9] 十八：本实施方式与十一至十七之一不同的是：试剂 A和试剂B中的防腐剂均为叠氮化钠。其它与十一至十七之一相同。
[0040]
【具体实施方式】十九：本实施方式与【具体实施方式】十一至十八之一不同的是：试剂 B中的稳定剂为蔗糖或海藻糖。其它与【具体实施方式】十一至十八之一相同。
[0041]
【具体实施方式】二十：本实施方式与【具体实施方式】十一至十九之一不同的是：所述 标记有抗阪崎肠杆菌多克隆抗体的胶体金颗粒的直径为60nm~90nm。其它与具体实施方 Si 至十九之一相同。
【具体实施方式】 [0042] 二十一：本实施方式与十一至十九之一不同的是：所 述标记有抗阪崎肠杆菌多克隆抗体的胶体金颗粒的直径为75nm~85nm。其它与具体实施 方式i 至十九之一相同。
【具体实施方式】 [0043] 二十二：本实施方式与^^一至二^^一之一不同的是： 所述试剂A和试剂B的pH值均为7. 0~9. 0。其它与^^一至二^^一之一相 同。
【具体实施方式】 [0044] 二十三：本实施方式与十一至二十一之一不同的是： 所述试剂A和试剂B的pH值均为7. 8~8. 2。其它与^^一至二^^一之一相 同。
【具体实施方式】 [0045] 二十四：本实施方式与十一至二十三之一不同的是： 所述标记有抗阪崎肠杆菌多克隆抗体为具有不同免疫活性位点多克隆株抗体的混合物。其 它与i 至二十三之一相同。
【具体实施方式】 [0046] 二十五：本实施方式与十一至二十四之一不同的是： 配制氯金酸与柠檬酸三钠溶液时，使用〇.2ym滤膜过滤。其它与十一至 二十四之一相同。
【具体实施方式】 [0047] 二十六：本实施方式与十一至二十五之一不同的是： 标记有抗阪崎肠杆菌多克隆抗体的胶体金颗粒的浓度为0. 4mg/mL。其它与 i 至二十五之一相同。
[0048] 为验证本发明的有益效果，进行以下实验：
[0049] 实施例一、胶体金颗粒的制备（以下所有操作需在高洁净度无尘空间内完成） [0050] 1)准备工作：所有用到的玻璃容器先用洗洁剂洗涤并用流水冲洗干净，然后用硅 化试剂浸泡过夜，对所以制金器皿的内表面做硅化处理，再用蒸馏水冲洗干净，备用；
[0051] 2)配制1 % (w/v)氯金酸和1 % (w/v)柠檬酸钠溶液，使用0. 2 y m滤膜过滤；
[0052] 3)在清洗干净的1000ml圆底烧瓶中放入磁力搅拌子1枚，加入1000ml超纯水；
[0053] 4)加入一定体积浓度为1% (w/v)氯金酸，600rpm左右高速搅拌，并加热至溶液沸 腾，然后迅速将一定体积浓度为1 %柠檬酸钠溶液快速加入到烧瓶中，保持加热和剧烈搅拌 lOmin，溶液颜色先变黑色，然后逐渐变紫红色；
[0054] 5)冷却：关闭加热开关并继续搅拌lOmin，然后停止搅拌冷却至室温，用超纯水恢 复到原体积，即得到胶体金溶液；
[0055] 6)不同粒径的胶体金颗粒可根据加入氯金酸和柠檬酸钠的比例进行控制，最终以 电子粒度仪检测10mL胶体金溶液，以粒度仪显示结果为金颗粒的粒径结果使用。
[0056] 实施例二、试剂A的制备
[0057]试剂 A 的配方如下：Tris-Hcl 缓冲液、0?9 % NaCl (w/v)、2 % BSA(w/v)、0?1 % NaN3(w/v)、0. 05% Tween20(w/v)，可根据Tris的质量控制缓冲液的浓度，根据HC1的使用 量来调整缓冲液的pH值。
[0058] 实施例三、标记物的制备：
[0059] 1)取1毫升制备好的胶体金溶液加入到1. 5毫升的离心管内；
[0060] 2)用10%的碳酸钾溶液将离心管内的胶体金溶液调至pH值为8. 0~10. 0 ;
[0061] 3)将一定量抗体加入到离心管中，震荡30分钟；
[0062] 4)再加入100 y L10%的NaCl溶液，混匀，静置2h后观察各管是否有颜色改变或 者沉淀析出，当无颜色改变和无沉淀析出表明加入的抗体分子小于蛋白最大需求量；
[0063] 5)将500mL胶体金溶液加入三角瓶中，边搅拌边用10%的碳酸钾调整溶液的pH 值至8. 0~10. 0,并用精密pH试纸检测调整过程；
[0064] 按所述的方法将确定的抗体用量加入到上述溶液中，继续搅拌30分钟，超滤收集 标记物。
[0065] 实施例四、试剂B的制备：
[0066] 试剂B中溶解的生物大分子和化学物质为Tris-Hcl缓冲液、0.9% (w/v)NaCl、2% (w/v)BSA、0.1% (w/v)NaN3、0.05% (w/v)Tween20,5% (w/v)鹿糖或海藻糖，2% (w/v)甘 氨酸，2% (w/v)PEG6000。
[0067] 将配制好的试剂B同超滤收集得到的标记物相混合，最终控制标记物金颗粒浓度 为0. 4mg/mT,即可。
[0068] 实施例五、校准品的制备：
[0069] 活化后的阪崎肠杆菌标准菌株C. sakazakii ATCC 29544用2% (w/v)BSA溶液溶 解或稀释，制得IX 106cfu/mL菌悬液，使用时根据所需要浓度梯度用0. 9% (w/v)NaCl稀释 即可。
[0070] 实施例六、不同颗粒度胶体金颗粒的选择：
[0071] 根据以上实施例中胶体金颗粒的制备不同粒径的胶体金颗粒完成标记制得试剂 B，选择同一缓冲液浓度和pH进行实验。
[0072] 实验方法：
[0073] 将校准品、试剂A和试剂B按照体积比为3:250:50依次混合，37°C下充分反应。
[0074] 在7180全自动生化分析仪上记录540 ± 10nm处吸光度值。
[0075] 比较不同颗粒大小胶体金标记物校准曲线最终确定最佳颗粒大小。
[0076] 根据校准曲线判断选择75nm-85nm范围的金颗粒较为合适，大颗粒分析灵敏度较 好但是易产生HOOK效应不利于检测，而小颗粒在高值区的分析能力却明显不如75nm-85nm 颗粒。
[0077] 图1为本发明胶体金颗粒大小与其它不同颗粒大小的胶体金分析能力比较，图1 中一?一表不颗粒粒径85nm以上，一一表不颗粒粒径75nm-85nm，一▲一表不颗粒粒径 75nm以下。
[0078] 试验方法：以含菌1 X 106cfU/mL的乳菌悬液为例，将其倍比稀释如下梯度，分别用 对照试剂和本发明试剂检测，并拟合其线性，结果如图2和表1所示，表2中一?一表示国 标方法，一)K一表示本发明试剂检测。
[0079] 表1线性数据结果
[0080]
【主权项】
1. 一种阪崎肠杆菌检测试剂，其特征在于该检测试剂由试剂A和试剂B组成，其中所 述试剂A包括缓冲液、促凝剂、BSA和防腐剂；所述试剂B包括标记有抗阪崎肠杆菌多克隆 抗体的胶体金颗粒、稳定剂、缓冲液和防腐剂；试剂A中缓冲液的浓度为20~50mmol/L，促 凝剂的浓度为2% (w/v)，BSA的浓度为2% (w/v)，防腐剂的浓度为0. 1%~0. 5% (w/v); 试剂B中缓冲液的浓度为20~50mmol/L，标记有抗阪崎肠杆菌多克隆抗体的胶体金颗粒 的浓度为〇? 〇8mg~0? 8mg/mL，稳定剂的浓度为2%~5% (w/v)，防腐剂的浓度为0? 1%~ 0. 5 % (w/v)，所述试剂A和试剂B的体积比为5:1。
2. 根据权利要求1所述的一种阪崎肠杆菌检测试剂，其特征在于试剂A和试剂B中的 缓冲液均为含有〇. 5%~5. 0% (w/v)BSA的Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸盐缓冲 液、甘氨酸缓冲液中的一种或几种按任意比组成的混合物。
3. 根据权利要求1或2所述的一种阪崎肠杆菌检测试剂，其特征在于试剂A中的促凝 剂为PEG6000 或&'ij-35。
4. 根据权利要求3所述的一种阪崎肠杆菌检测试剂，其特征在于试剂A和试剂B中的 防腐剂均为叠氮化钠。
5. 根据权利要求4所述的一种阪崎肠杆菌检测试剂，其特征在于试剂B中的稳定剂为 蔗糖或海藻糖。
6. 根据权利要求5所述的一种阪崎肠杆菌检测试剂，其特征在于所述标记有抗阪崎肠 杆菌多克隆抗体的胶体金颗粒的直径为60nm~90nm。
7. 根据权利要求6所述的一种阪崎肠杆菌检测试剂，其特征在于所述试剂A和试剂B 的pH值均为7.0~9.0。
8. 根据权利要求7所述的一种阪崎肠杆菌检测试剂，其特征在于所述标记有抗阪崎肠 杆菌多克隆抗体为具有不同免疫活性位点多克隆株抗体的混合物。
9. 如权利要求1所述的阪崎肠杆菌检测试剂的制备方法，其特征在于该方法包括如下 步骤： 一、 将促凝剂、BSA和防腐剂加入到缓冲液中，制得试剂A; 二、 将氯金酸与柠檬酸三钠按照质量比1:1加热煮沸制得胶体金溶液；将抗阪崎肠杆 菌多克隆抗体加入到胶体金溶液中，超滤，得到标记有抗阪崎肠杆菌多克隆抗体的胶体金 颗粒，将稳定剂、防腐剂和缓冲液混合得混合液，然后将混合液与标记有抗阪崎肠杆菌多克 隆抗体的胶体金颗粒混合，制得试剂B; 三、 将试剂A和试剂B按照5:1的体积比混合，即得抗阪崎肠杆菌检测试剂。
10. 根据权利要求9所述的阪崎肠杆菌检测试剂的制备方法，其特征在于步骤二所述 胶体金溶液中抗阪崎肠杆菌多克隆抗体的浓度为20~25yg/mL。
【专利摘要】一种阪崎肠杆菌检测试剂及其制备方法，涉及一种细菌检测试剂及其制备方法。本发明是为了解决现有的检测阪崎肠杆菌的胶体金试纸条无法定量检测的问题。该检测试剂由试剂A和试剂B组成，试剂A包括缓冲液、促凝剂、BSA和防腐剂；试剂B包括标记有抗阪崎肠杆菌多克隆抗体的胶体金颗粒、稳定剂、缓冲液和防腐剂。方法：一、将促凝剂、BSA和防腐剂加入到缓冲液中，制得试剂A；二、将稳定剂、防腐剂和缓冲液混合得混合液，然后将混合液与标记有抗阪崎肠杆菌多克隆抗体的胶体金颗粒混合，制得试剂B；三、将试剂A和试剂B混合即得抗阪崎肠杆菌检测试剂。本发明检测线性范围大，可定量检测，分析灵敏度高，使用方便。用于检测牛奶或奶粉中阪崎肠杆菌。
【IPC分类】G01N33-531, G01N33-569
【公开号】CN104698167
【申请号】CN201510125306
【发明人】孟利, 刘峰, 李梦洋, 李冲伟, 任洪波, 金海涛
【申请人】黑龙江大学
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年3月20日