扩增重复核酸序列的制作方法

专利名称：扩增重复核酸序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及DNA重组技术领域。特别地，本发明涉及用于扩增靶核酸，特别是直接扩增重复核酸序列的组合物和方法。
背景技术：
在医学诊断、法医学、遗传分析和公共卫生的众多应用中，检测靶核酸的存在是非常重要的。例如，对于诊断遗传疾病、确定对疾病的易感性和鉴定传染病的病原体(causal agents)来说，鉴定特定的DNA序列是关键的。聚合酶链式反应(PCR)选择性地扩增靶核酸，提供一种高度灵敏的检测靶核酸存在的方法。该方法取决于杂交到靶核酸片段的相反端的寡核苷酸引物，扩增子的使用和由聚合酶引发核酸片段的复制。DNA合成、变性和重退火的反复循环可以指数性地扩增特定的靶核酸。
扩增反应成功与否，引物选择是主要的决定因素。关键的因素包括引物长度、解链温度(Tm)、序列特异性、互补引物序列、G/C含量，和3’末端区域的序列。总之，引物必须特异地与靶核酸杂交，但是不杂交和扩增非靶核酸序列。
当引物的3’末端与另一引物互补时，扩增非靶核酸带来了麻烦。这些引物将会相互杂交，然后被聚合酶延伸以形成“引物-二聚体”产物。引物-二聚体接着扩增导致引物损耗，使得灵敏度下降或甚至不能扩增预定的靶核酸。在限制引物-引物杂交的温度下进行引物延伸或预扩增退火(如，“热启动”PCR，D’Aquila，R.T.等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)193749(1991)；“降落(touchdown)”PCR，Don，.H.等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)194008(1991))或调整缓冲液的成分来提高杂交严紧性可能会最小化引物-二聚体的干扰。但是，在PCR反应中存在过量的引物使得既便是3’末端区域微弱互补性也生成这些干扰副产物。
虽然选择靶核酸的不同区域来筛选引物给限制非靶核酸的被动扩增提供了基础，但是对筛选用于产生引物的序列的限定限制了对可替代的引物设计的选择。例如，直接扩增短串联重复序列如端粒重复是困难的，这是由于这些序列的引物总是具有一定程度的互补性。这些重复序列一般不具有限制引物-二聚体产物形成的引物序列。因此，当前用于评估端粒长度的方法依赖限制性内切酶消化基因组DNA，接着与重复序列杂交(末端限制性片段分析；见Harley，C.B.等自然(Nature)345458-460(1990))，用位于重复区外的特定序列间接地扩增重复序列(见Kozlowski，M.R.等，美国专利第5,741,677)，荧光原位杂交(见Henderson，S.细胞生物学杂志(J.Cell Biol.)1341-12(1996))，或流速细胞计数方法(见Hultdin，M.核酸研究(Nucleic AcidsRes.)263651-3656(1998))。总之，这些操作耗时或者需要相当多的DNA。由于端粒重复的拷贝数和细胞中的其它串联重复序列与细胞的生理或疾病状态相关，需要用于快速扩增和量化这些序列并且在扩增中通常能避免竞争性的引物-二聚体副反应的组合物和方法。
发明概述按照上述目的，本发明提供用于扩增靶核酸而限制非靶核酸被动扩增的方法。在优选的实施方案中，该方法包括将包含基本上互补的第一条链和第二条链的靶核酸与第一引物和第二引物接触，其中第一引物杂交到靶核酸的第一条链而第二引物杂交到靶核酸的第二条链，和其中当杂交到各自的链时被杂交的引物能够引物延伸。第一引物的至少一个核苷酸被改变以使当第一引物和第二引物相互杂交时在被改变的残基与第二引物的3’末端核苷酸之间产生错配。靶核酸主要是通过聚合酶链式反应被扩增。
在另一个方面，用于扩增靶核酸的方法还包括改变第二引物的至少一个核苷酸残基来使得引物相互杂交时第二引物上被改变的残基与第一引物的3’末端核苷酸之间产生错配。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供扩增靶核酸的重复区域中的重复单位的方法。在一个实施方案中，该方法包括将包含基本上互补的第一条链和第二条链的靶核酸与第一引物和第二引物接触，其中第一引物杂交到靶核酸的第一条链的至少一个重复单位上而第二引物杂交到靶核酸的第二条链的至少一个重复单位上，和其中杂交到各自的链时被杂交的引物能够引物延伸(primer extention)。第一引物的至少一个核苷酸被改变以在被改变的残基与第一条链的至少一个重复单位的核苷酸残基之间产生错配，其中当第一引物和第二引物相互杂交时被改变的残基还与第二引物的3’末端核苷酸产生错配。靶核酸随后通过聚合酶链式反应被扩增。
在另一个方面，用于扩增重复序列的方法还包括改变第二引物的至少一个核苷酸残基来使得在被改变的残基和第二条链的至少一个重复单位的核苷酸残基之间产生错配，其中当引物相互杂交时第二引物上的被改变的残基还与第一引物的3’末端核苷酸之间产生错配。
在另一个用于扩增重复区域中的重复单位的优选实施方案中，该方法包含将基本上互补的第一条链和第二条链与第一引物和第二引物接触，其中第一引物杂交到靶核酸的第一条链的一个以上重复单位上而第二引物杂交到靶核酸的第二条链的一个以上重复单位上，和其中杂交到各自链时被杂交的引物能够引物延伸。第一引物的核苷酸残基被改变以使在被改变的残基与第一条链的各个重复单位的相同核苷酸位置上的核苷酸之间产生错配，其中当第一引物和第二引物相互杂交时被改变的残基还与第二引物的3’末端核苷酸产生错配。然后靶核酸被扩增。
在另一个方面，用于扩增重复序列的方法还包含改变第二引物的核苷酸残基来在被改变的残基与第二条链的各个重复单位的相同核苷酸位置上的核苷酸之间产生错配，其中当引物相互杂交时第二引物上被改变的残基还与第一引物的3’末端核苷酸残基产生错配。
在一个优选实施方案中，本发明提供通过测定被扩增的靶核酸的数量来确定靶核酸如端粒的重复区中重复单位的数量的方法。这些方法可应用于癌症诊断和细胞衰老的检测。
按照所述的方法，本发明还提供用于扩增受体(subject)靶核酸，包括端粒重复区域的组合物。
附图描述附

图1描述寡核苷酸引物对tel1和tel2的序列，被用于扩增人端粒重复单位。所示的是引物与端粒重复序列的杂交方案和引物之间的杂交。tel-1引物能与沿着端粒DNA链朝向着丝粒的从5’到3’的任何可得到互补的31个碱基对序列杂交。tel-2引物能与沿着该链朝向染色体末端的从5’到3’的任何可得到互补的31个碱基对序列杂交。对于每条引物，核苷酸残基被改变来在被改变的残基与引物所杂交的各个重复单位的相同核苷酸位置上的核苷酸残基之间产生错配。因此，对于tel1和tel2来说，每第6个碱基(everysixth base)被错配。为了限制引物-二聚体产物，当引物相互杂交时每条引物上被改变的残基还与其它引物3’末端的核苷酸残基产生错配，从而阻断通过聚合酶的延伸。此外，引物的5’末端区被设计使得不与端粒重复发生碱基对。这些非互补性的5’末端区序列防止PCR产物的3’末端在端粒扩增生产中起始DNA合成。通过设计具有相似GC含量和类似Tms的端粒特异性引物(见实施例1)，进一步减少不期望的扩增。
附图2显示用于测定相对T/S比的标准曲线，其中T/S比是端粒(T)与单拷贝基因(S)相比(见实施例2)。通过系列稀释(稀释因子～1.68)和等分到微量滴定板(Microtiter plate)的孔中得到超过8倍范围的5种DNA浓度；每孔的最终含量在12.64ng到100ng的范围内，与被分析的样本具有中度量近似匹配。DNA样本的Ct是样本必须进行的PCR循环分数(fractional number)，来积累足够产物的以超过设定的荧光信号大小的阈值。只要每个被分析的样本的Ct落入标准曲线的Ct范围内，任何个别的或汇集的人DNA样本被用于构建标准曲线(O＝单拷贝基因36B4；Δ＝端粒)。
附图3显示采用本文描述的引物通过实时(real time)定量PCR测定的相对T/S比的相关性和通过传统的Southern杂交分析测定的平均端粒限制性片段(TRF)长度。用于分析的DNA样本是采自21个个体的血液。由于采用标准曲线确定的起始T/S比都被归一化到在样本中观察到的最小T/S比(0.69)，被绘制的所有相对T/S比具有＝1.0的值。给出了与数据最佳拟合的线性回归曲线的方程。
附图4显示通过琼脂凝胶电泳分离和采用溴乙啶染色和UV照射可视化的扩增产物。经过25个PCR循环后，被扩增的人端粒DNA以成片条带出现，该条带具有起始于约76个碱基对的最大强度，而在约400个碱基对处逐渐减弱到背景(人基因组DNA)。当含有已知数量的人端粒重复单位的靶核酸模板(TTAGGG)20被用于扩增时，也得到了起始于约76个碱基对的产物的成片条带。当人基因组DNA被去除(即缓冲液)或用大肠杆菌DNA替代时，直到25个PCR循环都没有检测到产物。给出了DNA长度标准(123bp序列梯)。
发明详述本发明涉及用于扩增靶核酸而限制非靶核酸被动扩增反应的方法和组合物。特别地，本发明提供用于限制相互杂交的引物的扩增而可以扩增靶核酸的引物。总之，本发明的引物包含被改变或被突变的核苷酸残基，使得当引物相互杂交时，一条引物的3’末端残基与另一引物上被改变或突变的核苷酸残基产生错配，从而阻止引物延伸。本发明可用于降低PCR背景和用于扩增和量化重复序列特别是端粒重复序列。
在此所用的“引物”、“引物核酸”、“寡核苷酸引物”或语法等同物是指与靶核酸的某些部分杂交的核酸。本发明的引物被设计成基本上与靶序列互补以使靶序列与本发明的引物发生杂交，而且恰当的3’碱基配对可以发生引物延伸。这种互补性不必是最优的。因此，在此“互补的”或“基本上互补”是指在常规反应条件下探针与靶序列相当地互补以发生杂交。只要偏离最优互补不足以完全地阻碍杂交，该偏离是允许的。但是，如果改变或突变的数量足以至少在如下定义的严紧杂交条件下不发生杂交，该序列不是互补的靶序列。
本发明的引物包含核酸。此处的“核酸”或“寡核苷酸”或语法同等物是指共价连接在一起的至少两核苷酸。本发明的核酸通常含有磷酸二酯键，虽然在有些情形下包括的核酸类似物可能具有其它主链，包含如磷酰胺(Beaucage，S.L.等，四面体(Tetrahdron)491925-1963(1993)及其参考文献；Letsinger，R.L等，有机化学杂志(J.Org.Chem.)353800-3803(1970)；Sprinzl，M.等，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)81579-589(1977)；Letsinger，R.L.等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)143487-3499(1986)；Sawai等，化学通讯(Chem.Lett.)805(1984)；Letsinger，R.L.等，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)1104470(1988)；和Pauwels等，Chemica.Scripta 26141-149(1986))、硫代磷酸酯(Mag，M.等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)191437-1441(1991)；和美国专利5,644,048)、二硫代磷酸酯(Briu等，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)1112321(1989))、O-甲基氨基磷酸盐键(O-methylphosphoroamidite linkages)(见Eckstein，F.，寡核苷酸及类似物实用方法(Oligonucleotides and AnaloguesA Practical Approach)，牛津大学出版社，1991)，及肽核酸的主链和键(Egholm，M.美国化学协会(Am.Chem.Soc.)1141895-1897(1992)；Meier等，Chem.Int.Ed.Engl.311008(1992)；Egholm，M，自然(Nature)365566-568(1993)；Carlsson，C.等.自然(Nature)380207(1996)，全部被引入作为参考)。其它类似物核酸包括具有正电(positive)主链的那些(Dempcy，R.O.等，美国国家科学院汇编(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)926097-6101(1995))；非离子主链(美国专利5,386,023；5,637,684；5,602,240；5,216,141；和4,469,863；Kiedrowshi等，Angew.Chem.Intl.(英文)30423(1991)；Letsinger，R.L.等，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)1104470(1988)；Letsinger，R.L.等，核苷与核苷酸(Nucleoside & Nucleotide)131597(1994)；Y.S.Sanghui和P.Dan Cook编辑的ASC讨论丛书(ASC SymposiumSeries)580，“反义研究中的糖修饰”(Carbohydrate Modifications in AntisenseResearch)，第2和3章；Mesmaeker等，生物有机化学和医学化学通讯(Bioorganic & Medicinal Chem.Lett.)4395(1 994)；Jeffs等，J.Biomolecular NMR3417(1994)；四面体通讯(Tetrahedron Lett.)37743(1996))和非核糖体主链，包括在美国专利5,235,033和5,034,506、和Y.S.Sanghui和P.Dan Cook编辑的ASC讨论丛书(ASC Symposium Series)580，“反义研究中的糖修饰”(Carbohydrate Modifications in Antisense Research)，第6和7章中描述的那些。含有一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的定义中(见Jenkins等，化学协会研究(Chem.Soc.Rev.)169-176(1995))；所有引用的文献在此特别地被引入作为参考。
在一个优选实施方案中，核酸是肽核酸(PNA)，其包括肽核酸类似物。与天然核酸的高电荷磷酸二酯主链相反，在中性条件下这些主链基本上是非离子的。这带来许多优点。PNA主链具有增强的杂交动力学。在错配的解链温度下(Tm)的PNAs具有比最佳匹配的碱基对更多的电荷。内部错配时DNA和RNA的Tm通常降低2-4℃，而具有非离子的PNA主链则降低约7-9℃。类似地，由于其非离子的特性，结合到这些主链的碱基的杂交对盐浓度相对不敏感。特别优选的是能够通过聚合酶延伸的PNA衍生物。这些引物包含具有结合的核苷酸的PNA低聚物，该低聚物可以被聚合酶识别和延伸(见Lutz，M.J.等，核苷与核苷酸(Nucleosides Nucleotides)18393-401(1999)和Misra，H.S.，生物化学(Biochemistry)371917-1925(1988)；出版物在此被引入作为参考)。具有核苷酸和二核苷酸3’末端的PNAs能够被一些聚合酶识别和延伸，存在PNA片段将使PNA-修饰链抵抗核酸酶、特别是5’-3’外切核酸酶。
虽然引物通常是单链的，在此描述的核酸可以是单链或双链的，特别地，或含有双链或单链序列的部分。虽然一般天然的碱基是优选的，核酸可以是DNA、RNA或杂交体，其中核酸含有任何脱氧核糖核酸和核糖核酸的组合，和任何碱基的组合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶(isocytosine)、异鸟嘌呤(isoguanine)、次黄嘌呤核苷等。在此所用术语“核苷(nucleoside)”包括核苷酸以及核苷和核苷酸类似物，和被修饰的核苷如氨基修饰的核苷。此外，“核苷”包括非天然的类似物结构。因此，例如，含有碱基(a base)的肽核酸(PNA)的独立单位在此称作为核苷酸。
本领域技术人员可以预期，所有这些核酸类似物都可以用于本发明。此外，可以制备天然核酸及其类似物的混合物或者不同核酸类似物的混合物。
引物核酸的大小是变化的，这是本领域技术人员可以预期的，一般长度在5-500个核苷酸间变化，在10-100个核苷酸之间的引物是优选的，在12-75个核苷酸之间的引物更加优选，而在15-50个核苷酸之间的引物是极其优选的，这取决于具体的用途、所需特异性和扩增技术。
一般地，本发明的组合物提供与靶核酸的第一条单链杂交的第一引物以及与靶核酸的第二条单链杂交的第二引物，其中第一条链和第二条链基本上是互补的。引物与各自的链杂交时能够通过聚合酶进行引物延伸。也就是说，与靶核酸杂交的引物具有与靶核酸的核苷酸残基互补的3’末端核苷酸残基，使得引物能够引物延伸。
在一个优选实施方案中，至少引物之一还包含至少一个变化的或者突变的核苷酸残基，在引物相互杂交时在变化的残基与另一条引物的3’末端核苷酸之间产生错配。此处的“变化的”、“改变的”或“突变的”核苷酸残基是指产生所需错配的引物核苷酸残基的任何改变，如颠换和转换。在3’末端核苷酸上出现错配阻断了通过聚合酶的延伸，从而限制了非靶核酸的被动延伸反应。
因此，在一个优选实施方案中，至少第一引物的一个核苷酸被改变来在第一引物和第二引物相互杂交时，在变化的残基和第二引物的3’末端核苷酸残基之间产生错配。
对于任何的引物对，引物相互杂交的能力可以通过将第一引物的序列与第二引物对比来检测。确定杂交的稳定性、特别是热解链温度(Tm)可以采用下面描述的方法和通过本领域熟知的方法(见Breslauer，T.等，美国国家科学院汇编(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)838893-8897(1986)；Wetmur，J.G.，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.26227-259(1991)；Rychlik，W.等，J.NIH Res.678(1994))；Wallace Rule estimations(Suggs，S.V.等，“化学合成的寡脱氧核苷酸用于特异的克隆DNA序列的分离”(Use of Synthetic oligodeoxribonucleotidesfor the isolation of specific cloned DNA sequences)，利用纯化基因的发育生物学(Developmental biology using purified genes)，D.B.Brown编辑，第683-693页，学院出版社(Academic Press)，纽约，1981)，和基于Bolton和McCarthy的T检验(T estimations based on Bolton and McCarthy)(见Baldino，F.J.等，酶学方法(Methods Enzymol.)168761-777(1989)；Sambrook，J.等，分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第10章，冷泉巷出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉巷(Cold Spring Harbor)，纽约，2001)。所有文献在此特别地引入作为参考。当评价杂交稳定性时，各种参数的影响其中包括，离子强度、探针长度、G/C含量，和错配都被考虑。对这些因素的考虑对于本领域技术人员来说是熟知的(Sambrook，J.，同上文)。
引物之间形成的杂合体是否能够通过聚合酶无模板地被动延伸，可以通过杂合体的3’末端区域是否具有互补性来评定。能够通过聚合酶延伸的那些杂合体的至少一条引物的3’末端核苷酸与其它引物的核苷酸序列互补(Watson，R.扩增(Amplifications)5-6(1989))。因此，包含与至少一条引物的至少3’末端核苷酸互补的杂合体被选择，进行引物序列的变化或突变。由于接近3’末端的核苷酸错配时通过聚合酶的引物延伸的效率较低，具有至少2个或多个核苷酸变化对于引物杂合体来说是优选的，在3’末端区域具有3个或更多个互补的核苷酸的杂合体是最优选的。还可以采用各种计算方法确定3’末端区域具有互补性的杂合体，例如，扩大(Amplify)1.2软件(威斯康星州大学，遗传系，麦迪逊，威斯康星州。
另外，通过在无靶核酸时进行扩增反应和如通过电泳检测引物-二聚体种类的生成，很容易确定非靶核酸被动引物延伸的产物的存在。在此所用的“引物-二聚体”是指由引物与其它引物杂交引起的非靶核酸通过聚合酶的被动延伸。还可以在缺乏或存在靶核酸时进行扩增反应，并分析扩增产物的融合曲线，来确定引物-二聚体的存在(见Ririe，K.M.生物化学年评(Anal.Biochem.)245154-160(1997)；引入作为参考)。
在一个优选实施方案中，变化的或突变的核苷酸残基离引物的3’末端足够远，使得当引物与各自的靶核酸链杂交时可以通过聚合酶进行有效扩增。由于已知3’末端核苷酸或接近3’末端核苷酸的错配会影响引物延伸，变化的核苷酸残基至少是被1个或多个来自改变的引物的3’末端核苷酸的残基。更优选地，变化的残基至少是2个或更多个残基，而在最优选的实施方案中，变化的残基3个或更多个来自3’末端核苷酸。
在本发明的另一个优选实施方案中，在扩增反应中所用的两条引物包含至少一个变化的核苷酸残基，使得引物相互杂交在两条引物的3’末端残基上产生错配以阻止通过聚合酶的延伸。当每条引物具有与另一条引物的3’末端区域互补时出现这种情况。因此，在一个优选的实施方案中，除了在第一引物上的至少一个变化的核苷酸残基外，第二引物上至少一个核苷酸残基被改变，使得当第一引物与第二引物相互杂交时在第二引物上被改变的残基与第一引物的3末端核苷酸之间产生错配。如上讨论，被改变的残基优选为至少一个核苷酸残基，更优选为至少2个核苷酸残基，和最优选为第二引物3’末端核苷酸的至少3个核苷酸残基。由于第一引物和第二引物的3’末端核苷酸残基未被改变，当引物与各自的靶核酸链杂交时，它们仍然能够通过聚合酶延伸。因此，当非靶核酸未被扩增时，靶核酸容易被扩增。
虽然上述的实施方案涉及两种能够相互杂交的不同引物，还存在引物与自身互补的情况，产生单引物的引物-二聚体产物。因此，本发明不限于不同的引物，还适用于在扩增反应中产生引物-二聚体的自身互补的引物。
考虑到用于限制非靶核酸被动扩增的引物的总体设计，本发明还提供用于扩增靶核酸的重复区域中的大量重复单位的组合物。在此所用的“重复单位”(repetitive unit)、“重复单位”(repeat unit)、“重复元件”或者语法上的等同物是指在重复区域中反复或重复的最小核苷酸序列。扩增的重复单位可能包含任何重复序列，具有1个或多个核苷酸的重复单位是优选的，更加优选的重复单位在3-100个核苷酸之间，和最优选的重复单位在4-30个核苷酸之间。总之，虽然在重复单位之间存在非重复的核苷酸，这些重复单位以串联方式排列。在此“大量”的重复元件是指重复区域中的至少2个和多个重复单位。这些重复区域包含天然存在的重复区域，如着丝粒和端粒包含的重复区域，或者可能包含例如通过转染、重组或位点特异性整合(如逆转录病毒呈递)被导入细胞或生物中的重复区域。每套引物扩增的重复单位的数量依赖于引物长度和重复单位的核苷酸长度。这对于本领域技术人员来说是可预期的，引物序列和引物长度可以依据引物对该重复单位的稳定性和特异性来选择。
在一个优选实施方案中，用于扩增重复区域的重复单位的组合物包含杂交到靶核酸的第一条链上的至少一个重复单位上的第一引物和杂交到靶核酸的第二条链上的至少一个重复单位上的第二引物，其中第一条链和第二条链基本上是互补的。当引物杂交到其各自的靶核酸链时能够引物延伸。也就是说，杂交到靶核酸的引物，其3’末端核苷酸残基与靶核酸上的核苷酸残基互补，使得这些引物能够起始延伸(primer extension)。一个方面，至少一条引物的至少一个核苷酸残基被改变来与引物所杂交的至少一个重复单位的核苷酸残基产生错配，其中在引物相互杂交时被改变的核苷酸残基还与另一条引物的3’末端核苷酸残基之间产生错配，从而限制起始引物-引物二聚体杂合体的延伸。
因此，在一个优选实施方案中，第一引物的至少一个核苷酸残基被改变，以在被改变的残基与引物所杂交的第一条链上的至少一个重复单位的核苷酸残基之间产生错配，其中在第一引物和第二引物相互杂交时被改变的核苷酸残基还与第二引物的3’末端核苷酸残基之间产生错配。
被改变的残基优选为至少1个核苷酸残基，更优选地至少2个核苷酸残基，和最优选地3’末端核苷酸的3个核苷酸残基，使得当被改变的引物杂交到靶核酸时可以通过聚合酶的有效延伸。
在另一个方面，用于扩增重复单位的两条引物都包含至少一个被改变的核苷酸残基，使得引物相互杂交在被改变的残基与两条引物的3’末端残基之间产生错配。因此，在一个优选实施方案中，除了上述的第一引物上的被改变的残基之外，第二引物的至少一个核苷酸残基被改变来在被改变的残基与第二引物所杂交的第二条链的至少一个重复单位的核苷酸残基之间产生错配，其中在引物相互杂交时第二引物上被改变的残基还与第一引物的3’末端残基产生错配。
在还有一个用于扩增重复区域的重复单位的优选实施方案中，本发明包含杂交到靶核酸的第一条单链上的一个以上重复单位的第一引物和杂交到靶核酸的第二条单链上的一个以上重复单位的第二引物，其中第一条链和第二条链基本上是互补的。如上所述，在杂交到各自的靶核酸链上时引物能够引物延伸。在一个方面，至少一条引物的核苷酸残基被改变来在被改变的残基与引物所杂交的靶核酸的一条链上的每个重复单位的相同核苷酸位置上的核苷酸产生错配。在引物相互杂交时，这些被改变的核苷酸残基还与另一条引物的3’末端核苷酸残基产生错配，从而进一步限制引物-引物二聚体杂合体的起始-延伸。
因此，在一个优选的实施方案中，第一引物的核苷酸残基被改变，来在被改变的残基与引物所杂交的靶核酸的第一条链的每个重复单位的相同核苷酸位置上的核苷酸残基之间产生错配。在第一引物和第二引物相互杂交时，这些被改变的核苷酸还与第二引物的3’末端核苷酸残基产生错配。
被改变的核苷酸残基优选至少1个核苷酸残基，更优选地至少2个核苷酸残基，和最优选地3’末端核苷酸的3个核苷酸残基，使得当被改变的引物与靶核酸杂交时可以通过聚合酶有效延伸。
在另一个方面，两条引物都含有被改变的残基，使得引物相互杂交产生两条引物的3’末端核苷酸的错配。因此，在一个优选实施方案中，除了第一引物的被改变的核苷酸残基外，第二引物上的核苷酸残基也被改变来在第二条引物的被改变残基与引物所杂交的第二条链的每个重复单位的相同核苷酸位置上的核苷酸残基之间产生错配。当引物相互杂交时，第二引物上的这些被改变的核苷酸还与第一引物的3’末端核苷酸残基产生错配。
由于杂交到靶核酸的引物必须能够起始延伸，第一引物和第二引物的改变必须位于重复单位的非互补核苷酸上。因此，在一个方面，当第一引物和第二引物都包含被改变的残基时，该变化在重复单位的邻近核苷酸位置上。在另一个方面，该变化位于重复单位的不毗连的核苷酸位置上。总之，位于邻近核苷酸位置上的错配在改变的核苷酸和3’末端核苷酸之间产生最多配对的碱基或互补残基，这对于有效扩增短重复序列(即3-6个碱基对)是重要的。
在另一个优选实施方案中，第一引物和第二引物还包含不与靶核酸杂交(即碱基配对)的5’末端区域。该不配对的区域包含一个或多个核苷酸，优选范围是3-60个核苷酸，最优选范围是4-30个核苷酸。当引物被用于扩增重复区域的重复单位时，5’端不配对区域阻断被复制的引物延伸产物的3’末端在随后的扩增循环中从扩增产物的内部重复单位起始核酸合成。
虽然5’端不配对区域可以是不与靶核酸杂交的任何序列，在优选实施方案中，不配对的区域包含限制性位点、用于测序或起始延伸反应(即扩增)的特定序列(unique sequence)、或者用于检测和测量扩增产物的标记序列。
在一个优选实施方案中，本发明的引物被设计成具有类似Tms。在此所用具有类似Tms的引物具有约10℃或更小的Tm差值，优选5℃或更小，和更加优选2℃或更小。采用具有相同或相似Tms的引物组(如引物对)，使得可以采用在特定的扩增条件下对两条引物来说是最佳的并且产生类似扩增效率的退火/延伸温度。优点在于可以使用相似浓度的引物，特别是低浓度，其限制不期望的扩增产物的产生。比较而言，当引物的Tms不同时，一条引物采用较高浓度来弥补扩增效率的差异。较高的引物浓度在较少的PCR循环中产生不期望的扩增产物。
在一个方面，通过改变引物长度或通过选择具有类似鸟嘌呤-胞嘧啶(GC)含量的引物来制备具有相似Tms的引物。Tms通过上述方法来评价。在此所用“类似GC含量”是指一个引物组，其GC含量差别约10％或更低，更优选差别约5％或更低，和最优选差别约2％或更低，使得引物具有如上定义的相似Tms。在引物设计方法中，最先被评价与靶核酸杂交的区域的Tm和/或GC含量。对于具有上述非杂交5’末端区域的引物，对整条引物进行额外的Tm和GC含量分析。总之，引物被设计成3’末端区域的GC含量具有较高相似性，由于该区域是通过聚合酶延伸的区域。
本发明的引物可被用于扩增各种靶核酸。一个简单的引物组，如引物对，被用于扩增单个靶核酸，或者多个引物组被用于扩增大量靶核酸。可以对每个特定的引物组分别地进行扩增，或者在单个反应容器采用引物组的组合，本领域通常知晓的多重聚合酶链式反应。当在一个反应中采用多种引物组，引物被设计来限制不期望的产物的形成和限制每个引物组中引物间的干扰。
由于本发明涉及用上述的引物来扩增靶核酸，本发明还提供用于扩增靶核酸序列的方法。在一个优选实施方案中，该方法包括将包含基本上互补的第一条链和第二条链的靶核酸与上述的第一引物和第二引物接触，通过聚合酶链式反应扩增靶核酸。
此处“靶核酸”或“靶序列”或语法意义上的等同物是指双链或单链核酸的核酸序列。靶序列可能是基因、调控序列、基因组DNA、cDNA、RNA包括mRNA和rRNA或者其它核酸的一部分。其可以是任意长度，应当理解，较长的序列更特异。在一些实施方案中，期望可以将样本核酸切割或裂解成100-10,000碱基对的片段，在一些实施方案中，具有约500个碱基对的片段是优选的。切割或裂解可以通过任何本领域技术人员知晓的方法进行，包括机械的、化学的、和酶学的方法。因此，核酸可以进行超声处理、弗氏细胞压碎(French press)、剪切或者用核酸酶(如DNA酶、限制性酶、RNA酶等)或者化学裂解试剂(如酸/哌啶(piperidein)，肼/哌啶，铁-EDTA复合物，1，10-邻二氮杂菲-铜复合物等)处理。
本领域技术人员可以预期，靶序列可以是多种形式的。例如，其可以被含有在较大的核酸序列中，即全部或部分基因或mRNA，质粒或基因组DNA的限制性片段，等。包含靶序列的样本可以得自任何生物的任何组织，包括血液、大脑、骨髓、淋巴、肝脏、脾脏、乳房、上皮(如皮肤、口腔等)、或者其它组织，包括从活体解剖中获得的组织。样本还包括机体排泄物或液体，如唾液、尿液、粪便、脑脊髓液、精液、乳汁等。靶核酸的其它来源包括细菌、酵母、植物、病毒或其它含有核酸的致病的或非致病生物。核酸也可以是通过化学的或酶学的方法如PCR反应人工制备的任何核酸。
靶序列可以采用熟知的技术制备。例如，样本用去污剂、超声波、电泳、变性剂等处理来破坏细胞、细菌或病毒。靶核酸如按需被纯化。反应的成分被同时或按照下面指出以任何次序顺序加入。此外，各种试剂被加到反应中来实现最佳杂交、扩增和检测。这些试剂包括盐、缓冲液、中性蛋白、去污剂等。根据样本制备方法和靶核酸的纯化，其它试剂被加入来提高反应效率，如蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、抗菌剂等。当靶核酸为RNA时，这些核酸被转化为DNA，例如通过用逆转录酶(如MoMuLV逆转录酶、Tth逆转录酶等)处理，这在本领域是熟知的。
当靶核酸是双链核酸时，被变性来产生第一单链和第二单链以便引物的杂交。虽然根据双链核酸的性质可以采用碱性pH、变性剂(如甲酰胺)和其它技术，可以采用任意多个变性步骤如调节温度为约95℃。
引物与靶核苷酸接触使得第一引物能够与靶核酸的第一条链杂交和第二引物能够与靶核酸的第二条链杂交。采用各种杂交条件来形成杂合体，包括高度、中度和低度严紧的条件(见如，Sambrook，J.，分子克隆实验室手册，第3版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，2001；Ausubel，F.M.等，分子生物学中的现有方法(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley& Sons，updates to 2001；所有这些在此被引入作为参考)。严紧条件是序列依赖的，在不同条件下是不同的，包括引物长度、错配数量、G/C含量和离子强度。核酸杂交的教导在Tijssen，P.，“杂交原理和核酸分析策略的综述”(Overview of Principles of Hybridization and the Strategy of Nucleic AcidAssays)，生物化学和分子生物学中的实验室技术与核酸探针杂交(LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular BiologyHybridizationwith Nucleic Acid Probes)，第24卷，Elsevier，阿姆斯特丹，1993)中提供。一般地，严紧条件被选择为比特定溶液条件下(如离子强度、pH、核酸浓度)特定杂合体的热解链点(Tm)低5-10℃。Tm定义为在特定溶液条件下，平衡时50％与靶核酸互补的引物序列被杂交或为单链的温度。一般地，溶液条件是用于扩增靶核酸的溶液条件。由于严紧程度通常区别在于杂交温度和Tm，即使杂交的溶液条件发生改变，只要与Tm的温度差别是恒定的，可以保持严紧程度。杂交条件也可能随着核酸主链的类型如核糖核酸或肽核酸(PNA)主链而变化。
在引物与靶核酸杂交和扩增反应中，通常在存在靶核酸时能够形成杂合体的严紧条件下进行分析。本领域技术人员能够改变温度、盐浓度、pH、有机溶剂、离液剂等参数或者其它变量来控制杂交的严紧性，还最小化引物与非特异性靶的杂交(如通过采用“热启动”PCR和者“降落”PCR)。
在将引物与靶核酸接触后，用扩增酶通常是聚合酶来处理反应。各种合适的聚合酶在本领域是已知的，其中包括Taq聚合酶、KlenTaq、Tfl聚合酶、DynaZyme等。一般地，虽然所有的聚合酶都可用于本发明，但是由于采用具有强3’-5’外切活性的聚合酶倾向于切除错配的3’末端核苷酸，优选的聚合酶是缺乏3’-5’外切活性的热稳定聚合酶。也可以采用被构建来降低或无功能性的3’-5’外切活性的聚合酶(如，Pfu(exo-)、Vent(exo-)、Pyra(exo-)等)。还可以采用用于最佳地延伸被杂交的引物的聚合酶的混合物。在另一个方面，用于本发明的聚合酶被配制成仅在适合于扩增的温度下具有活性。存在抑制聚合酶的抗体是合适的，抗体在扩增温度下被灭活，或者以使酶在达到扩增温度时才可获得的方式封闭该酶。这些聚合酶制剂可以在单个反应容器中混合所有成分，而阻止非靶核酸序列的引发。
在另一个方面，本领域技术人员能够预期，各种试剂可以被加到反应中来提高聚合酶的持续合成能力，稳定以防止聚合酶失活，降低引物的非特异性杂交，或者提高复制效率。这些添加剂包括但不限于二甲基亚砜、甲酰胺、乙酰胺、甘油、聚乙二醇，或proteinacious试剂如大肠杆菌单链DNA结合蛋白、T4基因32蛋白、牛血清白蛋白、明胶等。在另一个方面，本领域技术人员可以采用各种核苷酸类似物来扩增特定的序列，如富含GC或重复序列。这些类似物其中包括c7-dGTP、羟甲基-dUTP、dITP、7-脱氮(deaza)-dGTP等。
按照本领域熟知的方法进行扩增反应。聚合酶链式反应方法被广泛地使用和描述(见如，美国专利4,683,195和4,683,202；在此引入作为参考)。简而言之，双链的靶核酸被变性，通常在足以使该链变性的温度下温育，然后在存在过量引物下温育，引物与单链靶核酸杂交(即退火)。DNA聚合酶延伸杂交的引物，产生新的靶核酸的拷贝。得到的双链被变性，重复杂交和延伸的步骤。在存在与靶核酸互补的第二引物时，通过重复变性、退火和延伸的步骤，被这两条引物所限定的靶核酸被指数性地扩增。引物延伸步骤的时间和温度取决于聚合酶、被扩增的靶核酸的长度和用于扩增的引物序列。充分地扩增靶核酸所需的重复步骤数取决于每个循环的扩增效率和靶核酸的起始拷贝数。这在本领域是熟知的，这些参数可以由技术人员调整以达到期望的扩增水平。本领域的技术人员能够理解，本发明不受到用于扩增过程的时间、温度、缓冲条件和扩增循环的变化的限制。
通过本领域熟知的方法来检测和分析扩增产物。扩增产物在该产物的分离和/或纯化后被分析，或者直接检测在扩增反应中形成的产物。分离和纯化的方法其中包括电泳，包括毛细管电泳(如在琼脂糖或丙烯酰胺凝胶中)；层析(如亲和层析、分子筛层析、反向层析等)；和杂交。被纯化的产物进一步进行本领域熟知的扩增。进行检测，产物用荧光化合物直接鉴定，如用溴乙啶或SYBRTM绿，或者通过与标记的核酸探针杂交。另外，被标记的引物或被标记的核苷酸被用于扩增反应来标记扩增产物。标记包括任何可检测的成分，包括荧光标记、放射性标记、电子标记，和间接标记如生物素或地高辛。当采用间接标记时，采用结合间接标记的第二结合试剂来检测扩增产物的存在。这些第二结合试剂包含与间接标记结合的抗体、半抗原或其它结合配偶体(如抗生物素蛋白)。第二结合试剂优选用荧光成分、放射性成分、酶等标记。
在另一个优选实施方案中，扩增产物在扩增反应中通过实时定量PCR被检测和量化，实时(real time)定量PCR的改变在本领域是熟知的。例如，TaqMan系统采用与被引物限定的核酸片段中的内部序列中的序列杂交的探针引物，引物用于扩增靶核酸(Heid，C.A.等，基因组研究(Genome Res.)6986-994(1996)；Holland，P.M.等，美国国家科学院汇编(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)887276-7280(1991)；引入作为参考)。该探针用两种不同的荧光染料(即双标记荧光寡核苷酸探针)标记，5’末端报道(reporter)染料(TAMRA)和3’末端荧光淬灭染料(FAM)。在PCR延伸阶段通过DNA聚合酶的5’-3’外切核酶活性裂解探针，从淬灭剂附近释放荧光分子，从而增强了荧光强度。
在另外一个方面，实时定量PCR可能基于杂交探针之间的荧光能量共振转移(FRET)(Wittwer，C.T.生物技术(Biotechniques)22130-138(1997)；引入作为参考)。这种方法中，两条寡核苷酸探针杂交到靶核酸效率的邻近区域。上游的探针的3’末端用激发染料(excitor dye)(如FITC)标记，而毗邻杂交的下游探针的5’端用报道染料标记。两个探针杂交到被扩增的核酸序列使得两种染料处于足以使FRET发生的接近位置。这使得可以在聚合酶链式反应过程中监测被扩增的产物的数量。一种相似的方法用于分子束探针(Tyagi，S.国家生物技术(Nat.Biotechnol.)1649-53(1998)；引入作为参考)。分子束是在PCR生产特异性寡核苷酸的两端分别包含淬灭染料和报道染料的寡核苷酸探针。染料还基于FRET起作用，因此可能还由激发染料和报道染料组成。5’末端和3’末端的短互补片段可以形成茎-环结构，其使寡核苷酸末端的染料十分接近，从而导致荧光淬灭或FRET。当寡核苷酸通过分子束探针的内部区域的互补序列杂交到PCR产物上，会影响寡核苷酸探针的荧光，从而可以监测产物的合成。
实时定量PCR还采用在PCR反应中优先地结合到双链核酸扩增产物的荧光染料，从而可以持续地检测产物合成(Higuchi，R.等，生物工艺学(Biotechnology)111026-1030(1993)；Morrison，T.B.等，生物技术(Biotechniques)24954-962(1998))。适合的荧光染料其中包括溴乙啶、YOPRO-1TM(Ishiguro，T.，分析生物化学(Anal.Biochem.)229207-213(1995))和SYBRTM绿染料(分子探针(Molecular Probes)，Eugene，OR，美国)。当扩增包含重复区域的靶核酸时，FRET和分子束探针不是优选的，当FRET或分子束探针被导向重复单位时，会杂交到引物的重复序列上，从而不能区分引物和被扩增的产物。
在另一个优选实施方案中，实时定量PCR用接近3’末端核苷酸结合了单一荧光团(flurophore)的引物来进行(Nazarenko，I.等，核酸研究(NucleicAcids Res.)30e37(2002)；Nazarenko，I.等，核酸研究(Nucleic AcidsRes.)302089-2195(2002)；LUXTM荧光引物，Invitrogen，Palo Alto，CA；在此引入作为参考)。这些引物的5′末端有能够与3’末端区域杂交来产生平端发夹(即茎-环)结构的5-7个核苷酸区域，该结构形成导致荧光团的荧光淬灭。当引物形成二聚物(duplex)时，如通过在模板上起始延伸，该淬灭被降低或消除，从而在样本中测量PCR产物。由于只采用单一荧光团(fluorphore)，在一个反应中可以使用和检测不同的荧光团(flurophore)。因此，通过使用具有可区别的荧光团的不同引物组，这些引物可以用于在一个反应容器中扩增和检测大量不同靶核酸。如此处所讨论，不同的靶核酸包括单拷贝基因和重复序列的组合。
适合用于实时监控PCR反应的仪器可以用于定量PCR方法(ABI Prism7700，Applied Biosystems Division，Perkin Elmer，福斯特城，CA，美国；LightCyclerTM，Roche Molecular Biochemicals，印第安纳波利斯，IN，美国)。
当实时定量PCR用于检测和测定扩增产物时，各种算法被用于计算样本中的靶核酸的数量(见ABI Prism 7700软件版本1.7；LightcyclerTM软件版本3；引入作为参考)。量化包括使用具有已知拷贝数的靶核酸的标准样本和从标准物的计算和阈值循环(Ct)中得到标准曲线。总之，Ct是PCR循环或部分PCR循环，其中扩增产物产生的荧光偏离上述基线荧光数倍(Higuchi，R.等，同上)。实时定量PCR产生7-8倍数量级的线性关系，可以在一个较宽的动力学范围内测量靶核酸的拷贝数。靶核酸拷贝数的绝对数量可以从比较标准曲线与样本的Ct值得到。
靶核酸的拷贝数还可以通过比较定量实时PCR来确定。采用已知拷贝数或恒定拷贝数的核酸可以测定样本中靶核酸的拷贝数。标准物可以是单拷贝基因、已知拷贝数的核酸、或当定量RNA拷贝数时为组成型地表达的看家基因(见Johnson，M.R.分析生物化学(Anal.Biochem.)278175-184(2000)；Boulay，J.-L.，等，生物技术(Biotechniques)27228-232(1999))。
上述组合物和方法可用于聚合酶链式反应扩增靶核酸的任何方法中。因此，本发明可用于检测和监控传染病，例如用于检测病原性细菌和病毒的存在(如病毒载量)。例如，靶病毒核酸包括而不限于HIV，HCV细胞巨噬化病毒、肝炎等载量。本发明还可用于监控医学治疗。例如包括监控施用抗生素后的细菌感染进程。
本发明可应用于描述细胞的功能状态，特别是与疾病状态相关的细胞变化。例如，在卵巢或乳癌(breast cancer)的癌症发展过程中扩增特定的基因片段不仅与癌症阶段而且与存活率相关(见Kalioniemi，A.等，美国国家科学院汇编(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)912156-2160(1994))。因此，基因扩增量化对于各种肿瘤具有诊断和预后的价值(Kawate，S.等，肿瘤学(Oncology)57157-163(1999)；Biechi，I.等，国际癌症杂志(Int.J.Cancer)78661-666(1998))。相反，遗传元件的缺失(即缺乏杂合性或微卫星不稳定性)还与特定疾病状态相关，从而提供了有用疾病诊断的焦点。例如，在直肠癌中常常出现染色体区的18q21缺失，而在各种癌症类型中位于染色体17pl3.1的抑制子p53基因常常缺失。(Largey，J.S.等，癌症(Cancer)171933-1937(1993))。
在细胞功能和疾病中极其重要的是重复序列，特别是在许多生物基因组中发现的串联重复序列。在真核细胞中，这些序列一般被分成三种主要类型卫星、小卫星和微卫星。卫星DNAs的重复长度约1到数千个碱基，构成达到10亿个碱基对簇的重复区域，例如真核细胞染色体中的异染色质区中。这些序列主要与着丝粒和端粒相关。小卫星序列是中度重复的，约9-100个碱基对重复的串联重复排列，通常具有约0.5-30kb的平均排列长度。这些通常存在于常染色质区，其大小变化大。微卫星是短(即约2-6个碱基对)重复的中度重复排列。这些重复的拷贝数在典型为约10-100个碱基的平均排列大小的群体中变化。在大多数情况下，重复范围的变化通常与特定疾病相关。例如，三联体重复CGG、CTG和GAA的拷贝数的增加与亨廷顿病(Huntington’s disease)、脆性X综合征(Fragile X syndrome)、以及肌强直性营养障碍(myotonic dystrophy)相关。这些三联体重复的放大程度通常与疾病的严重性和起始相关，使得继承放大重复的后代具有更加严重的疾病或者，如果该疾病不是先天性的，会在较早时期发生。与串联重复序列的放大相关的疾病不限于三核苷酸重复，包括较大的重复单位(Lafreniere，R.G.等，国家遗传学(Nat.Genet.)15298-302(1997))。
串联重复序列还具有重要的生物学功能。除了一些例外(如芽殖酵母)，绝大多数的植物、动物和真菌的着丝粒具有大量串联重复序列的排列。虽然这些序列的生理作用尚不清楚，一般认为它们在kinetichore的装配中起作用，以确保忠实有效的染色体分离。因此，确定重复数的可变性提供关于着丝粒的功能和调控以及与着丝粒功能紊乱相关的疾病的信息。
更加确定的细胞功能的重要性是包含线性真核染色体的端粒的串联重复序列。端粒DNA或端粒区是位于染色体末端的染色体区，由范围在5-26个碱基对的短序列重复单位的串联排列构成。不同生物的端粒区的重复单位或重复序列是不同的。这些重复序列在各种生物中是已知的，包括人和其它哺乳动物、四膜虫(Tetrahymena)、酵母、果蝇(Drosophila)和线虫类。在人类中，端粒重复单位是5′-TTAGGG-3′，而四膜虫的重复单位是5′-TTGGGG-3′。
端粒重复单位不仅是种属间重复序列不同，而且在生物中重复单位数量也是变化的。已经知道端粒的长度和完整性对于细胞生长和染色体的正确分离是重要的。例如，许多种癌症的发展与端粒维持的激活相关，细胞老化是虽然正常的复制信号还存在而细胞已经失去复制的能力的状态，与端粒完整性的缺乏有关。例如，端粒缩短引起细胞增生性老化，而端粒酶抑制会导致引起细胞凋亡(Zhang，X.等，基因发育(Genes Dev.)2388-2399(1999))。而且，敲除小鼠的端粒酶RNA导致发育缺陷、老化相关疾病和增加癌症易感性(Rudolph，K.L.等，细胞(Cell)96701-712(1999)；Herrera，E.等，EMBO杂志(EMBO J.)182950-2960(1999))。
因此，测定特定重复序列的重复单位数量具有重要应用，包括但不限于癌症诊断、老化相关的疾病、克隆生物的整合、筛选遗传疾病、和用于指向调控重复序列长度的酶(即端粒酶)和细胞路径的试剂的药物筛选。
因此，在一个优选实施方案中，本发明提供端粒长度的快速分析方法，通过用不会产生引物-二聚体但是当杂交到端粒重复单位时能起始延伸的引物直接扩增重复序列。由于各种生物的端粒具有不同的重复单位序列，扩增特定生物的端粒将采用特异于该生物的重复单位的引物。在此采用人端粒序列来阐明本发明用于直接扩增和量化串联重复核酸序列的实际操作，但不限于在此描述的特定实施方案。
进行确定端粒重复单位的数量时，选择的引物与重复区域的重复单位互补。第一引物具有与靶核酸的第一条单链上的端粒重复序列互补的序列，而第二引物具有与靶核酸的第二条单链上的端粒重复序列互补的序列，其中第一条链和第二条链基本上是互补的。在一个优选实施方案中，第一引物的核苷酸残基被改变，在被改变的残基与靶核酸的第一条链的每个端粒重复单位相同核苷酸位置上的核苷酸残基之间产生错配。当引物相互杂交时，这些被改变的残基还与第二引物的3’末端核苷酸产生错配。在另一个优选实施方案中，第二引物的核苷酸残基还类似地被改变，使得引物相互杂交导致第一引物和第二引物具有错配的3’末端核苷酸。
在优选的实施方案中，被改变的核苷酸残基在第一引物和第二引物上产生错配，来限制任何引物-二聚体产物的形成。在这种排列中，错配位于重复单位的邻近的或非邻近的核苷酸位置上。位于重复单位的邻近核苷酸位置上的错配最大化3’末端核苷酸与每条引物的被改变的残基的碱基配对的数量。附图1中给出用于扩增人端粒重复单位的引物示例。
将第一引物和第二引物与单链形式的重复区域接触后，引物被聚合酶延伸，通过重复变性、退火和延伸的循环扩增重复单位。在优选实施方案中，5’末端区域变化非碱基配对的序列来限制从被扩增的重复序列的内部重复起始。
扩增产物如上述被量化。在优选实施方案中，实时定量PCR用于确定靶核酸样本中的端粒重复单位的拷贝数。用于确定和比较端粒重复单位数量的标准物包括使用单拷贝基因(如核糖体磷蛋白364B)或者已知拷贝数的靶核酸(如具有已知端粒重复单位数量的质粒)。采用在此描述的方法，大量样本的重复单位的拷贝数被量化来确定端粒重复单位的数量，以及端粒的平均长度。
测定端粒重复单位的数量可以广泛应用于医学诊断、疾病预测和治疗。由于端粒酶活性的激活与细胞无限增殖相关，本发明可用于确定各种类型癌症细胞的端粒长度。细胞可以被持续地被分析来确定端粒的增加、减少或稳定是否与疾病进展相关。用于检测的各种癌症细胞类型包括乳房、肝脏、脑、骨骼、前列腺、淋巴细胞、黑素瘤、结肠癌等。
本发明还可以应用于诊断与老化早期起始相关的疾病。例如，具有儿童早衰症(Hunchinson Gilford progeria disease)的个体表现为与端粒长度损失相关的过早老化和成纤维细胞的增生能力下降(Alssopp，R.C.等，美国国家科学院汇编(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)8910114-10118(1992))，而患有先天性角化不良(dyskeratosis congenita)的患者由于缺失端粒酶RNA，表现为渐进骨髓衰竭、异常皮肤色素沉着、黏膜白斑病(leukoplakia)和指甲营养不良(dystrophy)(见Vulliamy，T.自然(Nature)413432-435(2001))。因此，扩增和量化端粒重复的数量可用于确定特定疾病与端粒长度变化的关系。
另一个优选实施方案中，本发明用于监控治疗效果或用于筛选影响端粒长度或端粒酶活性的药物候选。例如，由于细胞增生潜能与保持端粒完整性相关，本发明可用于监控癌症治疗的效果。监控端粒特征的能力给检测特定治疗和药理学试剂的效果提供一个窗口。在另一个方面，本发明可用作筛选作用于调控端粒长度的生物学路径，如端粒酶活性的候选引物的常规方法。快速扩增端粒重复的能力提供了鉴定小分子、候选核酸和影响细胞中的端粒特性的肽试剂的高通量筛选方法。
本领域技术人员应当理解，构建引物的步骤和扩增靶核酸序列的方法可以按照本文提供的选择进行变化。下面的实施例作为更加充分描述的使用方式和上述发明的最佳模式。但是，还应当可以理解，这些实施方案无论如何不是限定本发明的保护范围，本领域技术人员可以根据本领域的技术进行改进。本文引用的所有文献被引入作为参考。
实施例实施例1直接扩增人端粒重复序列基因组DNA通过标准方法从血液样本中提取。用于比较用于端粒测定的定量PCR与Southern印迹方法的样本由21位毫不相干的个体提供(11名女性和10男性，年龄在61-94岁)，他们来自犹它(utah家族，是世界上广泛用于建立遗传连锁图谱的Centre pour les Etudes du PolymorphismeHumaine(CEPH)collection的部分(White，R.等，自然(Nature)313101-105(1985))。被纯化的DNA样本在96-孔微板的10mM Tris-HCl，0.1mMEDTA，pH7.5(最终体积为300ul/孔)中稀释到约1.75ng/ul，在热循环中加热到95℃5min，转移到冰水浴中5min来迅速冷却，以700×g离心，用粘性铝箔封装，在4℃下保存直到分析。
在分离的96孔平板上对提取的DNA样本进行实时定量PCR。制备两种PCR试剂的混合母液(master mix)，一种具有端粒(T)引物对，另一种具有单拷贝基因(S)引物对。根据反应条件，30或10ul的T混合母液被加到第一块平板的各个样本孔和标准物曲线孔中，30或10ul的S混合母液被加到第二块平板的各个样本孔和标准物曲线孔中。对于每个个体，分析其T/S比，三个相同的20ulDNA样本的等分试样(每个试样35ng)被加到平板1中，而另一三个等分试样被加到平板2的相同孔位置上。对于每条标准物曲线，标准物DNA样本在TE(10mM Tris、1mM EDTA，pH7.0)中被连续稀释，以每次稀释～1.68倍来产生从0.63ng/ul到5ng/ul的5种DNA浓度范围，然后分布在20ul等分试样，加到每个平板的标准曲线孔中。然后平板用透明的粘性膜密封，以700×g离心，在黑暗中4℃下保存直到进行PCR(0-3天后)。
PCR扩增条件取决于所有的引物和被扩增的DNA模板。在一组试验中，端粒重复序列用引物组tel1(5′-GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT-3′)(SEQ IDNO1)和tel2(5′-TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA-3′)(SEQ ID NO2)扩增。PCR混合物中试剂的浓度为50ul的最终体积中含有150nM 6-ROX和0.2x SYBRTM绿I(Molecular Probes，Inc.)；15mM Tris-HCl，pH8.0；50mM KCl；2mM MgCl2；0.2mM各种dNTP；5mMDTT；1％DMSO；1.25单位AmpliTaq Gold DNA聚合酶(AppliedBiosystems，Inc.)；270nM tel1引物；和900nM tel2引物。热循环扩增以95℃温育10min开始来激活AmpliTaq Gold DNA聚合酶，接着以95℃×15s和54℃×2min进行18个循环。
可选择地，端粒特异性引物序列被优化以具有相似Tms，特别通过设计引物来具有相似或相同的GC含量。引物组tel1b(5′-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-3′)(SEQID NO8)和tel2b(5′-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT-3′)(SEQ ID NO9)的每一个引物在从3’末端的第6个碱基和其后朝向5’端方向的每第6个碱基携带特意导入的单个碱基取代，在重复序列的每第6个位置上总共有5个导入的碱基变化。当引物杂交到靶端粒DNA上时，产生5个单一的碱基错配，但是该杂合体在每条引物的3’末端的最后5个碱基与靶端粒DNA序列具有最佳互补性。引物相互杂交导致6个位置中的4个上发生碱基配对，每条引物的3’末端残基与另一条引物形成错配。具有这些Tm最优化的引物的PCR条件是在每个反应的30ul的最终体积中含有0.4x Sybr绿I，15mM Tris-HCI，pH8.0；50mM KCl；1.5mM MgCl2，1％DMSO，2.5mM DTT，200uM各种dNTP，0.75单位AmpliTaq Gold DNA聚合酶，450nM tel1b引物，和450nM tel2b引物。热循环扩增为95℃×10min，接着以95℃15sec(变性)和56℃2min(退火/延伸)进行18个循环。该分析条件不需要ROX染料。总之，三个PCR反应用各种试验进行。每个96孔端粒PCR平板含有具有2NTC孔的(无基因组DNA)排，和10个含有系列稀释为5个浓度的参比DNA标准曲线的孔，每种浓度是双份的，范围在0.25ng/ml(最终浓度)到2ng/ml(最终浓度)。
编码酸性核糖体磷蛋白PO的36B4基因被用于标准化端粒信号(Boulay等，生物技术(Biotechniques)27228-232(1999))。所用的引物是36B4u(5′-CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3′)和36B4d(5′-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3′)。PCR条件为在每个反应的50ul最终体积中含有150nM 6-ROX和0.2x SYBRTM绿I(Molecular Probes，Inc.)；15mM Tris-HCl，pH8.0；50mM KCl；2mM MgCl2；200uM各种dNTP；5mM DTT；1％DMSO；1.25单位AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems，Inc.)；300nM 36B4u引物；和500nM 36B4u引物。热循环模式为95℃下温育10min，接着以95℃×15s(变性)和56℃×1min(变性/延伸)进行30个循环。在第二组条件下不需要ROX染料。
与扩增端粒重复相似，对每个试验DNA样本进行三个36B4 PCR反应。每一个96孔端粒PCR平板含有具有2NTC孔的排(无基因组DNA)和10个含有系列稀释为5个浓度的参比DNA标准曲线的孔，每种浓度是双份的，范围在0.25ng/ml(最终浓度)到2ng/ml(最终浓度)。
所有的PCRs在ABI Prism7700序列检测系统(Applied Biosystems，Inc。，福斯特城，CA，美国)中进行，装备了热循环仪来在每个PCR循环中激发和读取荧光分子的发射。然后用ABI的SDS版本1.7软件来获得每个平板的标准曲线和确定对应于各种样本的T和S含量的标准物的稀释因子。
存在35ng人DNA时，端粒PCR产物可以通过以约9个PCR循环的实时定量PCR检测。在25个循环后通过在琼脂上电泳和用溴乙啶染色的分析显示起始于76个碱基对的产物到约400碱基对的产物的条带(附图4)，76个碱基对等价于端粒特异性引物的长度的总和。PCR拷贝数与第一个PCR循环的引物可以结合的位点数成比例。去除基因组DNA导致在端粒或单拷贝基因引物的25个循环后没有可检测的扩增产物。
实施例2确定相对端粒长度平均端粒限制性片段(TRF)长度按照Slagboom等，美国人基因组杂志(Am.J.Hum.Genet.)55876-882(1994)的描述确定，在此引入作为参考。
大约0.5ug纯化的全血DNA用Hae III限制性酶消化。然后被消化的样本与DNA大小标准物混合，在琼脂凝胶上电泳分离，转移到尼龙膜上。该膜用32P末端标记的寡核苷酸(TTAGGG)7杂交，洗涤以去除非特异性结合的探针，暴露于磷光平板(phosphor plate)1-5天，用磷光图像仪(MolecularDynamics，Inc.)扫描该平板。然后去除斑点上的端粒探针，与放射性探针杂交来确定DNA大小标准，洗涤，暴露于磷光平板，扫描该平板。然后大小标准图像和端粒条带图像被叠加来定位端粒条带的大小间隔的位置。然后以平均TRF长度＝(∑ODi)/(∑ODi/Li)计算平均TRF长度，其中ODi是在间隔i中相对于背景的总放射值，Li是i的平均碱基对长度。整个操作进行两次；即从两个独立试验中得到对各个个体测定的两个平均TRF长度值。
为了测定T/S值(端粒与单拷贝基因的比)，测定用端粒特异性(T)引物和单拷贝基因(S)特异性引物扩增的样本的Ct值-扩增样本所积累荧光超过设定的阈值的部分循环数，该阈值比背景荧光的大数倍标准偏差。由于在每个PCR循环中，PCR产物含量基本上加倍，T/S比接近[2Ct(端粒)/2Ct(单拷贝基因)]-1＝2-ΔCt。平均ΔCt为-9.05(见附图2)。也就是说，单拷贝基因的PCR需要比端粒PCR多约9个以上循环来产生相同的荧光信号，该信号通过实时PCR测定。标准偏差1.48％。
相对T/S比是一个样本的T/S相对于另一个样本的T/S，表示为2-(ΔCt1-ΔCt2)＝2-ΔΔCt。该公式可以计算每种样本的相对T/S比。21名毫不相干的患者的DNA样本通过实时定量PCR扩增和量化(见实施例2)。从PCR计算的相对T/S比的比较与通过Southern杂交测定的平均TRF长度十分相关(见附图3)。Y轴截取值(intercept)约3.6kbp，近似于限制性酶识别位点与端粒六联体重复的起始之间的近端区的平均长度(Hultdin，M.，核酸研究(Nucleic Acids.Res.)263651-3656(1998))。而且在毫不相干的相应年龄和性别的成人中，通过相对T/S比测定的全血中的试验端粒长度在2.5的范围内变化。如果从每个报道的平均TRF长度(Hultdin，M.核酸研究(Nucleic AcidsRes.) 3651-3656(1998)；Vaziri，H.等，美国人基因组杂志(Am.J.Hum.Genet.)52661-667(1993))中减去3.4kbp的平均近端粒(subtelomeric)长度，这种可变性的范围与其它关于在相应年龄的成人中的TRF长度的变化幅度的研究十分吻合。
权利要求
1.一种扩增靶核酸的方法，包括a)将包含基本上互补的第一条链和第二条链的靶核酸与第一引物和第二引物接触，其中所述第一引物杂交到所述第一条链上和所述第二引物杂交到所述第二条链上，其中当被杂交到各自的链时所述被杂交的引物能够引物延伸，和其中所述第一引物的至少一个核苷酸残基被改变以在第一引物和第二引物相互杂交时在所述被改变的残基与所述第二引物的3’末端核苷酸残基之间产生错配；和b)通过聚合酶链式反应扩增靶核酸。
2.按照权利要求1的方法，其中所述第二引物的至少一个核苷酸残基被改变以在第一引物和第二引物相互杂交时在所述第二引物上的所述被改变的残基与所述第一引物的3’末端核苷酸残基之间产生错配。
3.一种扩增靶核酸的重复区域中重复单位的方法，包括a)将包含基本上互补的第一条链和第二条链的靶核酸与第一引物和第二引物接触，其中所述第一引物杂交到所述第一条链的至少一个重复单位上和所述第二引物杂交到所述第二条链的至少一个重复单位上，其中当被杂交到各自的链时所述被杂交的引物能够引物延伸，和其中所述第一引物的至少一个核苷酸残基被改变以在所述被改变的残基与所述第一条链的至少一个重复单位的核苷酸残基之间产生错配，其中当第一引物和第二引物相互杂交时所述被改变残基还与所述第二引物的3’末端核苷酸残基之间产生错配；和b)通过聚合酶链式反应扩增靶核酸。
4.按照权利要求3的方法，其中所述第二引物的至少一个核苷酸残基被改变以在所述第二引物上的所述被改变残基与所述第二条链的至少一个重复单位的核苷酸残基之间产生错配，其中当第一引物和第二引物相互杂交时所述第二引物上的所述被改变残基还与所述第一引物的3’末端核苷酸残基之间产生错配。
5.一种扩增靶核酸的重复区域中重复单位的方法，包括a)将包含基本上互补的第一条链和第二条链的靶核酸与第一引物和第二引物接触，其中所述第一引物杂交到所述第一条链的一个以上重复单位上和所述第二引物杂交到所述第二条链的一个以上重复单位上，其中当被杂交到各自的链时所述被杂交的引物能够引物延伸，和其中所述第一引物的核苷酸残基被改变以在所述被改变的残基与所述第一条链的每个重复单位的相同核苷酸位置上的核苷酸残基之间产生错配，其中当第一引物和第二引物相互杂交时所述被改变残基还与所述第二引物的3’末端核苷酸残基之间产生错配；和b)通过聚合酶链式反应扩增靶核酸。
6.按照权利要求5的方法，其中所述第二引物的核苷酸残基被改变以在所述第二引物的所述被改变残基与所述第二条链的每个重复单位的相同核苷酸位置上的核苷酸残基之间产生错配，其中当第一引物和第二引物相互杂交时所述第二引物上的所述被改变残基还与所述第一引物的3’末端核苷酸残基之间产生错配。
7.按照权利要求3、4、5或6的方法，其中所述第一引物和第二引物还包含不与所述重复单位杂交的5’末端序列。
8.按照权利要求6的方法，其中所述错配位于所述重复单位的邻近核苷酸位置上。
9.按照权利要求6的方法，其中所述错配位于所述重复单位的非邻近核苷酸位置上。
10.按照权利要求3、4、5或6的方法，其中所述重复单位包含六核苷酸重复。
11.按照权利要求3、4、5或6的方法，其中所述重复单位包含五核苷酸重复。
12.按照权利要求3、4、5或6的方法，其中所述重复单位包含四核苷酸重复。
13.按照权利要求4或6的方法，其中所述重复单位包含端粒重复单位。
14.按照权利要求13的方法，其中所述第一引物包含SEQ ID NO1和所述第二引物包含SEQ ID NO2。
15.按照权利要求13的方法，其中所述第一引物包含SEQ ID NO8和所述第二引物包含SEQ ID NO9。
16.一种按照权利要求3、4、5或6确定靶核酸的重复区域中重复单位的数量的方法，还包含测定扩增产物的量(T)。
17.按照权利要求16的方法，其中所述测定是通过实时定量PCR进行。
18.按照权利要求16的方法，还包含a)扩增已知拷贝数的靶核酸(S)；和b)确定T/S比来确定重复单位拷贝数。
19.一种按照权利要求18用于诊断癌症的方法。
20.一种按照权利要求18用于诊断细胞老化的方法。
21.一种用于扩增靶核酸的组合物，所述靶核酸包含基本上互补的第一条和第二条靶链，所述组合物包含第一和第二引物，其中所述第一引物杂交到所述第一条链和所述第二引物杂交到第二条链，其中当被杂交到它们各自的链时所述引物能够引物延伸，和其中所述第一引物的至少一个核苷酸残基改变以在第一引物和第二引物相互杂交时在所述被改变的残基与所述第二引物的3’末端核苷酸残基之间产生错配。
22.按照权利要求21的组合物，其中所述第二引物的至少一个核苷酸残基被改变以在第一引物和第二引物相互杂交时在所述第二引物上的所述被改变的残基与所述第一引物的3’末端核苷酸残基之间产生错配。
23.一种用于扩增靶核酸的重复区域中的重复单位的组合物，所述靶核酸包含基本上互补的第一条和第二条靶链，所述组合物包含第一和第二引物，其中所述第一引物杂交到所述第一条链的至少一个重复单位上和所述第二引物杂交到所述第二条链的至少一个重复单位上，其中当被杂交到它们各自的链时所述引物能够引物延伸，和其中所述第一引物的至少一个核苷酸残基被改变以在所述被改变的残基与所述第一条链的至少一个重复单位的核苷酸残基之间产生错配，其中当第一引物和第二引物相互杂交时所述被改变残基还与所述第二引物的3’末端核苷酸残基之间产生错配。
24.一种按照权利要求23的用于扩增重复区域中重复单位的组合物，其中所述第二引物的至少一个核苷酸残基被改变以在所述第二引物上的所述被改变残基与所述第二条链的至少一个重复单位的核苷酸残基之间产生错配，其中当第一引物和第二引物相互杂交时所述第二引物上的所述被改变残基还与所述第一引物的3’末端核苷酸残基之间产生错配。
25.一种用于扩增靶核酸的重复区域中的重复单位的组合物，所述靶核酸包含基本上互补的第一条和第二条靶链，所述组合物包含第一和第二引物，其中所述第一引物杂交到所述第一条链的重复单位上和所述第二引物杂交到所述第二条链的重复单位上，其中当被杂交到它们各自的链时所述引物能够引物延伸，和其中所述第一引物的核苷酸残基被改变以在所述被改变的残基与所述第一条链的各个重复单位的相同核苷酸位置上的核苷酸残基之间产生错配，其中当第一引物和第二引物相互杂交时所述被改变残基还与所述第二引物的3’末端核苷酸残基之间产生错配。
26.一种按照权利要求25的用于扩增重复区域中重复单位的组合物，其中第二引物的核苷酸残基被改变以在所述第二引物上的所述被改变残基与所述第二条链的各个重复单位的相同核苷酸位置上的核苷酸残基之间产生错配，其中当第一引物和第二引物相互杂交时所述第二引物上的所述被改变残基还与所述第一引物的3’末端核苷酸残基产生错配。
27.按照权利要求21、22、23、24、25或26的组合物，其中所述第一和第二引物还包含不与所述重复单位杂交的5’末端序列。
28.一种按照权利要求24或26的用于扩增重复区域中的重复单位的组合物，其中所述重复单位包含端粒重复单位。
29.一种按照权利要求28的用于扩增所述端粒重复单位的组合物，其中所述第一引物包含SEQ ID NO1和所述第二引物包含SEQ ID NO2。
30.一种按照权利要求28的用于扩增所述端粒重复单位的组合物，其中所述第一引物包含SEQ ID NO8和所述第二引物包含SEQ ID NO9。
全文摘要
本发明提供采用被设计来限制非靶核酸被动引发事件的核酸引物来扩增靶核酸的组合物和方法。本发明可以扩增和量化重复区域中的重复单位的数量，如端粒重复单位的数量。
文档编号C12N15/09GK1639352SQ03804867
公开日2005年7月13日 申请日期2003年1月31日 优先权日2002年1月31日
发明者理查德·考索恩 申请人:犹他州大学