专利名称：果糖二磷酸钠发酵生产方法
技术领域：
本发明属微生物发酵技术领域，是一种果糖二磷酸钠的发酵生产方法。
果糖二磷酸钠(Fructose-1，6-Diphosphate Trisodium Salt，简称FDP)是一种应用于急性心肌梗塞、心功能不全、冠心病、心肌缺血发作、休克等病的急救良药。其发酵生产方法主要有意大利福斯卡玛(FOCAMA)生化制药公司于提出的方法和日本TOCHIKURA等提出的方法。FOSCAMA的方法是用新鲜酵母、葡萄糖、磷酸氢二钠、磷酸、甲苯等基质一起发酵，发酵后用盐酸沉淀去除蛋白质，滤液调PH至中性，加氯化钙成FDP钙盐沉淀，用水反复洗涤沉淀物，除去可溶杂质，然后转变成钠盐，超滤，冻干成干粉。TOCHIKURA的方法是将磷酸盐缓冲液0.33M、葡萄糖27g、一磷酸腺苷等(AMP)1g、干酵母15g，37℃培养4小时，基于糖的消耗，转化率为85%。用离子交换法处理，得到23g纯度为75%的FDP钡盐。一磷酸腺苷(AMP)、三磷酸腺苷(ATP)、乌苷酸或其他嘌呤衍生物，磷酸盐瓦片一起培养，可提高产量。FOSCAMA方法的缺点是，用甲苯处理酵母，甲苯挥发性大，有毒性。用氯化钙处理成FDP钙盐沉淀时，其他磷酸盐杂质有共同沉淀，不易除净，致使FDP产品纯度不高。此外，FDP的冻干品极易吸湿，不易包装保存，冻干设备也较复杂。TOCHIKURA的方法缺点是，发酵中加入的AMP、ATP、乌苷酸等物质较多，成本较高，发酵4小时，时间较短，FDP转化波动性大，工业生产难以掌握。用离子交换法提取，结果纯度只有75%，不但纯度低，而且得到产品是FDP钡盐。
本发明的目的在于提供一种能够提高FDP产率和产品纯度的FDP发酵生产方法。
本发明提出的FDP发酵生产方法，包括微生物发酵合成、离子交换法提取，溶液结晶法精制等步骤。其中，以磷酸盐、葡萄糖作为基质，用啤酒酵母发酵合成，用溴苄烷铵作为醛缩酶活力控制剂，控制发酵过程，以提高FDP的产率;发酵液经去离子水稀释后，直接上阴离子树脂柱提取，用稀盐酸洗脱磷酸盐等杂质;然后，根据FDP浓度和氯化钠浓度调整FDP三钠盐的PH范围，用乙醇溶剂结晶，即获得含八个分子结晶水的FDP三钠盐。
上述方法的发酵步骤中，发酵混悬液的组份浓度按重量(g)/体积(ml)计，其比例如下葡萄糖5±1%，磷酸二氢钠3±1%，(或用其他磷酸盐如磷酸、磷酸氢二钠等)。啤酒酵母浆20±5%，溴苄烷铵0.01～0.02%，加水到总体积100ml，其中发酵基质液用氢氧化钠调PH至6.5～7.0，配料完毕后调整温度于37℃±3℃，进行静止发酵。在发酵过程中测定无机磷下降值以控制发酵进程，待无机磷下降到原磷的80%左右(一般为80±3%)时，再加入过量溴苄烷铵(为起始用量的2～4倍)，终止发酵。整个发酵时间一般不少于8个小时。
上述方法提练步骤中，可将发酵液用5～10倍的去离子水稀释，自然澄清，用表面虹吸的方法上717阴离子树脂柱吸附FDP。上柱后用0.008～0.012M的稀盐酸洗脱杂质，一直洗到流出液中磷酸根反应合格为止(用洗脱液作对照，不大于或稍大于对照)，然后用浓度为5～7%的氯化钠水溶液解析FDP。用测定FDP含量，以及测定磷酸盐、硫酸盐、钙盐等杂质，进行中间控制。
上述方法的精制步骤中，可在FDP的解析液中加入0.5%左右的活性碳脱色，脱热原，过滤。对滤液用氢化钠调PH至5.5～5.6，在搅拌下加入1.6～2倍的乙醇，使FDP呈浆状析出，分离浆状物，并用浓度为65～70%的乙醇，反复洗涤浆状物，直至其中的氯化物合格为止(即氯离子反应不超过1000ppm)，然后将FDP浆状物移至结晶桶内静止或动态结晶，一般为10小时以上。对FDP结晶用浓度为60±2%的乙醇水溶液研磨洗涤，最后用浓度为95%的乙醇浸泡，离心甩干、结晶于37℃以下烘干，即获得含8个分子结晶水的FDP三钠盐，总收率达80%以上，纯度达99%以上。
本发明中控制指标的测定方法如下(1)无机磷测定钼兰比色法。
(2)FDP含量测定酶法意大利方法提供。
(3)FDP含量测定中和法(PH滴定)根据PH4.0至9.5之间消耗的碱计算FDP含量。
(4)硫酸盐检查硫酸钡比浊法。
(5)氯化物检查氯化银比浊法。
(6)钙盐检查草酸钙比浊法。
本发明在发酵液中加入溴苄烷铵的作用机制在于抑制糖酵解通道中的醛缩酶部位，而对已糖激酶和磷酸果糖激酶以及其他酶类的活性的影响可能不大。但加入溴苄烷铵的量要适当，太多了可使醛缩酶的活性完全抑制，以致发酵停止，FDP不再转化。溴苄烷铵的加入量要适宜，要留一个代谢通道，使一部分糖代谢继续下去以提供转化FDP所需的能量ATP。
从已知的糖代谢途径可以看出，FDP的生成不是单纯的酶促反应，而是伴随着能耗的，一个葡萄糖分子磷酸化生成FDP需要消耗两分子ATP，而一个FDP分子代谢到丙酮酸可产生四个分子ATP，因而只有消耗一分子FDP才能满足产生二分子FDP所需能量，所以允许一部FDP分解是必须的。
关于葡萄糖与磷酸盐投料比例，从化学反应上来看它们的重量比为0.72∶1，从生物合成上来看是1.5∶1。但在实际发酵中，考虑到能量消耗在蛋白质，细胞等合成方面之因素，因此，葡萄糖的用量常取磷酸盐的重量二倍左右。
本发明中溴苄烷铵对醛缩酶的活力影响是通过醛缩酶分解FDP的定量变化来表示的。FDP的定量变化系根据分解FDP的同时定量的引起还原型辅酶Ⅰ变化成氧化型辅酶Ⅰ的光度变化△E来确定的。
FDP的浓度(M)＝ (△E)/(6.22×103×2)6.22×108为还原型辅酶Ⅰ在430um的摩尔吸收度。
2为一分子FDP消耗辅酶Ⅰ的分子数。
在醛缩酶的活力测定系统中，加入一定量的溴苄烷铵，醛缩酶的活力受到抑制，
图1所示，0-0线表示加溴苄烷铵的情形，△-△线表示未加溴苄烷铵的情形。
本发明中无机磷变化百分比是以原磷为基础比较而得的，图2说明在葡萄糖、磷酸盐、酵母发酵系统中，加入不同量的溴苄烷铵引起无机磷的变化。图中，X-X线表示适当量溴苄烷。0-0线表示过量溴苄烷铵，△-△线表示未加溴苄烷铵。
FDP三钠盐的PH范围随着FDP本身的浓度变化而变化的，通常10%的浓度时PH在5.6～6.0左右，另外，FDP从树脂上解析下来的溶液中有大量氯化钠存在，氯化钠的浓度也影响着FDP的PH。因此要根据FDP的浓度和氯化钠浓度调节解析液的PH。根据测得的结果FDP的PH以调在5.5～5.6为妥，这样的PH在用乙醇沉淀结晶时，FDP正好成为三钠盐结晶出来。PH过高，FDP成四钠盐析出，不稳定，色度易变黄。PH过低，FDP成二钠盐析出，不易成固体结晶，产品发沾，结晶水不固定，稳定性不准。
本发明与现有技术相比有如下优点1.转化率高。发酵中加入溴苄烷铵能使FDP大量积累，FDP的单位浓度可以达到30000r以上。如果不加溴苄烷铵，FDP的积累只保持在一般底物水平，为100-500r左右，一般没有工业提取价值。
2.纯度高。由于用离子交换法提取，稀盐酸洗脱分离杂质，并经溶剂结晶精制，FDP的纯度达到99%以上。
3.工艺稳定安全性好。由于FDP的转化机制明确，在发酵过程中可以适时地添加溴苄烷铵，使FDP转化达到预定指标，确保高产稳产。此外，溴苄烷铵还能抑制杂菌感染，给发酵和提练带来十分有利条件。
图1为溴苄烷铵对醛缩酶活性的影响示意图。
图2为溴苄烷铵对发酵过程中无机磷转化影响示意图。
实施例1将葡萄糖50kg，磷酸二氢钠30kg，啤酒酵母浆200kg，溴苄烷铵100g，加水至总体积9001，PH6.7，37℃恒温发酵，10个小时终止发酵，发酵液稀释5倍，上717阴柱吸附，用0.01M稀盐酸洗脱杂质，6%氯化钠解析FDP解析液，经活性碳脱色，滤液调PH5.5，加入2倍量体积的乙醇，60%浓度的乙醇洗涤FDP浆状物、静止结晶10小时，经离心脱水37℃烘干其结果1.发酵的无机磷转化率85%;2.FDP发酵单位36000r;3.提取收率85%;4.结晶精制获得FDP三钠盐结晶20.5kg;5.纯度99.5%。
实施例2 将葡萄糖60kg，磷酸二氢钠35kg，啤酒酵母浆250kg，溴苄烷铵150g，总体积9001，PH7.0，37℃至40℃发酵，12小时终止发酵，发酵液稀释7倍，上717阴柱吸附，用0.008M稀盐酸洗脱杂质，6.5%氯化钠解析FDP，解析液经活性炭脱色，滤液调PH5.6，加入1.8倍乙醇析出FDP浆状物，用60%浓度的乙醇洗涤FDP浆状物，静置12小时结晶，结晶经洗涤离心脱水，37℃以下烘干，其结果如下1.发酵的无机磷转化率80%，2.FDP发酵单位35000r，3.提取收率86%，4.结晶精制获得FDP三钠盐结晶20.8kg，5.纯度99.4%。
实施例3 将葡萄糖45kg，磷酸二氢钠25kg，啤酒酵母浆180kg，溴苄烷铵200g，总体积10001，PH7.0，37℃-40℃发酵，15小时终止发酵。发酵液稀释6倍上阴柱吸附，用0.012M稀盐酸洗脱杂质，用5%氯化钠解析FDP，解析液经活性炭脱色并过滤，滤液调PH5.54，加入1.8倍体积乙醇，析出的FDP浆状物用60%浓度的乙醇洗涤，静置结晶16小时，结晶经洗涤、离心、脱水，37℃以下烘干，其结果如下1.发酵的无机磷转化率83%，2.发酵单位(FDP)30000r，3.提取收率85.5%，4.获结晶FDP三钠盐18.9kg，5.纯度99.7%。
以上工艺经重复70个批次量统计无机磷转化83±5.1%，发酵单位以FDP(ug/ml)计35000±5000r，提取收率84.96±14%，产品重量19.1±4.0kg，产品纯度99±1.0%。
权利要求
1.一种果糖二磷酸钠(FDP)的发酵生产方法，包括微生物发酵合成、离子交换法提取、溶济结晶法精制等步骤，其特征在于以磷酸盐、葡萄糖作为基质，用啤酒酵母发酵，用溴苄烷铵作为醛缩酶活力控制剂，控制发酵过程；发酵液经去离子水稀释后直接上阴离子树脂柱提取，用稀盐酸洗脱磷酸盐等杂质；然后，根据FDP的浓度和氯化钠浓度调整FDP三钠盐的PH范围，用乙醇溶剂结晶，获得含八个结晶水FDP三钠盐。
2.根据权利要求所述的FDP的发酵生产方法，其特征在于上述发酵步骤中发酵混悬液的组份浓度按重量(g)/体积(ml)计，其比例如下葡萄糖5±1%，磷酸盐(采用磷酸二氢钠)3±1%，啤酒酵母浆20±5%，溴苄烷铵0.01～0.02%，加水到总体积100ml。
3.根据权利要求2所述的FDP发酵生产方法，其特征在于按组份配料后将发酵液用氢氧化钠调至6.5～7.0，调温度于37±3℃，进行静止发酵，在发酵过程中测定无机磷的下降值以控制发酵过程，至无机磷下降到原来磷的80±3%时，再加入过量溴苄烷铵，用量为起始用量2～4倍，以终止发酵。
4.根据权利要求3所述的FDP发酵生产方法，其特征在于提练步骤中，将发酵液用5-10倍的去离子水稀释，自然澄清，用表面虹吸的方法上717阴离子树脂柱吸附FDP，然后用0.008～0.012M的稀盐酸洗脱杂质，直至流出液中磷酸根反应合格为止，然后用浓度为5～7%的氯化钠水溶液解析FDP。
5.根据权利要求4所述的FDP发酵生产方法，其特征在于精制步骤中，在FDP的解析液中加入0.5%左右的活性炭脱色，脱热原，过滤，对滤液用氢氧化钠调PH至5.5～5.6，在搅拌下加入1.6-2倍的乙醇，使FDP浆状析出，分离浆状物，并用浓度为65～70%的乙醇溶液反复洗涤FDP浆状物以除去氯化物，然后静止或动态结晶，结晶用浓度为60%的乙醇再次洗涤研磨，最后用95%乙醇浸泡，离心，甩干，结晶于37℃以下烘干。
全文摘要
本发明是一种能够提高FDP产率和纯度的FDP的微生物发酵生产方法。以葡萄糖，磷酸二氢钠为基质用啤酒酵母发酵，加入溴苄烷铵作为醛缩酶抑制剂，促进FDP的积累，发酵液稀释后直接上阴离子树脂柱提取，用稀盐酸洗脱杂质，用乙醇结晶纯化FDP，成为含八个结晶水FDP三钠盐。本发明发酵转化率以无机磷消耗计达到88％，FDP发酵单位达到40000r左右，FDP产品纯度达99％，经数拾批次连续中试生产成功率98.6％，工艺稳定，适合于工业生产。
文档编号C12P19/02GK1089655SQ93112310
公开日1994年7月20日 申请日期1993年1月12日 优先权日1993年1月12日
发明者徐汉标, 赵山银 申请人:中国人民解放军海军医学研究所