一种阪崎肠杆菌检测试剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种细菌检测试剂及其制备方法，具体涉及一种用于检测奶粉或牛奶 中阪崎肠杆菌的试剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 阪崎肠杆菌（Cronobacter sakazakii)是革兰氏阴性菌，能运动，无芽孢且兼性厌 氧。以前一直被认为是黄色阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae)到1980年才更名为"阪崎 肠杆菌"。2008年又将阪崎肠杆菌定义为肠杆菌的一个新属一克罗诺杆菌属（Cronobacter spp) 〇
[0003] C. sakazakii是一种能够在动物和人体内寄生的致病菌，能够引起严重的新生儿 脑膜炎、坏死性小肠结肠炎及菌血症，并能引起神经系统后遗症甚至死亡。该菌感染引起的 死亡率高达50%以。近年来，对C. sakazakii在食品、饮品、加工原辅料、生态环境等多方面 的研宄发现其在自然界中分布广泛。现阶段还不能确定其具体的宿主和感染源，但发现婴 儿配方奶粉是它的主要感染渠道。
[0004] 1961年Urmenyi和Franklin首次发现两例由C. sakazakii引起的新生儿脑膜 炎以后从感染病人的感染部位、创伤部位和排泄物等中分离到C. sakazakii。第一个将 C. sakazakii与婴幼儿配方奶粉联系起来的是Muytjens，他们在研宄荷兰的八例新生儿 髓膜炎和败血症时，从冲调奶粉的器具中分离出阪崎肠杆菌。之后，世界各地也多次发现 C. sakazakii污染的事件。冰岛报道了三例婴幼儿奶粉引起感染C. sakazakii的案例。2001 年田纳西州的一个新生儿加护中心发生了十例C. sakazakii感染引起的脑膜炎，从同品牌 的同一批次婴幼儿配方奶粉产品中培养到了 C. sakazakii，生产该奶粉的公司召回了这批 产品。2004年，我国安徽阜阳发生劣质奶粉引发的"大头娃娃"事件，从87分阜阳劣质奶粉 样品中检测到十一例阪崎肠杆菌阳性样品。这些研宄表明，奶粉中C. sakazakii是危害生 命安全和健康的重要生物因素之一。
[0005] 2011年4月出台的《食品安全国家标准婴儿配方食品》（GB 10765-2010)将 C. sakazakii纳入检测范围。婴儿配方奶粉生产线上阪崎肠杆菌的有效检出对其风险控制 有着重要意义。因此，目前对简便、快捷、特异性好、低成本的阪崎肠杆菌检测方法的需求越 来越迫切。
【发明内容】
[0006] 本发明是为了解决现有的检测阪崎肠杆菌的胶体金试纸条无法定量检测的问题， 提供一种阪崎肠杆菌检测试剂及其制备方法。
[0007] 本发明阪崎肠杆菌检测试剂由试剂A和试剂B组成，其中所述试剂A包括缓冲液、 促凝剂、BSA和防腐剂；所述试剂B包括标记有抗阪崎肠杆菌多克隆抗体的胶体金颗粒、稳 定剂、缓冲液和防腐剂；试剂A中缓冲液的浓度为20~50mmol/L，促凝剂的浓度为2% (w/ v)，BSA的浓度为2% (w/v)，防腐剂的浓度为0. 1 %~0. 5% (w/v);试剂B中缓冲液的浓 度为20~50mmol/L，标记有抗阪崎肠杆菌多克隆抗体的胶体金颗粒的浓度为0. 08mg~0. 8mg/mL，稳定剂的浓度为2%~5% (w/v)，防腐剂的浓度为0. 1%~0. 5% (w/v)，所述试 剂A和试剂B的体积比为5:1。
[0008] 上述阪崎肠杆菌检测试剂的制备方法，包括如下步骤：
[0009] 一、将促凝剂、BSA和防腐剂加入到缓冲液中，制得试剂A ;
[0010] 二、将氯金酸与柠檬酸三钠按照质量比1:1加热煮沸制得胶体金溶液；将抗阪崎 肠杆菌多克隆抗体加入到胶体金溶液中，超滤，得到标记有抗阪崎肠杆菌多克隆抗体的胶 体金颗粒，将稳定剂、防腐剂和缓冲液混合得混合液，然后将混合液与标记有抗阪崎肠杆菌 多克隆抗体的胶体金颗粒混合，制得试剂B ;
[0011] 三、将试剂A和试剂B按照5:1的体积比混合，即得抗阪崎肠杆菌检测试剂。
[0012] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0013] 1、本发明利用胶体金匀相颗粒特性，将特定的抗阪崎肠杆菌多克隆抗体标记于胶 体金颗粒表面，当检测系统或检测环境中存在阪崎肠杆菌时，胶体金颗粒表面的抗体即将 与之对应的抗原捕获，并形成抗原_抗体复合物，进而造成局部胶体金颗粒的聚合或堆积， 使胶体金匀相试剂透光光谱由红色向蓝色光谱移动，这种移动主要反应为540nm处吸光度 的降低和660nm处吸光度的升高，从而达到定量检测检体中阪崎肠杆菌的目的，同时避免 了同类检测项目乳胶增强免疫比浊法试剂在反应后产生胶乳微球交联物吸附比色杯不易 清洗的缺点。
[0014] 2、本发明检测试剂中标记有抗阪崎肠杆菌多克隆抗体的胶体金颗粒为纳米金，颗 粒直径为60nm~90nm，可以做到定量检测。
[0015] 3、本发明可用于检测乳粉或牛奶中阪崎肠杆菌含量，适用于乳品检测过程中使用 的分光光度计、半自动生化分析仪和全自动生化分析仪等仪器。
[0016] 4、本发明检测线性范围大，可达IX 102~1X10 6cfu/mL，具有高分析灵敏度，高特 异性，使用方便且检测快速等特点。
【附图说明】
[0017] 图1为实施例六中胶体金颗粒大小与其它不同颗粒大小的胶体金分析能力比较； 图2为国标方法和本发明试剂检测结果的比较。
【具体实施方式】
[0018] 本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。本发明中涉及的重量体积比记为"w/v"，单位为"g/mL"。
【具体实施方式】 [0019] 一：本实施方式阪崎肠杆菌检测试剂由试剂A和试剂B组成，其中所 述试剂A包括缓冲液、促凝剂、BSA和防腐剂；所述试剂B包括标记有抗阪崎肠杆菌多克隆 抗体的胶体金颗粒、稳定剂、缓冲液和防腐剂；试剂A中缓冲液的浓度为20~50mmol/L，促 凝剂的浓度为2% (w/v)，BSA的浓度为2% (w/v)，防腐剂的浓度为0. 1%~0. 5% (w/v); 试剂B中缓冲液的浓度为20~50mmol/L，标记有抗阪崎肠杆菌多克隆抗体的胶体金颗粒 的浓度为〇? 〇8mg~0? 8mg/mL，稳定剂的浓度为2%~5% (w/v)，防腐剂的浓度为0? 1%~ 0. 5 % (w/v)，所述试剂A和试剂B的体积比为5:1。
【具体实施方式】 [0020] 二：本实施方式与一不同的是：试剂A和试剂B中的 缓冲液均为含有〇. 5%~5. 0% (w/v)BSA的Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸盐缓冲 液、甘氨酸缓冲液中的一种或几种按任意比组成的混合物。其它与一相同。
【具体实施方式】 [0021] 三：本实施方式与一或二不同的是：试剂A中的促凝 剂为PEG6000或Brij-35。其它与一或二相同。
【具体实施方式】 [0022] 四：本实施方式与一至三之一不同的是：试剂A和试 剂B中的防腐剂均为叠氮化钠。其它与一至三之一相同。
【具体实施方式】 [0023] 五：本实施方式与一至四之一不同的是：试剂B中的 稳定剂为蔗糖或海藻糖。其它与一至四之一相同。
【具体实施方式】 [0024] 六：本实施方式与一至五之一不同的是：所述标记有 抗阪崎肠杆菌多克隆抗体的胶体金颗粒的直径为60nm~90nm，颗粒含量为0. 08~0. 8mg/ mL。其它与一至五之一相同。
【具体实施方式】 [0025] 七：本实施方式与一至五之一不同的是：所述标记有 抗阪崎肠杆菌多克隆抗体的胶体金颗粒的直径为75nm~85nm。其它与一至 五之一相同。
【具体实施方式】 [0026] 八：本实施方式与一至七之一不同的是：所述试剂A 和试剂B的pH值均为7. 0~9. 0。其它与一至七之一相同。
【具体实施方式】 [0027] 九：本实施方式与一至七之一不同的是：所述试剂A 和试剂B的pH值均为7. 8~8. 2。其它与一至七之一相同。
【具体实施方式】 [0028] 十：本实施方式与一至九之一不同的是：所述标记有 抗阪崎肠杆菌抗体为多克隆抗体。其它与一至九之一相同。
【具体实施方式】 [0029] ^^一 ：本实施方式阪崎肠杆菌检测试剂的制备方法，包括如下步 骤：
[0030] 一、将促凝剂、BSA和防腐剂加入到缓冲液中，制得试剂A ;
[0031] 二、将氯金酸与柠檬酸三钠按照质量比1:1加热煮沸制得胶体金溶液；将抗阪崎 肠杆菌多克隆抗体加入到胶体金溶液中，超滤，得到标记有抗阪崎肠杆菌多克隆抗体的胶 体金颗粒，将稳定剂、防腐剂和缓冲液混合得混合液，然后将混合液与标记有抗阪崎肠杆菌 多克隆抗体的胶体金颗粒混合，制得试剂B ;
[0032] 三、将试剂A和试剂B按照5:1的体积比混合，即得抗阪崎肠杆菌检测试剂。
【具体实施方式】 [0033] 十二：本实施方式与^^一不同的是：试剂A中缓冲液 的浓度为20~50mmol/L，促凝剂的浓度为2% (w/v)，BSA的浓度为2% (w/v)，防腐剂的浓 度为0. 1%~0. 5% (w/v)。其它与^ 相同。
【具体实施方式】 [0034] 十三：本实施方式与^^一或十二不同的是：试剂B中 缓冲液的浓度为20~50mmol/L，标记有抗阪崎肠杆菌多克隆抗体的胶体金颗粒的浓度为 0.08~0.811^/1]1匕稳定剂的浓度为2%~5%(￥八），防腐剂的浓度为0.1%~0.5%(￥/ v)。其它与十一或十二相同。
[0035]
【具体实施方式】十四：本实施方式与【具体实施方式】十一至十三之一不同的是：步骤 二所述胶体金溶液中抗阪崎肠杆菌多克隆抗体的浓度为20~25 y g/mL。其它与具体实施 方式i 至十三之一相同。
【具体实施方式】 [0036] 十五：本实施方式与十一至十四之一不同的是：步骤 二所述胶体金溶液中抗阪崎肠杆菌多克隆抗体的浓度为21~24 y g/mL。其它与具体实施 方式十一至十四之一相同。
【具体实施方式】 [0037] 十六：本实施方式与十一至十五之一不同的是：试剂 A和试剂B中的缓冲液均为含有0. 5%~5. 0% (w/v)BSA的Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲 液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或几种按任意比组成的混合物。其它与具体实施 方式i 至十五之一相同。
【具体实施方式】 [0038] 十七：本实施方式与十一至十六之一不同的是：试剂 A中的促凝剂为PEG6000或Brij-35。其它与^^一至十六之一相同。
【具体实施方式】 [003