一种选择性扩增rna的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及一种选择性扩增RNA的方法。
【背景技术】
[0002]在分析基因表达时，常规方法抽提RNA的样本，经常会遇到如何排除DNA干扰和污染的问题。通常会使用DNA酶处理，以保证RNA检测结果的真实性。大量的RNA样本还可以忍耐由于DNA酶处理所造成的样本损失，但是小量的RNA，单细胞的RNA样本分析则不是有效方法。珍贵的小量RNA或单细胞RNA，需要做多种基因表达分析时，通常需要对样本做基因扩增。扩增RNA的方法通常有以T7为基础的cRNA扩增和DNA多聚酶反应(PCR等)为基础的DNA扩增，但从原理上不能解决DNA的干扰或污染问题。一些利用DNA和RNA杂交探针扩增cDNA的方法，扩增时，DNA结合部分在一定温度下，难以展开，造成很多的非特异性产物。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于针对上述不足，提出一个可靠的选择性扩增RNA，而不扩增DNA的方法。
[0004]本发明采用的技术方案是:
[0005]一种选择性扩增RNA的方法，包括以下步骤:
[0006](I)由cDNA合成探针结合到RNA模板上，在有RNA转录酶的条件下，合成第一链cDNA ；
[0007](2)在有RNA酶的条件下，对结合的RNA进行切割；
[0008](3)在有DNA合成酶的条件下，合成第二链cDNA ；
[0009](4)在RNA转录酶存在的条件下，合成cDNA合成探针中RNA部分的cDNA ；
[0010](5)在RNA酶存在的条件下，酶切结合的cDNA合成探针的RNA部分；
[0011](6)在cDNA扩增探针存在的条件下，cDNA扩增探针结合到空出的部位，在DNA合成酶(DNAPolymerase)的作用下，扩增cDNA产物；
[0012](7)通过改变cDNA扩增探针和cDNA合成探针的核苷酸的相同序列程度，可调式cDNA扩增的温度条件。
[0013]进一步地，所述cDNA合成探针是一种由DNA和RNA片段连成的杂交探针，定位性或随机性结合的探针。
[0014]更进一步地，所述cDNA合成探针的DNA部分是和要扩增的RNA有配对结合的，其RNA部分原则上是整个RNA样本中没有完全一样的，序列结构特殊；
[0015]所述cDNA合成探针的DNA部分是用来合成RNA的第一和第二 cDNA链，其RNA部分是为了在合成的第二 cDNA链上带有该RNA配对结构的cDNA，作为cDNA扩增的结合点和启动点。
[0016]优选地，为达到高效、全面扩增RNA的目的，需要连续合成第一和第二 cDNA链，以提高探针模板的合成效率。
[0017]进一步地，所述cDNA扩增探针也是一种DNA和RNA片段连成的杂交探针，而且cDNA扩增探针和由cDNA合成探针可有一个碱基或多个碱基不配对。
[0018]优选地，所述要扩增的RNA样本可以为RNA样本、多细胞或者为单个细胞。
[0019]优选地，如果为RNA样本，可以调制在蒸馏水或缓冲液中；如果是多细胞或者单细胞，则可以调制在细胞裂解液或缓冲液中。
[0020]进一步地，如果为RNA样本，还包括定量小样本的RNA或裂解细胞处理，合成第一cDNA链、合成第二 cDNA链以及扩增cDNA步骤。
[0021]优选地，所述该扩增法是线性扩增，扩增后的产物是cDNA，扩增的产物可以直接用于PCR，定量PCR或各种基因芯片分析。
[0022]进一步地，所述该扩增法可以扩增样本中所有的、不同大小的RNA，或者设计定位的扩增探针，扩增所需要扩增的RNA。
[0023]cDNA扩增中使用cDNA合成探针，RNaseH, cDNA扩增探针，DNA链分离合成酶相配合，而达到高效扩增的目的。cDNA扩增还包括使用单链DNA结合蛋白质结合扩增后的cDNA产物，使cDNA扩增反应有效地、长时间地进行。
[0024]本方法的原理为:其核心是要在合成第一链和第二链cDNA以及在扩增所合成的cDNA时，选择性地扩增由RNA由来的产物，而不是由样本中的DNA由来的产物。该方法选择性扩增RNA的原理，如传统的cDNA合成法和扩增法明显不同之处有三点点。第一点是，利用DNA和RNA杂交cDNA合成探针，保证了只有RNA由来的样本，才能合成cDNA合成探针中的RNA部分的cDNA模板，作为cDNA扩增的起点(T7扩增法用的是DNA探针);第二点是，每次新扩增都需要RNase酶切，腾出位子让新的cDNA扩增探针结合，扩增产物特异性强，并且可在恒温下(当然也可以在变化的温度下，只是恒温更理想)，不断地扩增，扩增的产物是cDNA(T7扩增法的产物是cRNA)，可以直接用于PCR、定量PCR或各种基因芯片的多基因分析、检测和定量基因表达水平。第三点是，由于cDNA扩增探针的特殊设计结构，其和合成模板的结合温度是按酶反应要求进行设计调节的。本方法扩增RNA可达百万级以上，所以即使原来有存在于样本中的微量DNA，因为不能扩增，在最终的基因表达分析上，基本没有影响。所以该方法既可以用在小量的RNA样本上，也可以用在单细胞水平的基因表达分析上。
[0025]本发明方法所采用的技术方案，概括起来为:1.使用的生物样本可以是小量的RNA样本或少数甚至单个细胞，使用或不使用细胞裂解处理。2.用特殊设计的DNA和RNA结构组成的cDNA合成探针合成cDNA的第一和第二链，特别是让第一 cDNA链中含有cDNA合成探针结构中的RNA部分的cDNA。3.在有cDNA扩增探针、RNA酶和DNA合成酶存在的条件下，高效率地扩增cDNA产物。
[0026]本发明的有益效果是:
[0027](I)可以对小量的RNA样本或少量细胞甚至是单细胞的RNA作选择性的高效率扩增。
[0028](2)扩增的产物是cDNA，结构稳定，可直接用于PCR，定量PCR或各种芯片杂交分析。
[0029](3)扩增可以在恒温条件下进行，容易操作。
[0030](4)该方法属于线性的扩增，适用于作基因定量分析。
[0031](5)扩增产物可以是单链的DNA或最终产物为双链，可供芯片杂交使用或PCR使用。
[0032](6)操作方法和过程简单，对仪器、设备要求较低。
【附图说明】
[0033]图1为本发明实施例1提供的一种选择性扩增RNA方法的原理图；
[0034]图2为本发明实施例2和3提供的多个基因获得较均等的高效率扩增以后的比较图。
【具体实施方式】
[0035]实施例1
[0036]下面结合附图对本发明做进一步的说明。
[0037]一种选择性扩增RNA的方法，其原理图参照图1。该方法包括以下步骤:
[0038](I)由cDNA合成探针结合到RNA模板上，在有RNA转录酶的条件下，合成第一链cDNA ；
[0039](2)在有RNA酶的条件下，对结合的RNA进行切割；
[0040](3)在有DNA合成酶的条件下，合成第二链cDNA ；
[0041](4)在RNA转录酶存在的条件下，合成cDNA合成探针中RNA部分的cDNA ；
[0042](5)在RNA酶存在的条件下，酶切结合的cDNA合成探针的RNA部分；
[0043](6)在cDNA扩增探针存在的条件下，cDNA扩增探针结合到空出的相当于cDNA合成探针的RNA部位，在DNA合成酶(DNA Polymerase)的作用下，扩增cDNA产物。结合到cDNA模板上的cDNA扩增探针的RNA部分又被RNA酶切割，新的cDNA合成探针又会结合到cDNA模板上，在DNA合成酶的作用下，合成新的cDNA产物。由此重复、不断地扩增cDNA。
[0044]cDNA合成探针是一种由DNA和RNA片段连成的杂交探针，定位性或随机性结合