如下:(1)首先在微孔板反应孔中依次加入10μ I待测样本和90 μ I稀释后的酶标抗体(用酶标抗体稀释液稀释酶标抗体1000倍后使用)，混匀；校准品和质控品也按照上述方法加入；
(2)37°C孵育45分钟；
(3)用稀释好的洗涤液洗板5次，扣干；
(4)加入底物液100μ 1，盖上盖板膜，37°C温育避光显色15分钟；
(5)加入终止液50μ1，然后立即用酶标仪测定450nm吸光值，绘制胃蛋白酶原I (PG I的量为PG 1-A和PG 1-B之和)标准曲线和胃蛋白酶原II标准曲线，根据标准曲线计算待测样本中胃蛋白酶原PG I和PG II具体含量。
[0029]待测样本检测结果所得OD45tlnm吸光值，经标准曲线计算出浓度值，浓度值参照以下范围判断:
PG I正常值范围为:70-180ng/ml ；
PG II正常值范围为:0-16ng/ml ；
PG I /PG II正常值范围为:彡7.0。
[0030]胃部疾病的判断:
慢性萎缩性胃炎=PG I彡70且PG I /PG II ^ 7.0 ；
幽门螺旋杆菌感染:PG II >16 ；
胃溃疡=PG I >180 且 PG II >16 ；
胃癌:PG I 彡 30 且 PG I /PG II^ 3.00
[0031]应用本发明的试剂盒进行检测，检测结果与胃镜检查结果(金标准)相比较:慢性萎缩性胃炎的符合率为82.6%、幽门螺旋杆菌感染的符合率为78.2%、胃溃疡的符合率为67.5%、胃癌的符合率为73.8%。
[0032]最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0033]
序列表
<110>江苏宜偌维盛生物技术有限公司
〈120〉一种胃蛋白酶原I和II联合检测试剂盒
<170> Patent In vers1n 3.5
〈210〉 I
〈211〉 422
〈212〉 DNA
〈213〉PG I部分抗原核苷酸序列 〈400〉 I
atggcaccct ccctcctccc catggtgcaa ggttacaatg gaaaatgcct cagctggaaa60
gatctcagaa tgtggctcag ggcagccaca atcttatcag gaacttctct gtatgggatc120
agcggaaccg gtgactttca gaggccgata aggcgggacc caacttgtat ataaggggca180
gctcatgctg ctgctctgca ccttactccc atcttgcctt ctccctcgag ttgggacccg240
ggaagaacca tgaagtcgct gctgctgctg ggtctggtgg cgctctctga gtgcatcatg300
tacaagtgag tccgggtggt gtgggtgtga agacgctgcc tcgcacatca cctttctttc360
ctccgtgtct tccttcttcc ctctttggcc cctctctatt cagctgtctc catccccctt420
tt422
〈210〉 2 〈211〉 294 〈212〉 DNA
〈213〉PG I部分抗原核苷酸序列 〈400〉 2
ggtcaggaga atccttgcct aattcctgtt ccttctccaa accacagggt ccccctcatc60
agaaagaagt ccatcaggcg caccctgtcc gagcgtggcc tgctgaagga cttcctgaag120
aagcacaacc tcaacgcagc cagaaagtac ttcccccagt gggaggctcc caccctggta180gatgaacagc ccctggagaa ctacctggat gtgagtgtgt gggcaagtgg tggggccagc240
tctgaggact tggcccgcag aaggagggtg tcccaggggt cttgaggagg gctg294〈210〉 3〈211〉 1392〈212〉 DNA
〈213〉PG II抗原核苷酸序列〈400〉 3
cttcactcca ctgcgactgc agaactcaga gctgctcttc ctatgtggcc agttggggac60
cagcatcatg aagtggatgg tggtggtctt ggtctgcctc cagctcttgg atgcagcagt120
ggtcaaagtg cccctgcaga aatttaagtc tatccgtgag accatgaagg agaagggctt180
gctgggggag tacctgagga cccacaagta tgatcctgct tggaagtacc gctttggtga240
cctcagcgtg acctacgagc ccacggccta catggatgct gcctactttg gtgagatcag300
catcgggact ccaccccaga acttcctggt ccttattgac accggctcct ccaacttgtg360
ggtgccctct gtctaatgcc agagccaggc ctgcaccagt cactcccgct tcaaccccag420
cgagtcgtcc acctactcta ccaatgggca gaccttctcc ctgcagtatg gcagtggcag480
cctcaccggc ttctttggct atgacacact gactgtccag agcatccagg tccccaacca540
ggagtgcggc ttgagtgaga atgagcctgg taccaacttc gtctatgcgc agtttgatgg600
catcatgggc ctggcatacc ctgctctgtc cgtggatgag gccaccacag ctatgcaggg660
catggtgcag gagcgcgccc tcaccagccc cgtcttcagc gtctacctca gcaaccagca720
gggctccagc ggtggagcgg ttgtctttgg gggtgtggat agcagcctgt acacggggca780
gatctactgg gcgcctgtca cccaggaact ctactggcag attggcattg acgagttcct840
catcggcggc caggcctccg gctggagttc tgagggttgc caggccatcg tggacacagg900
cacctctctg ctcactgtgc ctcagcagta catgagtgct cttctgcagg ccacaggggc960
ccaggaggat gagtatggac agtctctcgt gaactgtaac agcattcaga atctgcccag1020
cttgaccttc atcatcaatg gtgtggagtt cactctgcca ccttcctcct atatcctcag1080
taacaacggc tactgcaccg tgggagtcga gtccacctac ctgtcctccc agaacggcca1140
gcccctgtgg atcctcggcg atgtcttcct caggtcctac tattccgtct acgacttggg1200
caacaacaga gtaggctttg ccactgccgc ctagacttgc tgcctcgaca cgtgagctcc1260
cctcttcctc ttgaccctgc acgctcctag ggcattgtat ctgtctttcc actctggatt1320
cagcctcctt tttctggact ctggactttc tctaataata aatagttctt ctttaaaaaa1380
BBI392
【主权项】
1.一种胃蛋白酶原I和II联合检测试剂盒，包括已包被抗PG I和PG II抗体的酶联板，其特征在于:所述抗PG I抗体是将PG I抗原部分基因序列PG 1-A和PG 1-B分别通过基因工程克隆表达得到PG 1-A和PG 1-B重组蛋白，并利用克隆表达的重组蛋白免疫小鼠制备得到单克隆抗体；所述PG 1-A的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID N0.1，所述PG 1-B的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID N0.2 ;所述抗PG II抗体是将PG II抗原基因序列通过基因工程克隆表达得到PG II重组蛋白，并利用克隆表达的PG II重组蛋白免疫小鼠制备得到单克隆抗体，所述PG II抗原的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID N0.3。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括酶标抗体，所述酶为辣根过氧化物酶，所述抗体为PG 1-A, PG 1-B和PG II的单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括酶标抗体稀释液，所述稀释液的配方为:0.1M Tris盐酸缓冲液，0.1%-1%BSA，0.5%_2.0%酪蛋白，1%_6% (NH4)2S04,1%-5%SDS, 0.1%-1% 甘油，0.01%-0.1%DDT，5-10% 蔗糖，ρΗ8.5。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述包被时的包被液为:0.1M碳酸盐缓冲液，PH值为9.6 ;包被浓度为5 μ g/ml。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:封闭所述抗PGI和PG II抗体时使用的封闭液为:0.2M磷酸盐缓冲液，1%BSA, 2.0%酪蛋白；封闭液的pH值为7.4。
6.应用权利要求1-5任一所述的试剂盒联合检测胃蛋白酶原I和II的方法，其特征在于:步骤如下: (1)在微孔板反应孔中分别加入10μ I校准品、质控品和待测样本，再加入90 μ I稀释的酶标抗体，混匀； (2)37°C孵育45分钟；洗涤； (3)加入底物显色，加入终止液，在酶标仪上读取OD45tl数值，绘制胃蛋白酶原I标准曲线和胃蛋白酶原II标准曲线，根据胃蛋白酶原I标准曲线和胃蛋白酶原II标准曲线计算待测样本中胃蛋白酶原PG I和PG II具体含量。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:步骤(I)中酶标抗体的稀释倍数为1000倍。
8.PG 1-A, PG 1-B和PG II在制备联合检测胃蛋白酶原I和II试剂盒中的应用。
9.PG 1-A, PG 1-B和PG II在联合检测胃蛋白酶原I和II中的应用。
【专利摘要】本发明提供一种胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ联合检测试剂盒，包括已包被抗PGⅠ和PGⅡ抗体的酶联板，抗PGⅠ抗体是将PGⅠ抗原部分基因序列PGⅠ-A和PGⅠ-B分别通过基因工程克隆表达得到PGⅠ-A和PGⅠ-B重组蛋白，并将其免疫小鼠制备得到单克隆抗体；PGⅠ-A的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.1，PGⅠ-B的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.2；抗PGⅡ抗体是将PGⅡ抗原基因序列通过基因工程克隆表达得到PGⅡ重组蛋白，并将其免疫小鼠制备得到单克隆抗体，PGⅡ抗原的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.3。本发明的试剂盒可同时检测PGⅠ和PGⅡ，操作简单，检测快速。
【IPC分类】G01N33-577
【公开号】CN104698174
【申请号】CN201510091154
【发明人】杨雷, 刘扬, 刘琴, 代丽, 陶恒平
【申请人】江苏宜偌维盛生物技术有限公司
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年2月28日