吸附四环素类药物的免疫亲和搅拌棒及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品安全检测技术领域，涉及一种免疫亲和搅拌棒及其制备方法，更 具体地说，是一种吸附四环素类药物的免疫亲和搅拌棒及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 随着我国经济的发展，人们生活水平的日益提高，对各种动物源性食品的需求量 也逐渐增大，食品安全问题自然成为大家关注的焦点。近年来关于兽药残留引起的对人身 体健康造成危害的报道屡见不鲜，相关食品安全部门也致力于检测方法的研究。由于生物 样品的成分复杂、药物与样品成分之间易互相结合和残留药物浓度低等均给样品中药物的 提取净化带来了很大的困难，因此分析方法的选择性和灵敏度直接决定了检测的成功与 否。
[0003] 免疫亲和搅拌棒（Imunoaffinity stir bar)是免疫亲和固相微萃取 (Immunoaffinity solid phase microextraction, Immunoaffinity SPME) 的一种 装置形式，将固相微萃取（Solid phase microextraction, SPME)与免疫亲和色谱 (IAC, immunoaff inity chromatography)相结合，既具有SPME易于操作、使用溶剂少和节 省时间的优点，又有免疫亲和色谱高度选择性和高亲和性的特点，使SPME在兽药残留分析 中，选择性、亲和性和灵敏度方面得到了很大的提升。Immunoaffinity stir bar常被用作 样品的萃取，尤其适用于复杂基质中痕量分析物的提取，与多种检测手段结合使用进行分 析测定，具有广阔的应用前景。
[0004] 四环素类药物因分子结构中具有共同的氢化骈四苯环而得名，属广谱抗生素，对 革兰阳性菌、革兰阴性菌及螺旋体、立克次体、衣原体、支原体及原虫等均有抑制作用。其 抗菌机制主要为抑制菌体蛋白质合成。本类药物具有酸碱两性，能与酸或碱生成盐。但在 碱性水溶液中不稳定，故多制成盐酸盐。四环素类药物重要包括四环素（Tetracycline， TC)、强力霉素（Doxycycline, DC)、金霉素（Chlortetracycline, CTC)和 土霉素 (Oxytetracycline, 0TC)〇
[0005] 1975年，前苏联及东欧国家就曾建议禁止在兽药添加剂中使用四环素、土霉素、青 霉素，现已禁止将医用抗生素作为饲料添加剂；1976年日本开始执行饲料安全法，禁止将 四环素、土霉素、链霉素作为饲料添加剂；2000年欧盟委员会（EC)修订兽药法时，对土霉 素、四环素及青霉素规定为有限使用药物。目前，瑞典和丹麦己禁止在饲料中添加四环素类 抗生素，我国兽药管理条例中明确规定，凡用于动物疾病，促进动物生长的品种必需经农 业部批准。2002年农业部颁布了关于动物性食品中兽药最高残留限量的通知6008,规定了 1〇〇多种兽药的使用品种及在靶组织中最大残留限量，2001年7月3日还发布了 5饲料药 物添加剂使用规范，2003年（265)号公告中明文规定，不得使用不符合兽药标签和说明书 管理办法规定的兽药产品，不得使用食品动物禁用的兽药及其他化合物清单所列21类药 物及未经农业部批准的兽药，不得使用进口明令禁用的兽药。
[0006] 人类在食用了有四环素类药物残留的动物性食品后，会造成药物在体内积累， 对身体造成严重的危害。主要包括：①胃肠道反应，表现恶心、呕吐、胃区不适、腹胀、 腹泻，重者出现食管溃疡。②四环素促使核黄素自肾脏排泄增多，造成维生素B2缺 乏，导致口、咽溃疡，黑毛苔，肛门周围疼痛及腹泻等。③引起肝肾功能损害，轻者出现 肝功能异常，长期或大量应用导致肝细胞脂肪浸润变性。④应用过期失效四环素可出 现类范可尼氏综合征，临床出现恶心、蛋白尿、糖尿、氨基酸尿、低血钾及酸中毒等。 容可引起二重感染。四环素的广谱抗菌作用使体内敏感菌被消灭，耐药菌得以繁殖，体内菌 群平衡遭到破坏，出现二重感染。
[0007] 近几十年来，各种食品安全监测机构、各类从事相关工作的研究人员针对食品和 饲料中四环素的残留分析进行了深入全面的研究。目前用于CAP检测的主要技术有：酶联 免疫吸附分析（ELISA)、气相色谱法（GC)、和气相色谱-质谱联用分析法（GC/MS )及高效液 相色谱（HPLC)等方法。ELISA法主要用于半定量快速筛选；GC和GC/MS由于需衍生化，操 作较为麻烦；HPLC分析较准确且过程相对较简便，但检测限比较高。本由于样品基质成 分复杂，在萃取过程中很容易将待测药物与其他性质相似的成分一起提取出来，给检测造 成困难。因此，在检测之前"净化"工作是必不可少的，通常采用净化方法主要有液-液萃 取（LLE)和固相萃取（SPE)。LLE过程需要使用大量有机溶剂，而一些有机溶剂性质稳定，不 易降解，对环境造成污染，而且操作繁琐。SPE操作简单、省时，但特异性不强是其主要的缺 点。Immunoaffinity SPME 技术首次于 2001 年被提出，用 Immunoaffinity stir bar 净化 四环素类药物目前还尚未见报道，更无商品化的Immunoaffinity stir bar出售。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种吸附4种四环素类药物的免疫亲和搅拌棒及其制备方 法。
[0009]为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容： 一种吸附四环素类药物的免疫亲和搅拌棒，其特征在于是由固相载体和与其偶联的 盐酸四环素单克隆抗体组成，其中固相载体(玻璃棒，10 cmX 4 mm，偶联抗体的有效长度为 2. 5 cm)与偶联的盐酸四环素单克隆抗体的偶联长度与重量比为1 cm :2 mg ; 所述的单克隆抗体是由单克隆杂交瘤细胞株TC-5G3注入小鼠腹腔，纯化小鼠腹水得 至1J ;所述的固相载体为10 cmX4 mm玻璃棒，偶联抗体的有效长度为2. 5 cm。
[0010] 单克隆杂交瘤细胞株TC-5G3的解释如下： TC-5G3中TC代表盐酸四环素，5代表细胞融合过程使用第5块96孔板，G3中的字母 和数字分别代表96孔板的横纵编号，96孔板中1-12为横向编号，A-H为纵向编号。G3代 表融合后的杂交瘤细胞株在96孔板中的位置。
[0011] 本发明进一步公开了吸附四环素类药物的免疫亲和搅拌棒的制备方法，其特征在 于按如下的步骤进行： (1)固相载体表面的处理：将玻璃棒下半部分浸入到双氧水：浓硫酸（30:70, v/v) lh， 依次用超纯水、无水乙醇和超纯水彻底冲洗；其目的是为了进行清洁和形成粗糙表面。 [0012] (2)硅烷化反应：将玻璃棒下半部分浸入ATPES (3-氨丙基三乙氧基硅烷，有市 售。）乙醇溶液中，其中ATPES:超纯水：无水乙醇的体积比为5:5:90,室温下反应24 h; (3)氨基的固定：超纯水和纯乙醇依次冲洗玻璃棒，放入真空干燥箱中80 °C并通入氮 气氮吹15 h ; (4)玻璃棒的活化：玻璃棒浸入2. 5%的戊二醛PBS (磷酸盐缓冲液，即1L中含有0. 2g KH2P04,0.2 g KC1，2.9 g Na2HP04.12H20,8.8 g NaCl的溶液，配制缓冲液时所需的试剂均有 市售。）溶液中5 h，之后用超纯水冲洗； (5) 偶联反应：玻璃棒浸入单克隆杂交瘤细胞株TC-5G3分泌的单克隆抗体PBS溶液， 0? 5 mg/mL 抗体 +0? 05 mg/mL NaN3* 4 °C 轻微揽祥 24 h ; (6) 将玻璃棒上未反应的戊二醛用乙醇胺水溶液（0. 3 M)去活化1 h ; (7) 稳固共价键：置于PBS+0.05 mg/mL NaN3+0.2mg/mL恥0他113混合溶液中4 °C反应 48 h，将酰亚胺还原为胺使共价键结合更加牢固；所述固相载体为高硼硅玻璃棒、高纯硅玻 璃棒或石英玻璃棒。
[0013] 所述的单克隆抗体指的是对四环素、强力霉素、土霉素和金霉素有特异性反应的 单克隆杂交瘤细胞株TC-5G3分泌的。
[0014] 本发明更进一步公开了吸附四环素类药物的免疫亲和搅拌棒在制备吸附4种四 环素类药物的应用。所述吸附四环素类药物指的是四环素、强力霉素、金霉素和土霉素。
[0015] 本发明的方法对组分净化的同时还可提供定性信息。本发明的提纯方法结合色谱 法可以使样品中的待测组分得到有效分离和浓缩，便于4种四环素类药物的含量的检测， 弥补了单纯免疫测定技术直接测定样本的信息量太少、定量准确差，或理化方法选择性低 等不足，体现了免疫学技术和常规理化技术在分析机制的互补性：
【主权项】
1. 一种吸附四环素类药物的免疫亲和搅拌棒，其特征在于它是由固相载体和与其偶联 的盐酸四环素单克隆抗体组成，其中固相载体与偶联的盐酸四环素单克隆抗体的偶联长度 与重量比为Icm:2mg;所述的单克隆抗体是由单克隆杂交瘤细胞株TC-5G3注入小鼠腹 腔，纯化小鼠腹水得到；所述的固相载体为10cmX4mm玻璃棒，偶联抗体的有效长度为2. 5 cm。
2. 权利要求1所述吸附四环素类药物的免疫亲和搅拌棒的制备方法，其特征在于按如 下的步骤进行： (1) 固相载体表面的处理：将玻璃棒下半部分浸入到双氧水和浓硫酸混合溶液中lh， 依次用超纯水、无水乙醇和超纯水彻底冲洗；其中双氧水和浓硫酸的体积比为30:70 ; (2) 硅烷化反应：将玻璃棒下半部分浸入ATPES，其中ATPES:超纯水：无水乙醇的体积 比为5:5:90,室温下反应24 h; (3) 氨基的固定：超纯水和纯乙醇依次冲洗玻璃棒，放入真空干燥箱中80°C并通入氮 气氮吹15h; (4)玻璃棒的活化：玻璃棒浸入2. 5% (w/w)的戊二醛PBS溶液中5 h，之后用超纯水冲 洗； (5)偶联反应：玻璃棒浸入单克隆杂交瘤细胞株TC-5G3分泌的单克隆抗体PBS溶液， 0? 5 mg/mL抗体+0? 05 mg/mL NaN3* 4°C轻微揽祥24 h ; (6) 将玻璃棒上未反应的戊二醛用乙醇胺水溶液（0. 3M)去活化Ih; (7) 稳固共价键：置于PBS+0. 05mg/mLNaN3+0. 2mg/mL恥0他113混合溶液中4°C反应 48h，将酰亚胺还原为胺使共价键结合更加牢固；所述固相载体为高硼硅玻璃棒、高纯硅玻 璃棒或石英玻璃棒。
3. 权利要求2所述吸附四环素类药物的免疫亲和搅拌棒的制备方法，其特征在于所述 的固相载体表面使用双氧水：浓硫酸（30:70,v/v)进行清洁和形成粗糙表面。
4. 权利要求2所述吸附四环素类药物的免疫亲和搅拌棒的制备方法，其特征在于所述 的单克隆抗体指的是对四环素、强力霉素、金霉素和土霉素4种四环素类药物具有特异反 应的单克隆杂交瘤细胞株TC-5G3分泌的单克隆抗体。
5. 权利要求1所述免疫亲和搅拌棒在制备吸附4种四环素类药物方面的应用；4种四 环素类药物指的是：四环素、强力霉素、金霉素和土霉素。
【专利摘要】本发明公开了一种吸附四环素类药物的免疫亲和搅拌棒及其制备方法与应用，它是由固相载体和与其偶联的盐酸四环素单克隆抗体组成，其中固相载体与偶联的盐酸四环素单克隆抗体的偶联长度与重量比为1cm:2mg。本发明的提取方法结合色谱法可以使样品中的待测组分得到有效分离和浓缩，便于四环素类药物含量的检测，弥补了单纯免疫测定技术直接测定样本的信息量太少、定量准确差，或理化方法选择性低等不足，体现了免疫学技术和常规理化技术在分析机制的互补性。
【IPC分类】G01N33-577, G01N33-543
【公开号】CN104698178
【申请号】CN201510116427
【发明人】李存, 张春元, 张伟, 姚凯, 吴银良, 李留安, 杨琳燕
【申请人】天津农学院
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年3月18日