转移酶和/或β-丙氨酸-2-氧化戊二酸氨基转移酶活性的多肽的核酸和编码包含3-HP脱氢酶和/或3-羟基异丁酸脱氢酶活性的多肽的核酸转染权利要求1的细胞；和培养转染的细胞以使所述转染的细胞产生3-HP。
100.一种由3-HP制备1，3-丙二醇的方法，包括用权利要求97的方法制备3-HP；将3-HP与包含乙酰化醛NAD(+)氧化还原酶活性的多肽和包含醇NAD(+)氧化还原酶活性的多肽接触。
101.一种制备1，3-丙二醇的方法，包括用编码包含CoA转移酶或CoA合成酶活性的多肽的核酸；编码包含β-丙氨酰-CoA氨裂解酶活性的多肽的核酸；编码包含3-羟丙酰-CoA水解酶，和/或3-羟异丁酰-CoA水解酶活性的多肽的核酸；编码包含乙酰化醛NAD(+)氧化还原酶活性的多肽的核酸；和编码包含醇NAD(+)氧化还原酶活性的多肽的核酸转染权利要求1的细胞；以及培养转染细胞以使所述转染细胞产生1，3-丙二醇。
102.一种制备1，3-丙二醇的方法，包括用编码包含CoA转移酶或CoA合成酶活性的多肽的核酸；编码包含β-丙氨酰-CoA氨裂解酶活性的多肽的核酸；编码包含3-羟丙酰-CoA脱水酶活性的多肽的核酸；编码包含3-羟丙酰-CoA水解酶，和/或3-羟异丁酰-CoA水解酶活性的多肽的核酸；编码包含醛脱氢酶(NAD(P)+)活性的多肽的核酸；编码包含醇脱氢酶活性的多肽的核酸转染权利要求1的细胞；以及培养转染的细胞以使所述转染细胞产生1，3-丙二醇。
103.一种制备泛酸的方法，包括由权利要求1的细胞纯化β-丙氨酸；和将β-丙氨酸与α-酮泛酸羟甲基转移酶、α-酮泛酸还原酶和泛酸合酶接触以制备泛酸。
104.制备泛酸的方法，包括用编码包含α-酮泛酸羟甲基转移酶活性的多肽的核酸，编码包含α-酮泛酸还原酶活性的多肽的核酸，和编码包含泛酸合酶活性的多肽的核酸转染权利要求1的细胞；和培养转染细胞以使转染细胞产生泛酸。
105.根据权利要求1的细胞，其中所述细胞是植物细胞。
106.含有权利要求104的细胞的植物。
106.一种包含权利要求57的重组核酸的转基因植物。
全文摘要
本发明公开了丙氨酸2，3－氨基变位酶的序列，以及含有丙氨酸2，3－氨基变位酶活性的细胞和筛选所述细胞的方法。本发明也公开了生产β－丙氨酸、泛酸、3－羟丙酸以及其它有机化合物的方法。
文档编号C12N1/15GK1714146SQ03804939
公开日2005年12月28日 申请日期2003年1月17日 优先权日2002年1月18日
发明者汉斯·H·廖, 拉维·R·戈卡恩, 史蒂文·J·戈特, 奥利·J·耶森, 奥尔加·谢利丰诺娃 申请人:卡吉尔公司