一种胁迫条件下低蛋白酶a外泌酵母菌株及其构建方法
【专利摘要】本发明提供了一种在胁迫条件下调节蛋白酶A胞内外分泌的新方法，是通过敲除蛋白酶A编码基因即PEP4基因的一个等位基因的同时过表达编码液泡分选受体的MRL1基因来实现的。本发明选育的酿酒酵母菌株明显降低了蛋白酶A的胞外分泌量，能够提高纯生啤酒的泡持性，胞外蛋白酶A酶活较出发菌株有明显降低，约降低到出发菌株的54％，同时，重组菌株的胞内蛋白酶A酶活跟出发菌株相比无显著变化。本发明为降低蛋白酶A胞外酶活的同时不改变发酵特性提供了一种的新的思路和方法，对提高工业酵母泡沫稳定性具有指导意义。
【专利说明】一种胁迫条件下低蛋白酶A外泌酵母菌株及其构建方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物工程【技术领域】，涉及工业微生物的育种，特别是一株在发酵末期 胁迫条件下适合低蛋白酶A外泌的酵母菌株及其构建方法。
【背景技术】：
[0002] 在纯生啤酒发展的过程中，一些有关纯生啤酒的质量问题一直困扰着酿造工程 师，其中纯生啤酒的泡沫稳定性问题尤为突出。由于纯生啤酒在包装前未经过巴氏灭菌，在 发酵末期，氮源不足，高的酒精和二氧化碳浓度会给酵母造成一个胁迫环境，导致蛋白酶A 的外泌，分解泡沫阳性蛋白，降低啤酒泡持性，对纯生啤酒的泡沫质量产生不利影响。因此， 提高纯生啤酒的泡沫稳定性，成为当今世界改善纯生啤酒质量的一个重大技术难题。
[0003] 虽然，通过优化发酵工艺，或者添加泡沫稳定剂能够从一定程度上改善啤酒泡沫 稳定性，但是这种方法都不能从源头上解决泡沫衰减问题。基因工程上通过敲除产生蛋白 酶A的基因 PEP4来降低蛋白酶A外泌，从而使啤酒的稳定性增加。但是，由于胞内蛋白酶A 对酿酒酵母细胞的生理生化功能有很重要的作用，例如参与液泡内多种酶的成熟和激活过 程；影响细胞内一些糖代谢酶的正常表达等。所以PEP4缺失菌株的发酵特性会受到胞内蛋 白酶A缺失的影响。
[0004] 正常代谢条件下酿酒酵母蛋白酶A的分泌过程是，前蛋白酶A原（preproPrA)在 粗面内质网合成后，先经过内质网的修饰和折叠，再运输到高尔基体，最终被液泡分选受体 定向运输至液泡并在液泡中形成成熟的蛋白酶A(PrA)。MRLl基因作为编码液泡分选受体 的基因，在蛋白酶A从高尔基体向液泡定向分泌的过程中起着重要作用。当蛋白酶A原前 肽上的识别位点与分选受体特异性结合，蛋白酶A原从反面高尔基体网络被输送至液泡， 并在到达液泡后被激活，由54个氨基酸残基组成的前肽被切除，最后形成分子量约42kD活 性蛋白酶A。但是随着发酵后期各种营养物质缺乏、氮源不足等胁迫条件下就会错误地运送 到胞外，并在胞外被激活。
[0005] 然而，目前对于在胁迫条件下，通过调控液泡分选受体的表达量来控制蛋白酶A 的内外分泌的研究报道很少，理论基础尚属不清楚，尤其是在选育低蛋白酶A外泌的酵母 菌株的研究方面更是空白，因此，本发明通过设置一个氮源缺乏，并且高的酒精和二氧化碳 浓度的胁迫环境，来模拟啤酒发酵后期的发酵条件，首先确定MRLl基因在胁迫条件下对蛋 白酶A分泌的调控作用，进而通过构建一株敲除PEP4基因同时过表达MRLl基因的酿酒酵 母菌株，在降低蛋白酶A外泌的同时保证菌体的正常代谢不受影响。进而选育出适合发酵 的低产蛋白酶A菌株，这种方法对于提高啤酒泡沫稳定性，尤其是纯生啤酒的泡沫稳定性 具有指导意义。
【发明内容】
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[0006] 本发明解决上述问题所采用的技术方案之一，是提供一种构建低蛋白酶外泌酿酒 酵母菌株的方法，所述方法是在酿酒酵母出发菌种中敲除蛋白酶A编码基因即PEP4基因的 一个等位基因的同时过表达编码液泡分选受体的MRLl基因，步骤如下：
[0007] (1)先将强启动子PGKlp-PGKlt片段插入到表达载体上，再将MRLl基因插入到启 动子PGKlp和终止子PGKlt之间，然后将KanMX抗性标记插入表达质粒，在此基础上将含有 PEP4基因上、下游同源臂的DNA分子插入质粒，最终得到重组质粒。
[0008] (2)以重组质粒为模板扩增出含有PEP4基因上、下游同源臂的DNA分子、强启动 子PGKlp-PGKlt、MRLl基因及KanMX抗性标记的重组片段，将重组片段化转入出发菌中，得 到敲除单个PEP4拷贝的同时过表达MRLl的重组菌株。
[0009] 具体如下：
[0010] (1)重组质粒的构建
[0011] ①以质粒PPGKl为模板，扩增其上的强启动子片段PGKlp-PGKlt，并连接到表达载 体上；
[0012] ②以出发菌株的总DNA为模板，扩增出MRLl基因片段，并将其插入到（1)-①所构 建质粒的启动子PGKlp和终止子PGKlt之间；
[0013] ③以含有Amp+抗性的穿梭质粒为模板，PCR扩增出KanMX抗性基因，并将其插入 到（1)-②所构建的质粒上；
[0014] ④以出发菌株的总DNA为模板，PCR扩增出PEP4基因的上、下游序列，并将其连接 到（1)-③所构建的质粒上，最终获得重组质粒；
[0015] (2)敲除PEP4同时过表达MRLl基因
[0016] ①以步骤（1)中的重组质粒为模板，扩增出含有PEP4基因上、下游同源臂的DNA 分子，强启动子，MRLl基因及KanMX抗性标记的重组片段；
[0017] ②用醋酸锂转化法将（2)_①中的重组片段转化入出发菌株中，得到敲除单个 PEP4拷贝的同时过表达MRLl基因的重组菌株。
[0018] 所述PEP4基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :1 ;
[0019] 所述MRLl基因的核昔酸序列如序列表中SEQ ID NO :2 ;
[0020] 优选的，所述出发菌株为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)RY1，编号CGMCC No2. 1525 ；
[0021] 优选的，所述表达载体为YEP352质粒；
[0022] 优选的，所述穿梭质粒为pUC6质粒。
[0023] 本发明所采用的技术方案之二，是提供一种由技术方案一构建的低分泌蛋白酶A 的酿酒酵母菌株，所述酿酒酵母菌株的出发菌株为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) RY1，编号CGMCC No 2. 1525 ;表达载体为YEP352质粒；表达载体为YEP352质粒。
[0024] 所述菌株胞内蛋白酶A的酶活跟出发菌株相比无显著变化，但是胞外酶活较出发 菌株得到显著降低，同时由于胞内酶活变化不显著使得重组菌株的代谢特性并未发生明显 改变。
[0025] 有益效果：
[0026] 1、本发明选育的酿酒酵母菌株明显降低了蛋白酶A的胞外分泌量，能够提高纯生 啤酒的泡持性，胞外蛋白酶A酶活较出发菌株有明显降低，约降低到出发菌株的54%，同 时，重组菌株的胞内蛋白酶A酶活跟出发菌株相比无显著变化。
[0027] 2、重组菌株跟出发菌株相比，在发酵过程中，耗糖速率和α-氨基氮同化速率变 化不大，表观糖度均能降低到4° Brix以下，达到发酵结束的标准；发酵结束后，两株菌的 残糖和酒精度也基本相当。可见，本发明所提供的基因工程菌在降低蛋白酶A外泌的同时 并未影响菌株的正常代谢。
[0028] 3、本发明选育的低分泌蛋白酶A的酿酒酵母菌株是通过敲除PEP4基因的一个等 位基因的同时过表达MRLl基因的，这为胁迫条件下选育低分泌蛋白酶A的酿酒酵母菌株提 供了一个新的方向。
【专利附图】
【附图说明】：
[0029] 图1重组质粒Yep-PMKZ的构建流程示意图；
[0030] 图2重组质粒Y印-PMKZ的验证电泳图；
[0031] 其中泳道 M 为 5000 bp DNA Ladder Marker ;
[0032] 泳道1为以Y印-PMK为模板，MRLl-U和MRLl-D为引物，PCR验证1146bp的MRLl 基因片段；
[0033] 泳道2为以Y印-PMK为模板，KAN-U和KAN-D为引物，PCR验证1613bp的KanMX基 因片段；
[0034] 泳道3为以Y印-PMK为模板，PGK-U和MRLl-D为引物，PCR验证MRLl的连接方向， 产物大小为2625bp ;
[0035] 泳道4为以Y印-PMKU为模板，PA-U和PA-D为引物，PCR验证121 Obp的MU基因片 段；
[0036] 泳道5为以Y印-PMKZ为模板，PB-U和PB-D为引物，PCR验证1327bp的MD基因片 段；
[0037] 图3基因盒MU-KanMX-PGKlp-MRLl-PGKlt-MD片段与酵母基因组的同源重组示意 图；
[0038] 图4重组菌株验证电泳图；
[0039] 其中泳道 M 为 5000 bp DNA Ladder Marker ;
[0040] 泳道1，2以YZM-S和YZM-X为引物进行验证；泳道3, 4以YZM-XS和YZM-XX为引 物进行验证；泳道1，3的模板为出发菌株RYI，均不能扩增出条带；泳道2, 4的模板为重组 菌株RPMKZ，可以分别扩增出1720bp，2077bp大小的特异性条带；
[0041] 图5重组菌株和出发菌株的α -氨基氮的变化趋势；
[0042] 图6重组菌株和出发菌株的表观糖度的变化趋势。
【具体实施方式】：
[0043] 下面通过具体的实施方案叙述本发明的低分泌蛋白酶A的酿酒酵母菌株及其构 建方法。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0044] 实施例I :ΡΕΡ4基因敲除且MRLl基因过表达菌株的构建
[0045] (I)Y印-PMKZ质粒的构建
[0046] 重组质粒Yep-PMKZ的构建流程如图1所示。
[0047] ①以pPGKl质粒为模板，PCR扩增出强启动子PGKlp-PGKlt基因片段；
[0048] 上游引物 PGK-U :CGCGGATCCTCTAACTGAT CTATCCAAAACTGA(SEQ ID NO: 3)
[0049] 下游引物 PGK-D :CGCGTCGACTAACGAACGCAGAATTTTC(SEQ ID NO :4)
[0050] 划线部分为酶切位点
[0051] ?〇?反应条件：951：5111丨11;941：458 ;611：1111丨11;721：1008,30个循环；721：1011^11， 0. 8 %琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物；
[0052] PCR 反应体系（20 μ L)
【权利要求】
1. 一种构建低蛋白酶外泌酿酒酵母菌株的方法，其特征在于，所述方法是在酿酒酵母 出发菌株中敲除蛋白酶A编码基因即PEP4基因的一个等位基因的同时过表达编码液泡分 选受体的MRL1基因。
2. 如权利要求1所述的一种构建低蛋白酶外泌酿酒酵母菌株的方法，其特征在于，构 建步骤如下： (1) 将强启动子PGKlp-PGKlt片段插入到表达载体上，再将MRL1基因插入到启动子 PGKlp和终止子PGKlt之间，然后将KanMX抗性标记插入表达质粒，在此基础上将含有PEP4 基因上、下游同源臂的DNA分子插入质粒，最终得到重组质粒； (2) 以重组质粒为模板扩增出含有PEP4基因上、下游同源臂的DNA分子、强启动子 PGKlp-PGKlt、MRL1基因及KanMX抗性标记的重组片段，将重组片段化转入出发菌株中，得 到敲除单个PEP4拷贝的同时过表达MRL1的重组菌株。
3. 如权利要求1或2所述的一种构建低蛋白酶外泌酿酒酵母菌株的方法，其特征在于， 构建步骤如下： (1) 重组质粒的构建 ① 以质粒pPGKl为模板，扩增其上的强启动子片段PGKlp-PGKlt，并连接到表达载体 上； ② 以出发菌株的总DNA为模板，扩增出MRL1基因片段，并将其插入到（1)-①所构建质 粒的启动子PGKlp和终止子PGKlt之间； ③ 以含有Amp+抗性的穿梭质粒为模板，PCR扩增出KanMX抗性基因，并将其插入到 (1)-②所构建的质粒上； ④ 以出发菌株的总DNA为模板，PCR扩增出PEP4基因的上、下游序列，并将其连接到 (1)-③所构建的质粒上，最终获得重组质粒； (2) 敲除PEP4同时过表达MRL1基因 ① 以步骤（1)中的重组质粒为模板，扩增出含有PEP4基因上、下游同源臂的DNA分子， 强启动子，MRL1基因及KanMX抗性标记的重组片段； ② 用醋酸锂转化法将（2)-①中的重组片段转化入出发菌株中，得到敲除单个PEP4拷 贝的同时过表达MRL1基因的重组菌株。
4. 如权利要求1或2所述的一种构建低蛋白酶外泌酿酒酵母菌株的方法，其特征在于， 所述PEP4基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :1 ;所述MRL1基因的核苷酸序列如序 列表中 SEQ ID NO :2。
5. 如权利要求1或2所述的一种构建低蛋白酶外泌酿酒酵母菌株的方法，其特征在于， 所述出发菌株为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)RYl，编号 CGMCC No 2.1525。
6. 如权利要求1或2所述的一种构建低蛋白酶外泌酿酒酵母菌株的方法，其特征在于， 所述表达载体为YEP352质粒。
7. 如权利要求1或2所述的一种构建低蛋白酶外泌酿酒酵母菌株的方法，其特征在于， 所述穿梭质粒为pUC6质粒。
8. -株低蛋白酶外泌酿酒酵母菌株，其特征在于，所述菌株由权利要求1或2所述 的方法构建，所述出发菌株为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)RYl，编号CGMCC No 2. 1525,所述表达载体为YEP352质粒，所述穿梭质粒为pUC6质粒。
9.权利要求8所述的低蛋白酶外泌酿酒酵母菌株在啤酒生产中的应用。
【文档编号】C12N15/81GK104403957SQ201410782691
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月16日 优先权日:2014年12月16日
【发明者】陈叶福, 肖冬光, 韩月然, 龚瑞, 郭学武, 董健, 张翠英, 杜丽平, 马立娟 申请人:天津科技大学