一种胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ联合检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种胃蛋白酶原I和II联合检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]胃癌是全球高危死亡率的第二大疾病，严重威胁着人类健康。胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，死亡率居各种恶性肿瘤前列，全球每年934，000新发胃癌病例，42% (近40万)的新发病例数在我国，胃癌在我国的患病率和死亡率均是世界水平的2倍多。其早期诊断、早期治疗是提高患者生存质量、降低死亡率的唯一途径，改善胃癌患者预后的关键是作好二级预防，血清PG检测可以作为胃癌筛查“二步法”中的初筛方法。近年来，血清PG含量的变化与胃癌及其他胃部疾病的关系及其作为初筛手段在胃癌筛查中的应用已引起越来越多研究者的关注。联合测定PG I和PG II的水平及其比值可起到胃黏膜“血清学活检”的作用，有利于胃癌的预防干预、早期诊断以及术后复发预测。
[0003]PG (PG)是一种门冬氨酸蛋白酶前体，是分子质量为42KDa的单链多肽。人类PG依其电泳迁移率可以分为7个组分，1-5组分的免疫原性相同，称为PG I (PG I)，主要由胃腺的主细胞和黏液颈细胞分泌；组分6-7被称为PG II (PG II)，除由胃体和胃底黏膜的泌酸腺的主细胞分泌外，泌酸腺的黏液颈细胞、贲门腺和胃窦的幽门腺的黏液细胞以及十二指肠上段的Brunner腺也能产生PG II。由于胃几乎是PG的唯一来源，并且在分泌阶段的分泌量会发生变化，因此，血清PG I和PG II不仅反映了胃黏膜腺体和细胞的数量，也间接反映了胃黏膜不同部位的分泌功能。
[0004]通常情况下约有1%的PG通过胃黏膜进入血液循环，进入血液循环的PG在血液中非常稳定。血清PG水平是反映胃黏膜形态和功能的良好指标。大部分酶原进入胃腔，经酸解成具有活性的胃蛋白酶发挥其消化蛋白质的作用。但也有少量透过胃黏膜毛细血管进入血液，可从血清中检测。当胃粘膜发生病变时，血清中PG的含量也随之发生改变。血清PG含量的变化与胃癌及其他胃部疾病的关系及其作为初筛手段在胃癌筛查中的应用已引起越来越多研究者的关注。研究发现，在常规体检中大约有15%左右的人的血清PG水平异常，而进一步进行胃镜检查，其中90%以上的患者有不同程度的浅表性胃炎、糜烂性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、萎缩性胃炎、胃癌等胃部疾病。近年来，血清PG含量的变化与胃癌及其他胃部疾病的关系及其作为初筛手段在胃癌筛查中的应用已引起越来越多研究者的关注。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种胃蛋白酶原I和II联合检测试剂盒，可同时检测PG I和PG II两个项目，检测结果可用于胃部疾病的初筛。
[0006]本发明提供一种胃蛋白酶原I和II联合检测试剂盒，包括已包被抗PG I和PG II抗体的酶联板，所述抗PG I抗体是将PG I抗原部分基因序列PG 1-A和PG 1-B分别通过基因工程克隆表达得到PG 1-A和PG 1-B重组蛋白，并利用克隆表达的重组蛋白免疫小鼠制备得到单克隆抗体；所述PG 1-A的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID N0.1，所述PG 1-B的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID N0.2 ;所述抗PG II抗体是将PG II抗原基因序列通过基因工程克隆表达得到PG II重组蛋白，并利用克隆表达的PG II重组蛋白免疫小鼠制备得到单克隆抗体，所述PG II抗原的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID N0.3。
[0007]优选地，所述试剂盒还包括酶标抗体，所述酶为辣根过氧化物酶，所述抗体为PG 1-A, PG 1-B和PG II的单克隆抗体。
[0008]优选地,所述试剂盒还包括酶标抗体稀释液,所述稀释液的配方为:0.1M Tris盐酸缓冲液，0.1%-1%BSA, 0.5%-2.0% 酪蛋白，1%-6% (NH4) 2S04,1%-5%SDS, 0.1%-1% 甘油，
0.01%-0.1%DDT，5-10% 蔗糖，ρΗ8.5。
[0009]优选地，所述包被时的包被液为:0.1M碳酸盐缓冲液，pH值为9.6 ;包被浓度为5 μ g/mlο
[0010]优选地，封闭所述抗PG I和PG II抗体时使用的封闭液为:0.2M磷酸盐缓冲液，1%BSA, 2.0%酪蛋白；封闭液的pH值为7.4。
[0011]本发明还提供应用上述试剂盒联合检测胃蛋白酶原I和II的方法，步骤如下:
(1)在微孔板反应孔中分别加入10μ I校准品、质控品和待测样本，再加入90 μ I稀释的酶标抗体，混匀；
(2)37°C孵育45分钟；洗涤；
(3)加入底物显色，加入终止液，在酶标仪上读取OD45tl数值，绘制胃蛋白酶原I标准曲线和胃蛋白酶原II标准曲线，根据胃蛋白酶原I标准曲线和胃蛋白酶原II标准曲线计算待测样本中胃蛋白酶原PG I和PG II具体含量。
[0012]优选地，步骤(I)中酶标抗体的稀释倍数为1000倍。
[0013]本发明的第三个目的是提供PG 1-A, PG 1-B和PG II在制备联合检测胃蛋白酶原I和II试剂盒中的应用。
[0014]本发明的第四个目的是提供PG 1-A、PG 1-B和PG II在联合检测胃蛋白酶原I和II中的应用。
[0015]本发明基于双抗夹心方法，利用抗原抗体特异性反应来检测血清中PG I和PG II的含量。本发明运用酶联免疫一步法快速检测技术，使用以0.1M碳酸盐缓冲液(PH9.6)为包被液制备的微孔板和加速抗原抗体反应的酶标抗体稀释液，使一步法反应快速、充分，从而达到快速、高灵敏度、特异性好级量程宽的目的。
[0016]本发明试剂盒使用特异性的抗体和抗原，从而能够将PG I和PG II两个项目整合到一个检测试剂盒，使得除微孔板外所有试剂组分都整合后通用，所以一个试剂盒可同时检测PG I和PG II两个项目，操作简单，检测快速，便于临床使用；本发明试剂盒灵敏度高，检测灵敏度达0.1 μ g/L ;量程宽，检测样本不需要稀释；检测时间短，整个检测时间为I小时，比现有市场上同类产品检测时间缩短45-60分钟；检测样本需求量少，一次上样只需要50 μ 1，比目前市场上同类产品上样量减少一倍。
【附图说明】
[0017]附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中: 图1为胃蛋白酶原PG I的标准曲线；
图2为胃蛋白酶原PG II的标准曲线。
【具体实施方式】
[0018]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0019]实施例1
本发明的胃蛋白酶原I / II联合检测试剂盒由以下组分组成:
1、包被抗PG I抗体的微孔板，制备方法如下:
(1)抗PGI抗体的制备:将PG I抗原部分基因序列PG 1-A和PG 1-B分别通过基因工程克隆表达得到PG 1-A和PG 1-B重组蛋白，并利用克隆表达的重组蛋白免疫小鼠制备得到单克隆抗体；PG 1-A的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID N0.1, PG 1-B的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID N0.2 ;两条核苷酸序列分别按照上述方法制备得到单克隆抗体后，以1:1的质量比混合；
(2)抗PGI抗体的包被:用包被机或移液器将包被缓冲液按100 μ I/孔加入微孔板；用盖板膜封闭微孔板，放置于4°C冰箱过夜；用稀释后的0.05M洗涤液洗板5次。其中，包被缓冲液为:0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.6);包被浓度为5μ g/ml ；
(3)抗PGI抗体的封闭:用包被机或移液器将封闭液按300 μ I/孔加入微孔板；盖板膜封闭微孔板，放置于37°C封闭I小时；用稀释后的0.05M洗漆液洗板5次。其中,封闭液为:0.2M磷酸盐缓冲液，1%BSA, 2%酪蛋白(ρΗ7.4)；
(4)真空包装:将上述处理后的微孔板放置于37°C烘箱干燥0.5小时；立即用真空封装机进行真空包装。
[0020]2、包被抗PG II抗体的微孔板，制备方法如下:
(1)抗PGII抗体的制备:将PG II抗原的全部基因序列通过基因工程克隆表达得到PG II重组蛋白，并利用克隆表达的PG II重组蛋白免疫小鼠制备得到单克隆抗体，PG II抗原的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID N0.3 ；
(2)抗PGII抗体的包被:用包被机或移液器将包被缓冲液按100 μ I/孔加入微孔板；用盖板膜封闭微孔板，放置于4°C冰箱过夜；用稀释后的0.05M洗涤液洗板5次。其中，包被缓冲液为:0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.6);包被浓度为5μ g/ml ；
(3)抗PGII抗体的封闭:用包被机或移液器将封闭液按300 μ I/孔加入微孔板；盖板膜封闭微孔板，放置于37°C封闭I小时；用稀释后的0.05M洗漆液洗板5次。其中,封闭液为:0.2M磷酸盐缓冲液，1%BSA, 2.0%酪蛋白(ρΗ7.4)；
(4)真空包装:将上述处理后的微孔板放置于37°C烘箱干燥0.5小时；立即用真空封装机进行真空包装。
[0021]3、酶标抗体:PG 1-A、PG 1-B和PG II的单克隆抗体，标记的酶为辣根过氧化物酶；PG 1-A的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID N0.1, PG 1-B的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID N0.2 ；PG II为PG II抗原的全部基因序列，具体参见SEQ ID N0.3。
[0022]4、酶标抗体稀释液:0.1M Tris盐酸缓冲液，0.1%_1%BSA，0.5%_2.0%酪蛋白，l%-6% (NH4) 2S04,1%-5%SDS, 0.1%-1% 甘油，0.01%-0.1%DDT，5-10% 蔗糖，ρΗ8.5 ；
通过对酶标抗体稀释液配方的优化，能够加速抗原抗体反应，从而缩短检测时间。
[0023]5、校准品JfPG I抗原部分基因序列(PG I抗原部分基因序列为PG 1-A和PG 1-B, PG 1-A的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID N0.1，PG 1-B的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID N0.2)和PG II抗原全部基因序列(参见SEQ ID N0.3)通过基因工程克隆表达得到的PG I和PG II重组蛋白JfPG 1-A,PG 1-B和PG II按照一定比例混合并用校准品稀释液稀释，配制成以下浓度的校准品:
校准品浓度范围=PG I为0-90 μ g/L, PG II为0-48 μ g/L ;具体为:
校准品 I:(PG 1-A:0.0 μ g/L、PG 1-B:0.0 μ g/L、PG I1:0.0 μ g/L)
校准品 2: (PG 1-A:15.0 μ g/L、PG 1-B: 15.0 μ g/L, PG I1:6.0 μ g/L)
校准品 3: (PG 1-A:35.0 μ g/L、PG 1-B:35.0 μ g/L、PG I1:12.0 μ g/L)
校准品 4: (PG 1-A:60.0 μ g/L、PG 1-B:60.0 μ g/L、PG I1:24.0 μ g/L)
校准品 5: (PG 1-A:90.0 μ g/L、PG 1-B:90.0 μ g/L、PG I1:48.0 μ g/L)
其中，校准品稀释液为:0.1M PBS, ρΗ7.4。
[0024]6、质控品JfPG I抗原部分基因序列(PG I抗原部分基因序列为PG 1-A和PG 1-B, PG 1-A的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID N0.1，PG 1-B的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID N0.2)和PG II抗原全部基因序列(参见SEQ ID N0.3)通过基因工程克隆表达得到的PG I和PG II重组蛋白JfPG 1-A, PG 1-B和PG II按照比例混合，用校准品稀释液稀释得到质控品，质控品中各组分浓度为=PG 1-A:30.0 μ g/L, PG 1-B:30.0 μ g/L、PG I1:16.0 μ g/L。
[0025]7、底物液:0.2mg/ml 过氧化脲，0.1M 柠檬酸缓冲液 ρΗ5.5，TMB 0.5mg/ml，0.1%DMSO。
[0026]8、终止液:2M硫酸。
[0027]9、浓缩洗涤液:0.5M磷酸盐缓冲液，1.8%十二烷基硫酸钠，pH7.4。
[0028]10、说明书
本发明的试剂盒的检测方法