扩增多个识别用核酸序列的方法

专利名称：：扩增多个识别用核酸序列的方法
技术领域：
：本发明涉及核酸的扩增反应技术。
背景技术：
：人的SNP(单核苷酸多态性，SingleNucleotidePolymorphism,艮卩1碱基多型)为以在数百个碱基中有1个左右的频率可见的基因多型。它们的变异无论是编码还是非编码均广泛地散布存在于基因组上。另外，其变异不仅是碱基的取代，还可见碱基的插入(嵌入)或缺失(欠缺)。人基因组的大小为30亿碱基对，因此即便以在1000个碱基中有1个的比例存在这种多型，整体上也存在有300万的SNP。因此，从这种庞大数量的SNP中发现医学上有用的是很困难的。例如，为了明确SNP与疾病或SNP与药剂敏感性等的相关性，通过检测尽量多的样品，可以高精度地将相关SNP进行特定。为此，首先要构成仅可以获得统计学上显著的结果的数量的病例组和对照组。接着，对各个组以必要的密度和数量来检测疑有相关性的SNP，然后确定这些SNP型，即进行分型(typing)。之后，必须进一步分析与疾病或药剂敏感性等的相关性。桑格法(Sangermethod,决定核酸构造法之一)为使用DNA测序仪进行分型的方法。进行测序时，也可确定SNP周围的碱基序列，也可知插入或缺失，但用于扩增SNP的某个基因的引物的设计却很困难，测序反应的试剂、装置也很昂贵。另外，在一次测序中可以分型的SNP的数量根据其平均间隔和能够测序的碱基长，平均为1处或2处左右。利用这样可靠性高的桑格法，一次研究的SNP的数量有限，且花费时间和成本。因此，在为了明确疾病与SNP的关系的研究中，不得不缩小成为对象的基因的范围而进行分型。多重法(multiplexmethod)是作为SNP等基因的分析方法而在卯年代后期被提出的方法。例如，康奈尔大学(CornellUniversity)的Barany等人开发出了下述方法通过将成为LDR(即连接酶检测反应，ligasedetectionreaction)的使用了连接酶的SNP检测方法和将目标核酸序列转换成称为邮编(zip-code)的标签(tag)的手段进行组合，从而在同一反应液中检测多个SNP。该方法目前作为ABI公司的检测试剂盒SNPlex而商品化(日本特表2000-511060号公报、日本特表2001-519648号公报、日本特表'2004-526402号公报)。OrchidCellmark公司提供了下述称为SNP-IT的方法在1个反应液中进行检测反应，并利用配置于微孔板底部的微阵列来区分48种阵列(日本专利第3175110号说明书、日本特表2002-508664号公报)。目前认为最成功的是Illumina公司提供的方法。该方法在进行聚合酶延长反应和连接酶的连接反应来检测SNP后，将目标核酸序列转换为邮编序列，通过使用与微阵列相同系统的独自的检测设备(称为微珠阵列，BeadArray)，从而同时检测最多约为1500种的邮编序列(日本特表2002-519637号公报、日本特表2003-521252号公报)。TMBioscience公司提供了利用用Luminex公司的荧光而分色过的微珠来进行检测的多重反应试剂盒(日本特表2004-522440号公报、日本特表2004-526433号公报)。其作为研究用途的遗传病检测试剂盒被提供。Parallele公司提供了MIP(分子倒置探f十，molecularinversionprobe)法。其提供了利用开环探针和间隙连接反应(gapligation)法，并使用降低探针合成成本、提高反应效率的标签所进行的多重分型法(Hardenbol,P.etal.，Nat.Biotechnol.21,673-678(2003)、Hardenbol，P.etal"GenomeRes.15，269-675(2005))。上述多重技术中，一般来说，按照在标签两侧使通用引物相邻的方式或者介由其它序列来挟持标签的方式来配置通用引物序列而构成。利用这种标签的多重法(以下也称为标签多重法)作为用于分析SNP的有效手段而提出。使用了标签的多重法包括将天然的基因序列转换为称为标签的人工序列的反应和检测转换后的标签的过程。多重反应中，由于在一个反应溶液内将多个基因一对一对应地转换为标签来迸行检测，因此标签序列具有2个特征。首先，第1个特征为各个标签不会相互地交叉杂交，而是独立地进行反应。第2个特征为由于在同一溶液中同时地反应，因此按照熔解温度(即Tm值)一致的方式来设计。标签多重法与用探针捕获基因序列本身的微阵列不同，其与基因的对应是自由的。因此，在检测阶段中经常可以检测相同的标签，即便检测对象的基因改变，由于使用相同的检测手法和检测设备，因此还是具有灵活性。而且，在上述以往的标签多重法中，还包括利用与标签一起含有的通用引物，通过PCR扩增而将标签进行扩增。在该扩增后检测标签。将以往的方法中所用的检测用核酸的1例示于图1中。该例中使用2个检测用核酸。检测用核酸1从5，侧开始具有通用引物序列3、识别用核酸标签4、待测基因互补序列5。检测用核酸2从3'侧开始具有通用引物序列6和待测基因互补序列7。例如，将图1的检测用核酸1和2用于邮编法中时，检测用核酸1的3'末端还含有与要检测的SNP互补的碱基8，利用邻接设计的检测用核酸1和检测用核酸2所含的各个引物序列，且依赖于要检测核酸的存在来进行标签的扩增。并非限于这种邮编法，在许多以往的标签多重法中，使用检测用核酸，利用其中所含的引物，根据成为检测对象的核酸的存在来扩增该标签。使用了这种以往的标签序列的多重法中，在标签序列的PCR扩增时，所扩增的标签序列偏向特定的标签序列而为较高的扩增率，或者相反地，对于特定的标签序列为较低的扩增率，这样，在该扩增率中存在偏差，从而所得扩增产物的量也产生偏差。
发明内容鉴于上述状况，本发明的目的在于提供用于扩增多种识别用核酸的方法。本发明的另一个目的在于提供在利用标签的多重检测中，对于所扩增的多个标签，其扩增量的偏差较小的方法。为了解决上述目的，本发明提供以下的手段。艮P-(1)扩增多个核酸片断的方法，所述核酸片断包含选自由第l第n的识别用核酸序列所构成的第1组中的1个识别用核酸序列和选自由第1~第m的扩增用核酸序列所构成的第2组中的1个扩增用核酸序列，所述方法包括在可以扩增核酸的条件下，通过使用与有可能存在于所述核酸片断混合物中的全部识别用核酸序列和扩增用核酸序列的至少一部分的序列互补的序列或相同链侧的序列作为引物，从而将含有多种所述核酸片断的核酸片断混合物进行扩增；这里，n为2以上的整数，第1组中所含的第1第n的识别用核酸序列的碱基序列互不相同，m为ln的整数，第2组中所含的第l第m的扩增用核酸序列的碱基序列互不相同；和(2)用于在上述(1)所述的方法中使用的试剂盒，其含有第1第n的多个引物、通用引物、核酸扩增用酶、缓冲液成分和dNTP混合物。图1为表示以往方法所用的检测用核酸的示意图。图2为表示使用2个通用引物的以往扩增的示意图。图3为表示本发明概念的示意图。图4为表示利用本发明方法的基因分析法的1例的流程图。图5为表示以往基因分析法的1例的流程图。图6为表示以往检测用核酸的示意图。图7为表示以往检测用核酸的示意图。图8为表示以往检测用核酸的示意图。图9为表示以往检测用核酸的示意图。图10为示意地表示图8的检测用核酸的反应的图。图11为表示实施例中进行的检测的结果的曲线图。图12为通用引物PCR的分布图和利用标签混合物(tagmix)PCR得到的分布图。图13为通用引物PCR的分布图和利用标签混合物PCR得到的分布图。符号说明1检测用核酸、2检测用核酸、3通用引物序列、4识别用核酸标签、5待测基因互补序列、6通用引物序列、7待测基因互补序列、8与SNP互补的碱基、21核酸片断、22第l通用引物结合部位、23识别用核酸序列、24第1基因互补序列、25第2基因互补序列、26第2通用引物结合部位、27第1通用引物、28第2通用引物、31核酸片断、32识别用核酸序列、33第l基因互补序列、34第2基因互补序列、35扩增用核酸序列、36通用引物、37全识别用核酸引物混合物、42多个引物、43PCR产物、44寡核苷酸组、45标记化了的引物、46SNP、47磁珠、48标签混合物引物、49a第1标记化通用引物、49b第2标记化通用引物、50连接核苷酸、51荧光标记了的PCR产物、52微阵列、53探针固相区域、54固相化探针、55荧光标记了的PCR产物、60通用引物、61a第l标记化通用引物、61b第2标记化通用引物、70、72检测用核酸、73第1通用引物序列、74识别用核酸标签、75待测基因互补序列、77第2待测基因互补序列、78第2通用引物、100切断序列、101基因组DNA具体实施方式1.识别用核酸的扩增方法简单地说明扩增多种识别用核酸的方法的概念。首先，图2示意地表示了一般的以往方法。这里，为了方便，着眼于l个核酸片断来进行说明，但在实际实施时是对多个核酸片断进行反应。参照图2(A)。在以往的方法中，如上所述，使用2个通用引物。因此，核酸片断21包含识别用核酸序列23、第1通用引物结合部位22、第1基因互补序列24、第2基因互补序列25和第2通用引物结合部位26。该核酸片断21的扩增中使用第1通用引物27和第2通用引物28，在可以扩增核酸的条件下被扩增(图2(A))。结果，所得扩增产物的一部分以图2(B)所示的核酸片断的形式而获得。接着，简单地说明根据本发明的扩增多种识别用核酸的方法的概念。这里，为了方便，着眼于1个核酸片断来进行说明，但在实际实施时是对多个核酸片断进行反应。参照图3(A)。核酸片断31包含识别用核酸序列32、第1基因互补序列33、第2基因互补序列34和扩增用核酸序列35。该核酸片断31的扩增中使用具有与扩增用核酸序列35互补的序列的通用引物36和全识别用核酸引物混合物37，在可以扩增核酸的条件下被扩增(图3(B))。如上所述，根据本发明方式的识别用核酸的扩增方法中，以往包括用于与所用2种通用引物进行杂交的第1通用引物结合部位和第2通用引物结合部位(参照图2(A))。而与此相对，本发明中，不含相当于图2(A)所示的第1通用引物结合部位22的序列(参照图3(A))。艮P，如图3(A)所示，本发明方式的核酸片断中包含识别用核酸序列32，并使用具有与其互补或部分互补的序列的识别用核酸引物37，根据序列杂交于识别用核酸序列32。另外，这里的扩增需要进一步的引物，但该引物只要是具有能够与扩增用核酸序列35杂交的序列的通用引物36即可。例如，可以是与该扩增用核酸序列互补的序列或部分互补的序列、或者至少一部分相同的序列。本发明的方式中，"扩增用核酸序列"相当于以往所称的"通用引物结合部位"，因此与其杂交的引物也可以称为"通用引物"。另外，本发明中，由于与"扩增用核酸序列"发生杂交而作为引物发挥功能，因此也可称为"扩增用核酸引物"，还可以交替使用"通用引物"和"扩增用核酸引物"。这里使用的"通用引物"是指具有从扩增用核酸序列的碱基序列相应选择的碱基序列，在含有全部或几个不同的识别用核酸序列的多个核酸片断混合物中，可以通用地含有由特定碱基序列构成的扩增用各序列。由此，还可以相对于多种核酸片断通用地使用。另外，本发明的方式中，通用引物具有与1个扩增用核酸序列完全或部分杂交的序列，且可以带有不同的标记，在l个识别用核酸的扩增体系中同时使用多种。例如可以如下设计制成能够识别通用引物的标记，其能够识别杂交后的多型部位的基因型的不同。作为本发明方式的"扩增用核酸序列"的"通用引物结合部位"仅有1个包含在该核酸片断中，但可以同时使用1个以上与其杂交而使用的通用引物，优选以1个以上且比一起使用的全识别用核酸引物混合物中所含的识别用核酸引物的种类少的数量来使用。图3为了方便表示了使用1个核酸片断的例子，但在实际进行扩增时，可以使用具有与该识别用核酸的至少一部分互补的序列的全识别用核酸引物混合物作为引物，且使用1个以上的通用引物，对多个核酸片断实施扩增反应。另外，全识别用核酸引物混合物中所含的各个引物可以全部为均一量，还可以根据成为问题的识别用核酸的扩增率来改变该全识别用核酸引物混合物中所含的对应的识别用核酸引物的比例。通过这种根据本发明的扩增多种识别用核酸的方法，所扩增的每个核酸的扩增率的偏差明显少于以往。艮P，本发明的方式中，为了通过互补于各识别用核酸的引物来分别扩增各识别用核酸，扩增各识别用核酸的引物的量受到限制，由此，扩增效率高的标签的扩增不会被异常地促进。相反，即便是扩增率低的识别用核酸，扩增所要使用的引物也不会被扩增率高的识别用核酸夺走，产生扩增产物。因此，可以平衡性良好地扩增多种识别用核酸。另外，与以往方法相比，由于通用引物1个位置都不需要，因此核酸片断的长度被縮短。因而，核酸的合成费用减少、合成和/或精制时间被縮短。这里所用的"核酸片断"可以是根据实施者的需要顺利地合成得到的寡核苷酸、可以是天然的核酸，还可以含有部分的天然核酸，但优选为根据实施者的需要合成得到的寡核苷酸。另外，在根据后述本发明方式的标签多重法中，该"核酸片断，也可以被称为"检测用核酸"，还可以交替使用这2个用语"核酸片断"和"检测用核酸"。核酸片断的长度为约10碱基约50碱基、优选为15碱基30碱基。这里使用的"核酸片断混合物"是指由多个核酸片断构成的混合物。特别是在"含有多种核酸片断的核酸片断混合物"的情况下，其中所含的核酸片断的碱基序列由2个以上的序列构成。这里使用的"识别用核酸"的用语是指核酸片断中所含的成为扩增对象的核酸，例如为在该扩增后接着的过程中成为检测对象的序列或含有成为该对象的序列的核酸等。在后述的本发明的1个方式的标签多重法中使用该方法时，"识别用核酸"可以与"标签"的用语交替使用。另外，"标签"的用语可以与"识别用核酸标签"交替使用。识别用核酸的长度为约12碱基~约50碱基、优选为15碱基30碱基。这里使用的"全识别用核酸引物混合物"在用"标签"表示该"识别用核酸"时，可以与"标签混合物引物"的用语交替使用。将杂交于"识别用核酸"而作为引物使用的目标核酸称为"识别用核酸引物"或仅称为"识别用引物"。在1个反应体系中使用的该识别用核酸引物混合物及其中所含的引物数可以根据本发明方法的实施者的需要来决定，但优选仅以根据预先决定的识别用序列和扩增用序列的种类和量来存在。识别用核酸序列的碱基数可以与相应的引物的碱基数相同，另外，也可以识别用核酸序列更长出仅1碱基10碱基。另外，扩增用核酸序列的碱基数与对应的通用弓I物的碱基数可以相同，另外，也可以扩增用核酸序列更长出仅1碱基10碱基。扩增用核酸序列的长度为约10碱基~约50碱基、优选为20碱基~30碱基。这里所使用的"核酸"用语是指包含cDNA、基因组DNA、合成DNA、mRNA、总RNA、hnRNA、合成RNA的全部DNA和RNA。本说明书中的"可以扩增核酸的条件"可以是本身公知的核酸扩增可以进行的任何条件，在实施扩增反应时，本发明的实施者可以自由地选择适当的、更适当的或最适当的条件。例如，可以扩增核酸的条件可以是包含根据本发明的适当引物、本身公知的任何核酸扩增用的酶类、用于调整反应液的盐浓度平衡等的本身公知的任何缓冲液成分和dNTP混合物等，且为维持在适于扩增的反应温度的环境。这里所用的"扩增"可以是本身是本领域技术人员公知的任何扩增方法，但可以优选使用PCR和不对称PCR等扩增方法。2.多重标签扩增法根据另一个方式，本发明的扩增方法例如在使用了标签的多重检测法、DNA计算的序列扩增等、利用本身公知的标签进行的核酸反应体系的任何中作为用于有效地扩增该标签的方法来使用。例如，利用了多重检测法的多重分型法是为了适应最近的基因分型的低成本化、高通量(throughput)化的要求而在90年代后期提出的方法。根据本发明的1个方式，通过使用上述项"l.识别用核酸的扩增方法"来进行标签扩增，可以更为顺利地抑制在标签扩增中成为问题的扩增量的偏差。本发明人等注意到在利用多重检测法来扩增检测用核酸中所含的标签时，在引物序列所夹的区域上，不仅标签、而且含有SNP的基因序列也一起被扩增。结果发现，由于这种标签以外的序列的扩增，在扩增率中产生偏差，从而成为扩增量偏差的原因。另外，即便巧用反应方法，按照仅扩增标签序列、并使扩增效率一致的方式来选择序列，由于之前的标签转换反应的效率之差，有时在标签扩增的初期阶段扩增量还是不同的。根据以上事实，本发明人等发现了根据本发明的多重标签扩增法。这里使用的"多重标签扩增法"是指使用具有与多个标签分别互补的序列的引物作为混合引物来将该标签进行扩增的方法。以下使用图4来说明利用根据本发明1个方式的多重标签扩增法的SNP分析方法的例子。首先，由对象采集含有要分析的变异部位、例如SNP等的例如基因组DNA等试样，使用多个引物42对其进行多重PCR(图中记为多重PCR)(图4(A))。将所得PCR产物43进行热变性(图中记作热变性，heatdenaturation)(图4(B))。所得单链PCR产物43(a)在一个链中含有SNP(#1)46。在适当条件下使该单链PCR产物43(a)、预先设计的含有标签序列的寡核苷酸组44、用生物素标记化了的引物45发生反应(图4(C))。分析中的SNP46的基因型和寡核苷酸组44中所含的寡核苷酸44(a)的序列一致时，通过连接反应(图中记作连接反应)进行连接(图4(D)),进一步地结合在固相了链霉亲和素(图中记作SA，Streptavidin)的磁珠47上(图4(E))。将其进行碱变性(图中记作碱变性，alkalidenaturation)，在其结合于上述磁珠47的状态下，在标签混合物引物48、用第1荧光物质进行了荧光标记的通用引物的第1标记化通用引物49a和用第2荧光物质进行了荧光标记的通用引物的第2标记化通用引物49b的存在下，在可以进行不对称PCR的条件下对连接核苷酸50进行扩增(图4(F))。这里，第1荧光物质和第2荧光物质可以相互识别，通过使用它们，可以识别目标SNP的基因型。结果，通过利用适当的标签引物48(a)，可以对应于该基因型而获得用第1或第2荧光物质的任一个进行了荧光标记的PCR产物51(图4(G))。使该荧光标记了的PCR产物51与在探针固相区域53上具有各标签序列互补的探针54的微阵列52发生反应时，与Dl-l的探针固相区域53的探针发生杂交(图4(H))。通过测定该荧光标记的荧光强度，可以确定存在于特定位置上的SNP(#1)的阵列。通过上述本发明1个方式的方法，即便是大量含有人基因组之类的复杂序列或类似序列的试样，也可以在使扩增效率一致的同时特异地扩增目标产物。这里，本说明书中，"核酸"是指包含cDNA、基因组DNA、合成DNA、mRNA、总RNA、hnRNA、合成RNA的全部DNA和RNA。要检测或定量的上述目标核酸可以是具有任意序列的任意核酸，但作为可以成为遗传病的病因基因、癌相关基因或病毒来源的核酸等疾病标记物的核酸，特别优选上述目标核酸。因此，在上述试样中包括血液、尿、唾液等体液，但也可以使用体液以外的任意试样。试样为固体时，可以通过酶处理、添加表面活性剂或有机溶剂等适当的方法溶解于液体中。除此之外，实施本方法时，目标核酸也可以随意地改变。例如通过将细胞制成细胞株并大量培养、或较多地获得末梢血来大量地制备本方法所需要的人基因组DNA，从而可以直接由基因组DNA开始检测反应。另外，取而代之，还可以获得少量的基因组DNA，利用AmershamBiosciences公司的试剂盒GenomiPhi之类的WGA法(全基因组扩增，wholegenomeamplification),由非特异性扩增了基因组DNA的试样幵始检测反应。另外，还可以从使用PCR法、多重PCR法、不对称PCR法之类的引物而扩增了特定序列的产物开始检测反应。特别是，为了检测SNP特异性序列而使用本发明的方法时，目标核酸假想为基因组DNA等，但此时，也可以利用PCR等预先扩增含有目标SNP的区域。通过其它的酶扩增方法分别获得的试样为双链试样时，还可以加以加热至95。C后骤冷至4'C而制成单链，或者在盐浓度极低的溶液中加热至95'C而片断化；利用超声波片断化；利用限制酶切断等的单链化、片断化操作后进行检测操作。另外，扩增工序中所用的反应溶液可以使用普通的PCR反应溶液，也可以使用市售的试剂盒。例如，如以下实施例所示，可以为酶TitaniumT叫(Takara-Bio)、缓冲液TitaniumTaq缓冲液、引物分别为O.lpM、模板DNA:10ng、反应体积20pL。作为本发明实施方式的1例，有以下形态。特别是，本发明的检测方法的用途、场所如下。例如有阐明人基因型与疾病的相关性、检测药剂敏感性、检测基因控制区域的蛋白结合性的变化、对象生物从人转变为其它生物的基因多型的分子生物学分析等研究用途。这些研究一直在大学、企业等的研究所、研究室中进行。另外，在明确基因与特定疾病的相关性、患病风险、药剂敏感性时，可以用于下述医疗用途用于选择在医院检査中心的治疗方法的检查、用于预防健康筛查的诊断、用于选择副作用小的抗癌剂的药剂敏感性检查等。作为用于实施本发明的方法的形态，有用于使用者自己实施本方法的研究用途和作为诊断用基因多型检测试剂盒的实施、利用进行自动处理的自动反应装置的实施、代替使用者或待测者的委托研究或检查中心的诊断等的实施。在基因分析中，向这种标签的转换反应是重要的。作为该转换中所用的反应，有连接酶连接反应(OLA:寡核苷酸连接分析法)、利用聚合酶进行的1碱基延长等。通过这些方法可以最大限度地发挥酶识别不匹配杂交的能力，并且按照在通过连接酶反应连接的探针的3'末端上配置SNP的碱基的方式来设定探针序列(Luo，J.etal.，ImprovingthefidelityofThermusthermophilusDNAligase，Nucl.AcidsRes.24，3071-78(1996))。例如，为了明确疾病与SNP、或者药剂敏感性与SNP的关系，有必要从尽量多人数的患者组和对照组中分别检测尽量多的SNP，由此可以高精度地发现两者的关系。在以往技术中使用2个通用引物，与此相对，根据本发明方式的反应，将分别等量的2种扩增用序列的引物和等量含有识别用序列(即标签)全部种类的引物混合物作为引物的组，从而进行PCR扩增。但是，也可以改变每个标签的引物量。为了用互补于各标签的引物分别扩增各标签，扩增各标签的引物量有所限制。由此，不会异常地促进扩增效率高的标签的扩增。相反，即便是扩增率低的标签，由于扩增所要使用的引物不会被扩增率高的标签夺去，因此产生充分的扩增产物。因而，可以抑制多个标签的扩增量的偏差。另夕卜，根据本发明，可以广泛地应用，例如在使用DNA计算机的SNP分析中，使用DCN进行基因分析的多重化，但此时，若从处于预处理的基因组切出SNP周围的PCR也能同样地多重化，则在成本或操作效率的方面来说是优选的。但是，本发明并不局限于此。另外，本发明的方法可以有效地进行SNP的分析。为了进行比较参考，将通过以往方法进行图4所示的本发明1个方式时的流程图示于图5中。图5(A)(E)是与图4所示方法相同的方法。与此相对，图5(F)的扩增反应中有所不同。即，在图4的本发明的方法中使用了具有标签互补序列的引物，与此相对，图5中使用了通用引物60、第1标记化通用引物61a和第2标记化通用引物61b。另外，本发明的识别用核酸的扩增方法和/或标签多重法也可以使用在图6所示的邮编法中。示意地表示该方法中使用的检测用核酸。图6(A)所示的方法中使用反应前的检测用核酸70和检测用核酸72来进行目标基因的分析。反应后，将检测用核酸70和检测用核酸72相互连接(图6(B))。图7所示的图为表示在图5方法中使用的2种检测用核酸在反应前(图7(A))和反应后的状态(图7(B))的图。同样地，MIP法的反应前状态示于图8(A)、反应后的状态示于图8(B)中。另外，图8(B)的检测用核酸和基因组DNA的杂交模式和标签的扩增过程示于图10(A)~(D)。对于金门法(GoldenGatemethod),同样将反应前的状态示于图9(A)、反应后的状态示于图9(B)。这里，对于各例如图所示，Barany的邮编法、陶山等人的方法、MIP法、Illumina公司的金门法中所用的检测用核酸的结构全部是通用引物区域有2个位置，在1个以上的位置上具有至少要检测的基因或者与基因变异一对一地对应的标签序列。因此，根据上述本发明的方法，使用互补于该标签序列的引物组而不使用通用引物中的1个时，可以获得上述本发明所产生的效果。这里，为了使扩增率更为均一，可以根据标签的扩增率来改变标签引物的量。另外，还可以增加任一引物的量来实施不对称(非对称)PCR。而且，还可以在标签序列引物上修饰荧光色素，还可以在通用引物上修饰荧光色素。另外，还可以在各引物上修饰荧光色素以外的化学修饰，例如DIG(地高辛，Digoxigenin)、生物素、半抗原等。将通用引物侧分类时，可以分为2种以上，优选为10种左右，在PCR时可以混合地反应。由此，由于可识别标签的种类变为(标签的种类数)x(通用引物的种类数)，因此可以显著地增加标签的种类数。实施例在利用通用引物扩增标签时，显示了与用标签混合物引物扩增标签时的不同，显示了本发明方法的效果。方法为使用了标签的多重SNP检测法，检测反应根据日本特愿2004-296784(日本特开2006-101844)的方法进行。实施例中，使用由人类科学振兴财团的人类科学研究资源库匿名化的人基因组样品，检测的SNP为96种。利用本发明的方法进行的分型按照下述顺序进行。1.序列、样品的获得2.基因组DNA的扩增3.编码(encode)反应4.扩增反应5.检测。以下说明实施内容。成为检测对象的SNP的碱基序列为由东大医科学研究所整理的日本人SNP的数据库JSNP获得的共计96个的SNP。检测的样品为从(财)人类科学振兴财团的人类科学研究资源库所颁布的人末梢血细胞株中提取的人基因组DNA。检测的样品为PSCDA0503、PSCDA0328、PSCDA0719、PSCDA0785的4个样品。以下具体地记载处理基因组样品的方法。首先，禾拥多重PCR从基因组DNA扩增含有目标SNP的区域。由于在1根反应管中进行SNP24个位置的扩增，因此对于1个样品，进行4次扩增反应。该操作按照下述的顺序进行。该PCR反应中所用溶液的组成如下。反应液使用Takam-Bio公司的制品TitaniumTaq。超纯水由Millipore公司的Milli-QSynthesis制作。引物序列使用美国DNA软件公司的VisualOMP来设计。TitaniumTaq(50倍浓度)0单TitaniumTaq缓冲液(io倍浓度)2jjL引物24种(lOOpM)0.74jiLMgCl2(25mM)2.4|iLdNTP(10mM)l单基因组DNA(5ng/YU)2pL超纯水13.26^L合计20^iL用于反应的热循环如下所述。热循环仪使用MJResearch公司的PTC-200。1.预热94°C3分钟2.变性94°C15秒钟3.延长73°C1分钟[循环50次的2、3，延长阶段在每个循环中为降低0.rC延长5秒钟]4.保存10°C温度固定由上，获得含有目标SNP的基因组PCR产物。另夕卜，这里说明了分为4次的方法，但也可以l次进行。l次进行时，可以在1根管中将94种的引物进行扩增反应。这里使用的94种引物使用具有序列号1~序列号94所记载的序列的引物。接着，进行编码反应。由于连接酶使用NewEnglandBiolab公司的Taq连接酶，因此使用附带的10x缓冲液。探针混合物(96SNP检测用混合物、各含O.lpM)0.2^L10xTaqDNA连接酶反应缓冲液3pLTaqDNA连接酶(40U/pl)0.5^LPCR产物(4液混合)4pL超纯水22.3pL合计30pL以此为基础制作以下组成的编码反应液。所用Taq连接酶为NewEnglandBiolab公司生产的。在以下温度下使该编码反应液反应。加热所用的热循环仪为PTC-200。1.变性95°C1分钟2.连接反应58°C60分钟3.保存l(TC温度固定由此，在编码反应中完成利用连接酶进行的探针连接反应。接着，进行将生物素化普通探针、连接后的信息探针(queryprobe)和普通探针捕获在链霉亲和素磁珠上的操作。溶液组成如下。编码产物30pL2xB&W缓冲液16.5pL链霉亲和素磁珠5pL用链霉亲和素包裹表面的磁珠为Dynal公司的M-280磁珠，根据该微珠的说明书，使用以下组成的溶液作为B&W缓冲液。Tris-HCl(pH7.5)10mMEDTAlmMNaCl0.2M链霉亲和素磁珠(以下称为磁珠)为从上市的含有防腐剂的原液取出5pL，利用B&W置换原液，再达到5iaL而成的。在室温下振荡如此制作的溶液15分钟，以使得磁珠良好地分散于溶液中。振荡结束后，洗涤磁珠。洗涤按照以下的顺序进行。1.利用磁铁凝集磁珠，除去B&W缓冲液；2.在室温下再次分散于100pL的lxB&W缓冲液中，吸液后，进行两次用磁铁凝集磁珠、除去B&W缓冲液的洗涤操作；3.在室温下再次分散于0.2N的NaOH水溶液IOOjiL中，并用振荡机振荡4分钟；4.用磁铁凝集磁珠后除去NaOH水溶液；5.在室温下用100mL的10mMTrsi-HCl按照2的要领洗涤2次。通过该洗涤操作，获得除去了非特异性吸附的DNA的磁珠。将其称作经过编码的磁珠。接着，利用扩增反应进行不对称PCR，进行标签的扩增和标记。SD是指相当于引物1的序列，Cy3-rED、Cy5-rED，为相当于与放入引物2位置的阵列对应的2种序列的互补链的序列，且5'端标记有荧光色素。聚合酶由于使用Takara-Bio公司的ExTaq，因此制作所用的10倍浓度缓冲液和dNTP混合物使用试剂盒所附带的产品。10倍浓度缓冲液使用含有20mM镁离子类型的缓冲液。引物用超纯水进行了稀释。[通用引物的情况]引物SD(10|oM)O.l^iL引物Cy3-rED(IOjoM)0.5pL引物Cy5-rED，(10pM)0.5^110xExTaq缓冲液5pLExTaq0.5|jLdNTP混合物(10mM)4|iL超纯水38.4(iL合计50jiL[标签混合物引物的情况]标签混合物引物(25pM)l^L引物Cy3-rED(lOpM)0.5pL引物Cy5-rED，(lO^M)0.5|il10xExTaq缓冲液5^LExTaq0.5jjLdNTP混合物(10mM)4pL超纯水39.4pL磁珠总量合计50pL在除去了溶液的经过编码的磁珠中混合该反应液，分散磁珠。反应的热循环如下。热循环仪使用PTC-200。当使用循环延长(cycleelongation)法时，循环数优选为3040个循环。1.变性94°Cl分钟2.变性94°C30秒钟3.退火55°C6分钟4.延长72。C30分钟[将2~4进行40个循环]5.冷却10°C温度固定由上完成扩增反应。将如此获得的产物称作标记PCR产物。最后进行检测反应。检测使用毛细管阵列(日本特开平11-75812)。毛细管阵列为利用类似于DNA微阵列的杂交来检测核酸的设备，沿着槽状的流路点样探针。此次使用的毛细管阵列在1个槽中固定有50点标签检测用的探针，槽的容量为25^1。毛细管形成在硅胶板上，利用硅胶的粘合性粘贴在直线状地点样有探针的载玻片上。在该槽的两端上开有贯通至槽的相反侧的面的孔，即便将有槽的面粘贴在载玻片侧，也可以从这些贯通孔中注入和取出试样液。探针固定用载玻片使用Takam-Bio公司出售的HubbleSlide,探针的点样使用日立SoftwareEngineering公司的SP-BIO。事先按照对应于载玻片的点样点的方式粘贴硅胶。使标记PCR产物杂交于该毛细管阵列。由于在不对称PCR溶液中残留有磁珠，因此按照不吸取标记PCR产物的方式收集磁珠后取上清。杂交溶液中每1通道(lane)加入lO^iL标记PCR产物、剩余加入达到以下最终浓度的2倍杂交反应用液(0.5xSSC、0.1%SDS、15%甲酰胺、lmMEDTA)，为了标准化杂交的强度、荧光强度，混入2pL杂交于第100个探针的2.5mM浓度的标记过的对照目标Oligo。在95'C下加热该溶液1分钟，之后在37。C避光的加热板上将该液体24pL注入到毛细管阵列中，杂交60分钟。杂交后，接着按照下述顺序进行洗涤。1.在0.1xSSC、0.2%SDS中将毛细管从载玻片上取下。2.在O.lxSSC、0.2%SDS中室温下振荡5分钟。3.在超纯水中室温下振荡1分钟。4.使用喷气或离心机干燥载玻片。按照以上的顺序完成杂交反应，接着通过微阵列扫描仪进行荧光检测。扫描仪使用Axon公司的GenePix4000B，在Cy3、Cy5检测波长下检测。杂交时，分别用Cy3、Cy5标记杂交于不同于样品的探针的荧光标记过的对照靶，放入相同量，与样品同时地杂交。使用该信号强度，标准化荧光强度平均值为各SNPs的Cy5、Cy3的荧光强度除以分别相同的杂交对照耙的荧光强度而进行标准化的和的平均值。用下式表示avg(SNP一n，sample(Cy5)/HybriCont(Cy5)+SNP_n,sample(Cy3)/HybriCont(Cy3))。SNP一n，sample(Cy5)是指SNP序号为n号的样品的Cy5荧光强度，HybriCont(Cy5)是指Cy5标记了的定量对照靶的检测荧光强度。图11是求出每个SNP的标准化荧光强度平均值，并按由低到高的顺序作图而得到的。通过标签混合物引物，平均荧光强度达到10倍，表现信号强度的偏差的。/。CV值从160%降低至90%，扩增均匀性有所提高。表l各扩增方法与所得PCR产物的荧光强度的偏差<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>进一步详细分析所示数据的结果如下所示。计算机使用戴尔的OptiplexGX150，使用微软公司的数据库软件的Access2002来制作分布图。将作为信号强度的指标的分布图的X轴、Y轴的刻度的最大值设为最大荧光强度，对96个SNP进行编制(listup)。另外，也研究了评价这些分布图的QV值(QV值为日本特愿2006-249837中分布图的群集(cluster)的评价值，越大则群集分离越好)。结果，如表1所示，信号的最大值平均为2倍以上。图12的第SNP65号表示典型的分布图的改善例。通过改变扩增方法，信号强度明显增强，群集正确地分离。另外，通过改变扩增方法，多个SNP的信号最大值有所提高。96个SNP中X轴的信号提高的SNP为75个，Y轴的信号提高的SNP为72个。但是，两轴各自信号降低的SNP为20个左右。这说明，如图13的第SNP75号所示，通用引物中受到异常强的扩增，但通过进行多重PCR，扩增所用的引物量受限，停止在适当的扩增量，显示了扩增量的均匀化作用。可以称作由于信号降低而分布图的质量降低的SNP仅为1个。分布图的质量通过扩增方式的改善而变得好一些。表示分布图的分离程度的QV值为10以上的可以充分分离的SNP数在通用引物PCR中为33个，但在标签混合物PCR中增加至35个。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>综上所述，这是由于，通过制成标签混合物引物，PCR扩增所用的弓物基本被均匀地供给至任何标签，从而扩增均匀性增加。检测强度的偏差认为是下述原因在本发明的标签混合物PCR前，进行了扩增含有各SNP的基因组的PCR、利用连接酶的检测反应、回收磁珠，这些阶段中由于每个标签(每个SNP)的反应效率均具有差别，因此PCR前原本扩增对象的量发生了偏差。以上说明的实施例为用于说明本发明效果的1例，可以理解本发明并非局限于此。本说明书中记载的文献通过引用而编入在本说明书中。如上说明，根据本发明的1个方面，可以提供用于扩增多种识别用核酸的方法。另外，根据本发明的另l个方面，可以提供在利用标签的多重检测中，标签间的扩增率的偏差较小的方法。权利要求1.扩增多个核酸片断的方法，其中，所述核酸片断包含选自由第1～第n的识别用核酸序列所构成的第1组中的1个识别用核酸序列和选自由第1～第m的扩增用核酸序列所构成的第2组中的1个扩增用核酸序列，所述方法包括在可以扩增核酸的条件下，通过使用与有可能存在于所述核酸片断混合物中的全部识别用核酸序列的至少一部分序列和扩增用核酸序列的至少一部分序列互补的序列或相同链侧的序列作为引物，从而将含有多种所述核酸片断的核酸片断混合物进行扩增；其中，n为2以上的整数，第1组中所含的第1～第n的识别用核酸序列的碱基序列互不相同，m为1～n的整数，第2组中所含的第1～第m的扩增用核酸序列的碱基序列互不相同。2.权利要求l所述的方法，其中，所述扩增为PCR扩增。3.权利要求1或2所述的方法，其中，所述识别用核酸序列为标签核酸，所述进行扩增的反应是为了多重检测而用于扩增所述标签的方法。4.权利要求3所述的方法，其进一步包括下述步骤-获得含有成为分析对象的核酸的样品；将所述成为分析对象的核酸进行扩增；对于通过扩增获得的扩增产物进行转换为标签序列的反应，从而获得含有多种核酸片断的核酸片断混合物，所述核酸片断包含选自由第1~第n的识别用核酸序列所构成的第1组中的1个识别用核酸序列和选自由第1~第m的扩增用核酸序列所构成的第2组中的1个扩增用核酸序列；使用第1第n的识别用核酸序列引物和第1第m的扩增用核酸序列引物来扩增所述核酸片断混合物。5.权利要求1~4任一项所述的方法，其中，所述第1识别用核酸序列的长度与第1识别用引物的长度相同，同样地，至第n为止的识别用核酸序列的长度也与至第n为止的引物的长度相同，而且，所述第l扩增用核酸序列的长度与第1引物的长度相同，同样地，至第m为止的扩增用核酸序列的长度也与至第m为止的引物的长度相同。6.权利要求14任一项所述的方法，其中，所述第l识别用核酸序列的长度比第1引物的长度长1个碱基10个碱基，同样地，至第n为止的识别用核酸序列的长度也比至第n为止的引物的长度长1个碱基~10个碱基，而且，所述第1扩增用核酸序列的长度比第1引物的长度长1个碱基~10个碱基，同样地，至第m为止的扩增用核酸序列的长度也比至第m为止的引物的长度长1个碱基10个碱基。7.权利要求1~6任一项所述的方法，其中，第1~第n、第1~第m的多个引物的含量根据分别互补的识别用核酸序列或扩增用核酸序列而不同。8.权利要求l-7任一项所述的方法，其中，该方法中使用的引物在3'末端以外的位置上用标记物质进行了修饰。9.用于在权利要求18任一项所述的方法中使用的试剂盒，其含有第1~第n的多个引物、通用引物、核酸扩增用酶、缓冲液成分和dNTP混合物。全文摘要本发明提供在利用标签的多重检测中使用多个标签时，该多个标签间的扩增量的偏差较小的方法。该方法为扩增多个核酸片断的方法，其中，所述核酸片断包含选自由第1～第n的识别用核酸序列所构成的第1组中的1个识别用核酸序列和选自由第1～第m的扩增用核酸序列所构成的第2组中的1个扩增用核酸序列，所述方法包括在可以扩增核酸的条件下，通过使用与有可能存在于所述核酸片断混合物中的全部识别用核酸序列的至少一部分和扩增用核酸序列的至少一部分序列互补的序列或相同链侧的序列作为引物，从而将含有多种所述核酸片断的核酸片断混合物进行扩增；其中，n为2以上的整数，第1组中所含的第1～第n的识别用核酸序列的碱基序列互不相同，m为1～n的整数，第2组中所含的第1～第m的扩增用核酸序列的碱基序列互不相同。文档编号C12N15/09GK101268201SQ200680034738公开日2008年9月17日申请日期2006年11月8日优先权日2005年11月8日发明者森本伸彦,田边哲也申请人:奥林巴斯株式会社