一种鸭胚早期性别鉴定方法及专用试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于家禽性别鉴定技术领域，具体涉及一种鸭胚早期性别鉴定方法及专用 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 鸭的性别鉴定方法一般为外观鉴定法、摸肛鉴定法、声音鉴定法和分子鉴定法。外 观鉴定法根据公母鸭的体型外貌特征区别，常有误判；摸肛鉴定法虽然准确率较高，存在一 些垂直传播病菌交叉感染的风险，摸肛对技术要求比较高，需要生产实践经验丰富才能保 证准确率；声音鉴定法需要鸭的鸣管发育好后才能区别，在出壳至青年期很难区分；分子 鉴定法虽然简单准确，利用性染色体上（Z染色体、W染色体）特殊基因的片段大小不同而 判定性别，在胚胎期鉴定性别以终止胚胎发育为代价，不能做到鉴定性别后胚胎仍然可以 继续孵化出壳。
[0003] 现有专利US6506570B1利用放射性免疫法鉴定了禽类性别，然而，放射性法由于 存在污染的危害，现在已经很少使用。而且国外试剂盒成本非常高，一般研究单位很难承受 昂贵的成本。国内有南京某公司建立了基于生物素双抗体夹心技术原理的ELISA试剂盒， 在检测了我们收集的尿囊液样品后，无法利用检测结果区别雌雄性别。而且，建立小分子的 酶联免疫试剂盒一般不适用生物素双抗体夹心技术原理。因此，目前生产上急需开发一种 方法简单、重复性好、成本低、方便取样的性别鉴定方法及检测试剂盒，既能准确快速在早 期鉴定鸭的胚胎性别，又能大大降低成本。这种方法易于实施，取样后胚胎可以继续孵化出 壳，还可替代出壳后雌雄分开的人工性别鉴定，防止了由于翻肛鉴定导致垂直疾病的传播， 不存在将不需要的公鸭或母鸭杀死而导致的动物福利问题。
[0004] 尽管ELISA检测方法和试剂盒是一个常用的技术，到目前为止还未见有禽类性别 鉴定方法尤其是鸭胚性别鉴定方法中采用间接ELISA方法的报道，
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，利用间接ELISA方法建立一种鸭胚早期 性别鉴定方法及专用试剂盒。本发明实现了方便简洁的获取试验样本和建立一种鸭胚早期 性别鉴定方法及专用试剂盒，减少因传统出壳后的翻肛鉴定性别导致垂直传播疾病的继续 流行的弊端，对鸭胚早期性别鉴定准确率达到1〇〇%。
[0006] 本发明通过以下技术方案实现：
[0007] 申请人建立了一种鸭胚早期性别鉴定的间接ELISA方法，其步骤包括制备酶标板 和样品处理，具体包括下列步骤：
[0008] (1)从孵化机中取出鸭胚，大头向上，静置3_5min，利用照蛋器照蛋，寻找抽取尿 囊液的定位处，在定位开口抽取尿囊液的区域，避开血管分布处，定位后做上标记，用75 % 酒精溶液消毒开口处，以一次性针头刺穿蛋壳后再用一次性无菌注射器或移液器伸入蛋壳 抽取尿囊液，注入无菌EP管，得到尿囊液样品，保存于-20°C冰箱备用；
[0009] ⑵配制ELISA核心试剂，所述核心试剂包括：雌二醇蛋白包被的酶标板（购自武 汉华美生物工程有限公司），雌二醇单克隆抗体（购自武汉华美生物工程有限公司），标准 品，标准品稀释剂，显色剂，终止液，洗涤液和酶标二抗；所述的标准品为雌二醇，所述的标 准品稀释剂为含有1 %氯化钾的IX磷酸盐缓冲液，所述的显色剂为3, 3'，5, 5' -四甲基联 苯胺，所述的终止液为2mol/l的硫酸，所述的洗涤液为0.0 lmol/L PBST ;所述的酶标二抗 为山羊抗小鼠IgG ;
[0010] 按如下步骤制备得到：
[0011] 1)ELISA酶标板的包被：以雌二醇蛋白作为抗原，用pH 9. 6的0? 05mol/L的碳酸 盐缓冲液稀释至包被浓度〇. 2ug/mL，包被ELISA酶标板，加入封闭液（5g脱脂乳溶于100ml 洗涤液），制备包被好的酶标板；
[0012]2)山羊抗小鼠酶标二抗的制备：将山羊抗小鼠IgG-HRP酶标抗体，用IX磷酸盐 缓冲液按体积比1:600稀释成工作浓度，再用0. 22 y m的滤膜过滤除菌，无菌分装后置2~ 8 °C保存备用；
[0013] 3)显色剂的制备：将3, 3'，5, 5'-四甲基联苯胺溶于二甲亚砜制成；
[0014] 4)终止液的制备：将浓硫酸配制为2mol/L的盐酸；
[0015] 5)洗涤液的制备：
[0016]a.储备液A液和储备液B液
[0017] 0? 2mol/L的储备液 A 液：将 6.2404g的NaH2P04?2H20溶于200ml ddH20中；
[0018] 0? 2mol/L的储备液 B 液：将71. 628g的Na2HP04?12H20溶于1000ml ddH20 ;
[0019] b. 0? lmol/L PBST 缓冲液，pH = 7. 2-7. 4
[0020] 将 0? 2mol/L PBST 缓冲液 A 液 95ml+，0. 2mol/L B 液 405ml，ddH20 500ml，NaCl 8. 5g和0? 05 %吐温-20混合；
[0021] c. 0?Olmol/L的 PBST 缓冲液
[0022] 将 0? 2mol/L 的储备液 A 液 47. 5ml，0? 2mol/L 的储备液 B 液 202. 5ml，ddH20 4747. 5ml，NaCl 45g，IN 的 NaOH 10ml 和吐温-20 2. 5ml 混合；
[0023] (3)标准品浓度梯度的确定及检测步骤：
[0024] 1)标准品浓度梯度的确定：设置标准品梯度浓度依次为0ng/ml，0. 05ng/ml， 0? 15ng/ml,0. 45ng/ml,L 0ng/ml 和 2. 0ng/ml;
[0025] 2)检测步骤：
[0026] a.将配制的核心试剂及收集的待测样本移至20_25°C室温下进行平衡至少 30min；
[0027] b.取一块酶标板，在酶标板的每孔中依次添加标准品浓度梯度试剂，然后按顺序 在每孔中加入待检鸭胚尿囊液50 y L，此后再加入雌二醇单克隆抗体50 y L，用板贴封板， 轻轻震荡混匀，于37°C反应30min;
[0028] c.取出步骤b的酶标板，甩干酶标板孔内的液体，按250ii L/孔的量用稀释好的洗 涤液洗板4次，每次浸泡30秒，在吸水纸上拍干；
[0029] d.向酶标板的孔中加入100 iiL山羊抗小鼠IgG(购自武汉谷歌生物科技有限公 司），用板贴封板，轻轻震荡混匀，于37°C反应30min;
[0030]e.取出酶标板，甩干孔内液体，按250 ii L/孔的量用稀释好的洗涤液洗板4次，每 次浸泡30秒，在吸水纸上拍干；
[0031] f.在酶标板的每孔中加入显色剂lOOil L，轻轻震荡，于37°C避光显色15min ;
[0032] g.向酶标板的每孔中加入终止液50 ii L，当酶标板的小孔中的颜色由蓝色转为黄 色时判定为终止反应；
[0033] h.加入终止液后5min内立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的0D值（标准曲线 公式如图3和图4);
[0034] i.标准曲线公式的拟合：如图3所示，Y = 1. 6474x2-3. 662x+0. 6417,和如图4所 示，Y = 1. 3414x2-3. 4603x+0. 6809 ;
[0035] (4)结果判定
[0036] 将样品的0D值带入如图3和图4所示的公式得到样品中雌二醇的含量；当测定 的样品中的雌二醇含量高于lng/ml时，判定为雌性；当测定的样品中的雌二醇含量低于 0? 6ng/ml，判定为雄性。
[0037] 基于上述方法，申请人研制了一种鸭胚早期性别鉴定的ELISA试剂盒，其包括固 相载体，酶标板、显色剂、终止液和洗涤液；所述的试剂盒还包括一抗雌二醇单克隆抗体，酶 标二抗山羊抗小鼠IgG，标准品，标准品稀释剂和板贴，所述的固相载体为雌二醇蛋白，所 述的标准品为雌二醇，所述的标准品雌二醇的浓度依次设置为〇ng/ml，0. 05ng/ml，0. 15ng/ ml，0. 45ng/ml，1. 0ng/ml，2. Ong/ml梯度；所述的标准品稀释剂为含有1%氯化钾的IX磷 酸盐缓冲液，所述的显色剂是将3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺溶于二甲亚砜获得；所述的终止 液为2mol/L的硫酸。
[0038] 本发明的ELISA试剂盒可在鸭胚早期性别鉴定的间接ELISA方法中的应用，优选 是荆江麻鸭和白改鸭胚胎早期性别鉴定。
[0039] 与现有技术相比本发明的积极效果是：
[0040] (1)本发明取样方法不影响鸭胚胎的继续正常发育。
[0041] (2)本发明建立的检测方法利于动物福利并能降低垂直疾病传播。
[0042] (3)本发明的原材料来源稳定，方法简单易行，能够在鸭胚胎发育早期中使用。
[0043] (4)本发明建立的检测试剂盒结果稳定、重复性好，对鸭胚早期性别鉴定准确率达 到100 %且检测成本较低，适合基层单位推广应用。
【附图说明】
[0044] 图1:是本发明的间接竞争ELISA法技术流程图。
[0045] 图2:本发明的试剂盒组装流程。
[0046] 图3:是白改鸭尿囊液测定时制作的标准曲线及拟合的标准曲线公式。
[0047]图4:是荆江麻鸭尿囊液测定时制作的标准曲线及拟合的标准曲线公式。
【具体实施方式】
[0048] 下面结合实例，对本发明作进一步详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
[0049]实施例1前期样本的收集及核心试剂的配制[0050] 1、鸭胚尿囊液的收集
[0051] 从孵化机中取出鸭胚（品种为荆江麻鸭或白改鸭，但不限于这两个品种），大头 向上，静置3-5min，利用照蛋器照蛋，寻找抽取尿囊液的定位处，在定位开口抽取尿囊液的 区域应避开血管分布处，作标记，用75%酒精消毒开口处，以一次性针头刺穿蛋壳后再用 一次性无菌注射器或移液器伸入蛋壳抽取尿囊液，注入无菌EP管，得到尿囊液样品，保存 于-20°C冰箱备用；
[0052] 2、利用抗原蛋白（雌二醇蛋白）包被酶标板
[0053] 将终浓度为40 y g/ml的雌二醇蛋白（购自武汉华美生物工程有限公司）用包被 液（25mmol/L 碳酸盐缓冲液：Na2C03 1. 59g，NaHC03 2. 93g，用 ddH20 定容至 1000ml，pH9. 6) 分别进行体积比1:200稀释（终浓度均为0. 2 y g/ml)，雌二醇蛋白以1:1的体积比按每孔 lOOul的量加到酶标板（购自武汉华美生物工程有限公司）中，置4°C下作用10~12h ; 弃去包被液，用洗涤液（见《
【发明内容】
》中试剂盒的洗涤液配方）洗涤2~3次，每次2min， 甩干洗涤液，每孔加封闭液（5g脱脂乳溶于100ml洗涤液）100 yl，置37°C下温育lOOmin ; 拍干，再置37°C下干燥30min，用锡箔封口膜将抗原包被板封闭，置4°C下保存。
[0054] 3、二抗和核心试剂的制备
[0055] 1)山羊抗小鼠酶标二抗：将山羊抗小鼠IgG(购自武汉谷歌生物科