专利名称：感染病治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及对诸如肺结核等感染病进行治疗的感染病治疗剂。
背景技术：
在医疗保健方面，毫无疑问，感染病治疗剂是必不可少的。目前有许多用于感染病的治疗剂，诸如抗生素以及合成抗菌素等，并将这些治疗剂用于医疗保健。
但是，目前主要的用作感染病治疗剂的抗菌剂实际上具有一个不可避免的问题，即耐药性细菌的出现。也就是说，持续着这样一种严峻的状态一旦提供了一种新的抗菌剂，则随之产生了一种新的耐药性细菌。
例如，单一感染病中死亡率占第一位的肺结核最近具有增加的倾向，这已经成为一个世界性的问题。此外，已经证实了对几乎所有抗菌素具有抗性的耐药性细菌的存在，这一问题已经被揭露。
近来，已经揭示，在自然杀伤细胞(NK细胞)或者细胞毒性T淋巴细胞(CTL)中表达的一种叫做颗粒溶解酶分子具有直接杀伤诸如结核分支杆菌等细菌的能力[Stenger，S.et al.，Science 282，121-125(1998)]。
颗粒溶解酶首先被制成15K的一个前体，然后在细胞毒性颗粒内被加工成9K颗粒溶解酶，已知这种9K的颗粒溶解酶具有抗菌活性(Pena，S.V.et al.，J.Immunol，158，2680-2688(1997))。此外，还报道了一种穿孔素刺穿靶细胞的一条路径，其中穿孔素为源于同样的细胞毒性颗粒内的分子，颗粒溶解酶通过该路径进入细胞内，在细胞内杀伤感染细菌[Stenger，S.et.al.，Science 282，121-125(1998)]。
因此，认为颗粒溶解酶在防御感染中发挥了重要的作用。很难想到活性型的9K颗粒溶解酶使细菌获得耐药性，可以考虑采用与抗生素具有不同特征的感染病治疗剂。此外，最近怀疑9K颗粒溶解酶除去细胞内感染细菌的穿孔素路径的存在(David，H.C.et al.，J.Immunol，167，2734-2742(2001))。并且，已认识剑该分子的细胞毒性(Pena，S.V.etal.，J.Immunol，158，2680-2688(1997))，当施用时，恐怕会产生相当大的毒副作用。
本发明要解决的一个问题就是详细研究颗粒溶解酶，并为使用该颗粒溶解酶作为感染病治疗剂提供手段。
发明内容
为了解决这一问题，本发明人进行了详细的研究。结果，本发明人发现了一条新的路径，在该路径中，15K颗粒溶解酶被掺入到巨噬细胞中，然后被活化，从而杀伤被吞噬进巨噬细胞中的细菌。
也就是说，本发明人发现采用本身没有细胞毒性的15K颗粒溶解酶作为活性成分可能为感染提供一种有效的治疗剂，其几乎没有副作用，并且很难使细菌获得耐药性。
本发明提供了一种活性成分为15K颗粒溶解酶的感染病治疗剂(下文将称之为本发明治疗剂)。
再有，在本发明中，所谓15K颗粒溶解酶是分子量为15,000(15k)的一种蛋白质，其含有145个氨基酸，位于上述的细胞毒性颗粒内。在细胞毒性颗粒内，切下15K颗粒溶解酶的一部分，结果15K颗粒溶解酶以分子量为9,000(9k)的蛋白质的形式存在(Pena，S.V.，et al.，J.Immunol.，158，2680-2688(1997)，Stenger，S.，et al.，Science，282，121-125(1998))。
图1显示了15K颗粒溶解酶对结核杆菌的抗菌作用研究的结果。
具体实施例方式
下面将对本发明的实施方案进行描述。
A.本发明治疗剂的活性成分可将从生物体分离的15K颗粒溶解酶作为本发明治疗剂的活性成分，但是由于15K颗粒溶解酶是生物体内的痕量成分，因此优选使用通过编码15K颗粒溶解酶的基因表达得到的重组蛋白。此外，还有一种在生物体内产生15K颗粒溶解酶的适宜方法，即利用其中插入了编码15K颗粒溶解酶的基因的15K颗粒溶解酶的体内表达载体，从而产生作为活性成分的15K颗粒溶解酶。
①15K颗粒溶解酶的重组蛋白质已经报导了编码15K颗粒溶解酶基因的序列(Jongstra，et al.，J.Exp.Med，165，601)，具体地，报导了具有SEQ ID NO1的核苷酸序列的基因以及具有与之相应的氨基酸序列的15K颗粒溶解酶蛋白。据此，有效制备了编码15K颗粒溶解酶的基因，通过表达该基因能够制备15K颗粒溶解酶的重组蛋白质。
具体地，利用与编码15K颗粒溶解酶的基因序列的两端互补的核苷酸链作为扩增引物，通过诸如PCR方法等基因扩增方法来制备编码15K颗粒溶解酶基因的基因扩增产物。
将其转导至适宜的基因表达载体中，通过将该重组载体转染到诸如大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、以及昆虫细胞等适宜的宿主内，由此而得到所需的15K颗粒溶解酶。
本发明所用的基因表达载体优选采用通常在待表达基因的上游区域具有启动子和增强子，并在该基因的下游区域具有转录终止序列的载体。
此外，并不限于只采用直接表达系统来表达15K颗粒溶解酶基因。例如，也可利用β-半乳糖苷酶基因、谷胱甘肽-S-转移酶基因、或者硫氧化还原蛋白基因等融合蛋白表达系统。
对于采用大肠杆菌作为宿主的基因表达载体，有诸如pQE，pGEX，pT7-7，pMAL，pTrxFus，pET，以及pNT26CII等示例。对于采用枯草杆菌作为宿主的载体，有诸如pPL608，pNC3，pSM23，以及pKH80等示例。
此外，对采用酵母作为宿主的载体，有诸如pGT5，pDB248X，pART1，pREP1，YEp13，YRp7以及YCp50等示例。
另外，对采用哺乳动物细胞或者昆虫细胞作为宿主的载体，有诸如p91023，pCDM8，pcDL-SRα296，pBCMGSNeo，pSV2dhfr，pSVdhfr，pAc373，pAcYM1，pRc/CMV，pREP4以及pcDNAI等示例。
可以根据15K颗粒溶解酶表达的目的来选择基因表达载体。例如，当表达15K颗粒溶解酶时，优选选择大肠杆菌、枯草杆菌或酵母为宿主的基因表达载体。当表达虽然量很小但仍具有确切活性的15K颗粒溶解酶时，优选采用哺乳动物细胞或者昆虫细胞做宿主的基因表达载体。
此外，既可以选择上述现有的基因表达载体，当然也可根据目的来制备适宜的基因表达载体并采用该载体。
将插入15K颗粒溶解酶基因的基因表达载体转染至宿主细胞中。所采用的转染方法可以是常规方法，例如，当采用大肠杆菌或枯草杆菌作为宿主细胞时，可采用氯化钙方法和电穿孔方法，当采用哺乳动物细胞或昆虫细胞作为宿主时，可采用磷酸钙方法以及电穿孔方法和脂质体方法。
根据常规方法对得到的转化株进行培养，积聚所需的15K颗粒溶解酶。
可根据宿主正确选择培养介质。例如，当采用大肠杆菌作为宿主时，可恰当选择LB和TB培养基。当采用哺乳动物细胞为宿主时，可恰当选择RPMI1640培养基。
可根据常规方法从所得培养物中分离纯化所得的15K颗粒溶解酶。例如，可利用15K颗粒溶解酶的物理和/或化学性质对培养物进行多种处理从而进行分离纯化。
具体地，可利用蛋白沉淀剂、超滤、凝胶过滤、高效液相色谱、离心、电泳、利用特异性抗体的亲合色谱、以及透析等处理，这些方法可以单独使用，也可以组合使用。
可按照上述方法分离、纯化15K颗粒溶解酶。
在感染病治疗剂中采用15K颗粒溶解酶作为活性成分，将其掺入血液的巨噬细胞中，在此被活化后而杀伤被巨噬细胞吞入其中能引起感染的细菌、病毒以及真菌，籍此可治疗这些微生物所引起的感染。如上所述，与9K颗粒溶解酶不同，15K颗粒溶解酶本身没有细胞毒性，因此预计作为感染病治疗剂而施用后几乎不产生副作用。
②15K颗粒溶解酶的体内表达本发明治疗剂的活性成分的形式是一种重组载体，其中用于表达前述重组蛋白的编码15K颗粒溶解酶的基因被插入至体内表达载体中。
作为体内表达载体，例如可以列举腺病毒载体、逆转录病毒载体等，但不限于此。
对于重组体内表达载体，例如，将15K颗粒溶解酶的可表达基因进一步转导入粘粒载体，其中前述的病毒基因已经转导入该载体，然后将该粘粒载体和用限制性酶处理的母体病毒DNA-TP转染至293个细胞中，从而在293细胞内发生同源重组，因此产生所需的体内表达载体。
B.本发明治疗剂的形式①采用15K颗粒溶解酶重组蛋白作为活性成分的本发明治疗剂在本发明治疗剂的第一种形式中，将15K颗粒溶解酶作为活性成分掺入，同时掺入适宜的药物制剂载体，将其制备成制剂组合物的形式(当然，也可能只有15K颗粒溶解酶)。可根据具体的剂型恰当地从常规使用的药物制剂载体中自由选择适宜的药物制剂载体，例如填充剂、膨胀剂、粘合剂、润湿剂、稳定剂、增溶剂、崩解剂、以及表面活性剂等赋形剂以及稀释剂。并未对制剂组合物的形式作特定限定，只要是15K颗粒溶解酶能有效用于治疗感染病的形式即可。例如，甚至是能配制成诸如溶液、混悬液以及乳剂等可注射形式的固态制剂，诸如片剂、粉末剂、颗粒剂以及丸剂。通过向15K颗粒溶解酶中加入适宜的载体可得到干燥的制剂，使用时，可将该干燥的制剂制成液体。
通过上述方式获得的本发明治疗剂的给药剂量，可根据制剂的给药方法、给药形式、患者的症状等而适宜地选择，并无特别限定。
可根据药物剂型来选择这些多种药物制剂形式的适宜的给药途径，例如，对注射剂型可选择静脉内、肌内、骨内、关节内、皮下、皮内或者腹腔内给药的方式，而对固体剂型则可选择口服或肠道给药的方式。
②15K颗粒溶解酶的体内表达载体作为活性成分的本发明治疗剂通过分离和纯化利用上述方法制备的体内表达载体，并将其施用至生物体内，可在生物体内产生15K颗粒溶解酶，因此显现出15K颗粒溶解酶的药理学作用。
这种情况下的剂型通常为可注射剂型，该治疗剂可采用静脉内、肌内、骨内、关节内、皮下、皮内或腹腔内的给药方式。
可不受特别限制地根据制剂的给药方法、给药形式、患者症状来适宜地选择本发明治疗剂的给药剂量。通常优选制备表达15K颗粒溶解酶的体内表达载体为活性成分，以每日一次或者分成每日数次的适宜剂量来施用该制剂。
实施例下面将对本发明的实施例进行描述。
当15K颗粒溶解酶与巨噬细胞共同存在时对结核杆菌的抗菌效果的研究(1)15K颗粒溶解酶的特异性单克隆抗体的制备在100至200单位/ml的IL-2存在的条件下培养人外周血淋巴细胞(在含有5％CO2的37℃的温箱中，在含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中培养2×106细胞/ml的人外周血淋巴细胞10天)，然后用常规方法提取所得细胞中的RNA，采用该RNA作为模板进行RT-PCR(PCR引物1SEQ ID NO2，PCR引物2SEQ ID NO3)来合成含有编码15K颗粒溶解酶全长蛋白的区域的基因部分[Jongstra et al.，J.Exp.Med，165，601part corresponding to amino acid sequence of SEQ ID NO1]来作为互补DNA(cDNA)的扩增产物。将该编码15K颗粒溶解酶全长蛋白的cDNA掺入至哺乳动物表达载体pRc/CMV或pcDL-SRα296中，将所得的重组载体溶解于生理盐水中，然后用该溶液对小鼠进行皮下或皮内免疫。以1至2周的间隔免疫4至5次后，采用间接荧光抗体法(按照后述的方法进行)发现小鼠脾细胞中抗体滴度增加，利用常规方法使小鼠脾细胞进行细胞融合，再次采用间接荧光抗体法来寻找可产生颗粒溶解酶特异性抗体的杂交瘤细胞。所述间接荧光抗体法也即将上述编码15K颗粒溶解酶的基因转染至细胞中，用4％多聚甲醛固定表达该基因的细胞(Cos7)，用0.5％的吐温20溶解膜，然后将杂交瘤细胞的培养上清加入其中与抗体反应，与荧光标记的抗鼠IgG抗体进行反应，检测荧光，从而筛选出能产生与颗粒溶解酶特异性结合的抗体的杂交瘤细胞。结果，得到了9种能生成与颗粒溶解酶特异性结合的抗体的杂交瘤细胞。对所得的每种杂交瘤细胞的培养上清液进行硫酸铵沉淀并用蛋白G柱进行纯化，制备两种15K颗粒溶解酶的单克隆抗体。下面将其称作单克隆抗体RF10(与15K颗粒溶解酶结合，但不与9K颗粒溶解酶结合)或者单克隆抗体RC8(与15K颗粒溶解酶和9K颗粒溶解酶都结合)。
(2)15K颗粒溶解酶的多克隆抗体的制备采用常规方法用颗粒溶解酶的部分氨基酸序列(29个氨基酸)(J.Exp.Med.165601-614(1987)，J.Exp.Med.，1721159-1163(1990))Arg Thr Gly Arg Ser Arg Trp Arg Asp Val Cys Arg Asn Phe Met ArgArg Tyr Gln Ser Arg Val Thr Gln Gly Leu Val Ala Gly(N5-1SEQ IDNO4)与嘁血蓝蛋白的结合物来免疫兔，以获得抗血清。利用硫酸铵沉淀和蛋白G柱来纯化所得抗血清，然后用结合有前述合成肽(N5-1)的柱进行亲合色谱来进一步纯化，以此制备颗粒溶解酶的多克隆抗体(抗N5-1抗体)。
(3)含有颗粒溶解酶的培养上清液的制备利用常规方法将SEQ ID NO1核苷酸序列中编码15K颗粒溶解酶蛋白部分的核苷酸序列的核苷酸链掺入至pFLAG-CMV载体中(Sigma制造)，制备基因重组载体。采用未与基因重组的pFLAG-CMV载体作为对照。将上述每一基因重组载体转染至Cos7细胞中，然后利用DMEM培养基(Gibco制造)在含有5％CO2的37℃条件下培养72小时。完成培养后，将培养物离心(2500rpm·20min·4℃)，得到培养上清液。
将每一培养上清液中的蛋白质用SDS-PAGE分离。当将蛋白质从SDS-PAGE电泳凝胶上转移至尼龙膜上后，将该膜用封闭溶液(1％脱脂乳/洗涤溶液)封闭，将15K颗粒溶解酶特异性RF10单克隆抗体与膜结合，再加入酶标记抗鼠抗体和显色底物进行结合。结果，编码15K颗粒溶解酶蛋白的基因所表达得到的上清液中出现了分子量为15K的条带。但是在对照中，并未发现该条带。此外，当采用与15K和9K颗粒溶解酶结合的多克隆抗体N5-1进行类似实验时，可观察到15K的条带，但是不能看到9K的条带。
上述结果揭示，15K颗粒溶解酶特异性存在于前述的颗粒溶解酶培养上清液中，但是颗粒溶解酶并未存在于对照培养上清液中。
(4)抗菌效果的研究按照常规方法将从人血液中分离的淋巴细胞悬浮于培养液(RPMI1640，10％人血清)中，使每1ml含有约2×107个细胞，置于塑料培养板(24孔/板)中，每孔分入1ml，于37℃培养24小时，淋巴细胞黏附于培养板壁表面，在这些黏附的巨噬细胞中研究15K颗粒溶解酶的抗菌效果。
然后，每孔中加入1ml的RPMI1640(含有10％人血清)，在5％CO2条件下于37℃静态培养结核杆菌(H37Rv，1×105至1×106cfu)4至12小时，从而用结核杆菌感染巨噬细胞。感染完成后，向孔中分别加入1ml含有15K颗粒溶解酶的上清液(Grn上清液)和不含有15K颗粒溶解酶的上清液(Cont上清液)，在同样的条件下静态培养2至12小时。
完成培养后，移去培养上清液，用PBS洗涤黏附于板上的细胞3次，用总共5ml的1％皂角甙水溶液提取细胞中的结核杆菌，稀释提取液，种于平板琼脂培养基上[7H11(Gibco制造)]，将其在37℃静态培养14天，计数菌落数。
结果如图1所示。
在图1中，Cont表示对照培养上清液，Grn表示颗粒溶解酶培养上清液。纵坐标轴表示菌落数。在横坐标轴上，1表示如上所述将巨噬细胞、结核杆菌以及培养上清液接触后的结果。2与1相同，表示只是在不含巨噬细胞的情况下，对各培养上清液和结核杆菌进行静态培养，洗涤之后，在7H11平板琼脂培养基上进行静态培养，并确认结核杆菌在板内的非特异性吸附的影响结果。3表示每1ml培养上清液和结核杆菌在前述的培养板中于37℃培养2小时，然后在7H11平板琼脂培养基中进行静态培养的结果。
结果发现15K颗粒溶解酶通过巨噬细胞的参与起到了抗菌作用。当没有巨噬细胞的参与时，并未发现15K颗粒溶解酶对结核杆菌的抗菌作用。
由前述的试验例可以看出，15K颗粒溶解酶具有抗菌活性，表明15K颗粒溶解酶可用作感染治疗剂的有效成分。
已有报导，当15K颗粒溶解酶转染至诸如Cos7细胞、HeLa以及PC12等的细胞中时，在培养上清液中可检测到15K颗粒溶解酶，但未观察到细胞损伤。而在穿孔素存在下以9K颗粒溶解酶代替15K颗粒溶解酶时，则诱导细胞毒活性或细胞凋亡(Pena，S.V.et al，J.Immunol.，158，2680-2688(1997))。
工业实用性本发明提供了一种有效治疗感染的治疗剂，其中含有作为活性成分的15K颗粒溶解酶，该治疗剂没有观察到副作用。
序列表<110>株式会社BML国立疗养所近畿中央病院冈田全司<120>感染病治疗剂<130>PBM67/PCT<150>JP2002-45865<151>2002-02-22<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>745<212>DNA<213>人类<220>
<223>发明人冈田全司发明人高森靖发明人小川一行发明人永田钦也<220>
<221>CDS<222>(129).(563)<223>
<400>1gtatctgtgg taaacccagt gacacggggg agatgacata caaaaagggc aggacctgag 60aaagattaag ctgcaggctc cctgcccata aaacagggtg tgaaaggcat ctcagcggct120gccccacc atg gct acc tgg gcc ctc ctg ctc ctt gca gcc atg ctc ctg 170Met Ala Thr Trp Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Met Leu Leu1 5 10
ggc aac cca ggt ctg gtc ttc tct cgt ctg agc cct gag tac tac gac 218Gly Asn Pro Gly Leu Val Phe Ser Arg Leu Ser Pro Glu Tyr Tyr Asp15 20 25 30ctg gca aga gcc cac ctg cgt gat gag gag aaa tcc tgc ccg tgc ctg 266Leu AlaArg Ala His Leu Arg Asp Glu Glu Lys Ser Cys Pro Cys Leu35 40 45gcc cag gag ggc ccc cag ggt gac ctg ttg acc aaa aca cag gag ctg 314Ala Gln Glu Gly Pro Gln Gly Asp Leu Leu Thr Lys Thr Gln Glu Leu50 55 60ggc cgt gac tac agg acc tgt ctg acg ata gtc caa aaa ctg aag aag 362Gly Arg Asp Tyr Arg Thr Cys Leu Thr Ile Val Gln Lys Leu Lys Lys65 70 75atg gtg gat aag ccc acc cag aga agt gtt tcc aat gct gcg acc cgg 410Met Val Asp Lys Pro Thr Gln Arg Ser Val Ser Asn Ala Ala Thr Arg80 85 90gtg tgt agg acg ggg agg tca cga tgg cgc gac gtc tgc aga aat ttc 458Val Cys Arg Thr Gly Arg Ser Arg Trp Arg Asp Val Cys Arg Asn Phe95 100 105 110atg agg agg tat cag tct aga gtt acc cag ggc ctc gtg gcc gga gaa 506Met Arg Arg Tyr Gln Ser Arg Val Thr Gln Gly Leu Val Ala Gly Glu115 120 125act gcc cag cag atc tgt gag gac ctc agg ttg tgt ata cct tct aca 554Thr Ala Gln Gln Ile Cys Glu Asp Leu Arg Leu Cys Ile Pro Ser Thr130 135 140ggt ccc ctc tgagccctct caccttgtcc tgtggaagaa gcacaggctc 603Gly Pro Leu145ctgtcctcag atcccgggaa cctcagcaac ctctgccggc tcctcgcttc ctcgatccag663aatccactct ccagtctccc tcccctgact ccctctgctg tcctcccctc tcacgagaat723aaagtgtcaa gcaagaaaaa aa 745
<210>2<211>24<212>DNA<213>Homo sapiens<400>2catctcagcg gctgccccac catg24<210>3<211>27<212>DNA<213>Homo sapiens<400>3tgtatacctt ctacaggtcc cctctga 27<210>4<211>29<212>PRT<213>Homo sapiens<400>4Arg Thr Gly Arg Ser Arg Trp Arg Asp Val Cys Arg Asn Phe Met Arg1 5 10 15Arg Tyr Gln Ser Arg Val Thr Gln Gly Leu Val Ala Gly20 2权利要求
1.一种感染病治疗剂，其含有作为活性成分的15K颗粒溶解酶。
2.权利要求1的感染病治疗剂，其中，15K颗粒溶解酶是重组蛋白质。
3.一种感染病治疗剂，其包含作为活性成分的15K颗粒溶解酶的体内表达载体，该载体中掺入了编码15K颗粒溶解酶的基因。
全文摘要
本发明人发现了一条新的路径，其中本身没有细胞毒性的15K颗粒溶解酶被掺入至巨噬细胞中并被活化，从而杀伤进入巨噬细胞内的细菌。本发明人还发现采用上述15K颗粒溶解酶作为活性成分可提供一种有效的感染病治疗剂，该治疗剂几乎没有副作用，细菌对其难以产生耐药性，即提供一种含有作为活性成分的15K颗粒溶解酶的感染病治疗剂。
文档编号C12N15/09GK1635902SQ0380433
公开日2005年7月6日 申请日期2003年2月24日 优先权日2002年2月22日
发明者冈田全司, 高森请, 小川一行, 永田钦也 申请人:独立行政法人国立病院机构, 冈田全司, 高森靖, 株式会社Az生物器材