一种铂基合金标记的三通道夹心型免疫传感器的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于纳米功能材料、免疫分析及生物传感技术领域，具体涉及一种铂基合金为标记物的三通道夹心型免疫传感器制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]近年来，铂基合金PtM的研宄得到了很大的发展，尤其作为低温燃料电池的最佳催化剂，铂基合金吸引了研宄者的广泛兴趣。与单一的Pt纳米材料相比，掺杂其他金属合金可以降低Pt的负载量，从而减少成本，同时还能保证催化剂活性不变，甚至使活性提高。在电化学传感器的构建中，也常用到铂基合金，如铂金、铂钯、铂银双金属合金，或者铂基三金属合金。掺杂了其他贵金属的合金，在一定程度上提高了催化活性，但成本高昂。而掺杂一些非贵金属合金，利用Pt良好的生物相容性，以及另一种非贵金属的电活性，可以从另一方面作为标记物构建电化学免疫传感器。目前，多通道免疫传感器制备中，大多利用量子点(CdS、ZnS等)、电子媒介体(二茂铁、甲苯胺蓝、普鲁士蓝、硫堇等)及负载不同金属离子(Zn2+、Cd2+、Cu2+等)的纳米材料作为标记物。而利用非贵金属钼基合金，如PtZn合金、PtCd合金、PtCu合金为标记物的三通道免疫传感器还未出现。非贵金属铂基合金能够作为信号标记物是因为随着纳米尺寸的减小，原子逐渐集中到材料表面，因此材料具有很强的电化学活性。此类铂基合金的纳米材料可以在醋酸-醋酸钠缓冲液中产生很强的电信号，无需像采用盐酸或硝酸来处理量子点进行洗脱，避免了繁琐的操作步骤和酸对蛋白质分子的危害，减少测定误差。
【发明内容】
[0003]本发明的目的之一是提供一种三通道夹心型免疫传感器的制备方法。
[0004]本发明的目的之二是将所制备的三通道夹心型免疫传感器，用于同时检测三种分析物。
[0005]本发明的技术方案，包括以下步骤。
[0006]1.一种铂基合金标记的三通道夹心型免疫传感器的制备方法
(1)将玻碳电极依次用0.1 Mm,0.05 Mm的氧化铝粉末打磨抛光，然后用超纯水冲洗，除掉表面的杂质，完成玻碳工作电极的预处理；
(2)将3~5μ L、1.0-3.0 mg/mL的Pt-石墨烯水溶液超声处理分散均匀，然后滴涂在玻碳工作电极表面，自然晾干；
(3)依次将3~5μ?、8~12 Pg/mL分析物a的捕获抗体、分析物b的捕获抗体和分析物c的捕获抗体，分别滴涂到工作电极表面，4 0C冰箱中干燥；
(4)滴涂2~4PL、质量分数为1%的牛血清白蛋白于工作电极表面，置于4 °〇冰箱中直至干燥，超纯水清洗后，置于4°C冰箱中晾干；
(5)分别滴加不同浓度的分析物a、分析物b和分析物c于工作电极表面； (6)取3~5 μ?三种铂基合金标记的分析物检测抗体孵化物，分别滴涂于电极表面上，置于4 °C冰箱中晾干，制得一种铂基合金标记的三通道夹心型免疫传感器。
[0007]2.三种铂基合金标记的分析物检测抗体孵化物的制备
(I)钼基合金纳米材料的制备
分别向三份已除氧超纯水配制的50 mL、0.2~0.3 mmol/L梓檬酸水溶液中，依次加入0.05-0.15 mmol 的 H2PtCl4和 0.015-0.035 mmol 的氯化物溶液，氯化物选自 ZnCl 2或 CdCl2或CuCl2，再分别加入2 mmol的NaBH4,溶液产生大量气泡，继续搅拌2 h，制得黑色铂基合金纳米材料PtZn、PtCd和PtCu，用超纯水清洗，干燥备用；
(2 )三种铂基合金标记的分析物检测抗体孵化物的制备
称取1.0-3.0 mg铂基合金纳米材料PtZruPtCd和PtCu，分散在0.5 mL、pH=7.4的PBS中，分别加入8~12 μ g的分析物a检测抗体、分析物b检测抗体和分析物c检测抗体，4 °C下孵化12 h，制得三种铂基合金标记的分析物检测抗体孵化物，通过离心分离除掉未结合的抗体后，将其分散在I mL、质量分数为0.1% BSA的PBS中，置于4 °0冰箱备用；
所述钼基合金标记的分析物a检测抗体孵化物为PtZn/a-Ab ；
所述钼基合金标记的分析物b检测抗体孵化物为PtCd/b-Ab ；
所述钼基合金标记的分析物c检测抗体孵化物为PtCu/c-Ab。
[0008]3.三种分析物的同时检测步骤
(1)使用电化学工作站对三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的三通道夹心型免疫传感器为工作电极，在10 mL、pH 4.5-6.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中进行测试；
(2)用差分脉冲伏安对分析物进行检测，扫描电压根据所选铂基合金纳米材料在-1.2~0.2 V内选取，电位增量为0.004 V，振幅0.05 V，脉冲宽度0.2秒，采样宽度0.0167秒，脉冲周期0.5秒；
(3)钼基合金标记的分析物a检测抗体孵化物PtZn/a-Ab发生氧化还原反应在-1.1V附近产生信号，铂基合金标记的分析物b检测抗体孵化物PtCd/b-Ab发生氧化还原反应在-0.75 V附近产生信号，铂基合金标记的分析物c检测抗体孵化物PtCu/c-Ab发生氧化还原反应在0.0 V附近产生信号，根据所得电流强度与分析物a、分析物b和分析物c之间的线性关系，绘制工作曲线。
[0009]4.所述分析物a、分析物b和分析物C，选自以下分析物中的任意三种:癌胚抗原CEA,甲胎蛋白 AFP，IgE, IgG,前列腺特异性抗原 PSA，CA 15-3, CA125，CA 19-9, CA724，CA242，鳞状细胞癌抗原SCCA，组织多肽抗原TPA。
[0010]本发明的有益成果
(1)本发明首次将铂基合金纳米材料PtZn、PtCd和PtCu应用于三通道夹心型免疫传感器的制备中，铂基合金纳米材料生物相容性好、导电性好、催化性能高，电活性强；
(2)基于PtZn、PtCd和PtCu等三种材料，用相同的修饰方法和检测方法，利用抗原与抗体的特异性结合，选择三种分析物的任意组合，即可实现高灵敏的同时检测，显著提高了检测效率。
【具体实施方式】
[0011]实施例1 一种铂基合金为标记物的三通道夹心型免疫传感器制备方法
(1)将玻碳电极依次用0.1 Mm,0.05 Mm的氧化铝粉末打磨抛光，然后用超纯水冲洗，除掉表面的杂质，完成玻碳工作电极的预处理；
(2)将3μ LU.0 mg/mL的Pt-石墨烯水溶液超声处理分散均匀，然后滴涂在玻碳工作电极表面，自然晾干；
(3)依次将3μ?,8 Pg/mL分析物a的捕获抗体、分析物b的捕获抗体和分析物c的捕获抗体，分别滴涂到工作电极表面，4 0C冰箱中干燥；
(4)滴涂2PU质量分数为1%的牛血清白蛋白于工作电极表面，置于4 °C冰箱中直至干燥，超纯水清洗后，置于4°C冰箱中晾干；
(5)分别滴加不同浓度的分析物a、分析物b和分析物c于工作电极表面；
(6)取3PL三种铂基合金标记的分析物检测抗体孵化物，分别滴涂于电极表面上，置于4 °C冰箱中晾干，制得一种铂基合金标记的三通道夹心型免疫传感器。
[0012]实施例2 —种铂基合金为标记物的三通道夹心型免疫传感器制备方法
(1)将玻碳电极依次用0.1 Mm,0.05 Mm的氧化铝粉末打磨抛光，然后用超纯水冲洗，除掉表面的杂质，完成玻碳工作电极的预处理；
(2)将4yL、2.0 mg/mL的Pt-石墨烯水溶液超声处理分散均匀，然后滴涂在玻碳工作电极表面，自然晾干；
(3)依次将4μ?、10 Pg/mL分析物a的捕获抗体、分析物b的捕获抗体和分析物c的捕获抗体，分别滴涂到工作电极表面，4 0C冰箱中干燥；
(4)滴涂3PU质量分数为1%的牛血清白蛋白于工作电极表面，置于4 °C冰箱中直至干燥，超纯水清洗后，置于4°C冰箱中晾干；
(5)分别滴加不同浓度的分析物a、分析物b和分析物c于工作电极表面；
(6)取4PL三种铂基合金标记的分析物检测抗体孵化物，分别滴涂于电极表面上，置于4 °C冰箱中晾干，制得一种铂基合金标记的三通道夹心型免疫传感器。
[0013]实施例3 —种铂基合金为标记物的三通道夹心型免疫传感器制备方法
(1)将玻碳电极依次用0.1 Mm,0.05 Mm的氧化铝粉末打磨抛光，然后用超纯水冲洗，除掉表面的杂质，完成玻碳工作电极的预处理；
(2)将5HU3.0 mg/mL的Pt-石墨烯水溶液超声处理分散均匀，然后滴涂在玻碳工作电极表面，自然晾干；
(3)依次将5μ?Λ2 Pg/mL分析物a的捕获抗体、分析物b的捕获抗体和分析物c的捕获抗体，分别滴涂到工作电极表面，4 0C冰箱中干燥；
(4)滴涂4PU质量分数为1%的牛血清白蛋白于工作电极表面，置于4 °C冰箱中直至干燥，超纯水清洗后，置于4°C冰箱中晾干；
(5)分别滴加不同浓度的分析物a、分析物b和分析物c于工作电极表面；
(6)取5PL三种铂基合金标记的分析物检测抗体孵化物，分别滴涂于电极表面上，置于4 °C冰箱中晾干，制得一种铂基合金标记的三通道夹心型免疫传感器。
[0014]实施例4三种铂基合金标记的分析物检测抗体孵化物的制备 (I)钼基合金纳米材料的制备
分别向三份已除氧超纯水配制的50 mL、0.2 mmol/L梓檬酸水溶液中，依次加入0.05mmol的H2PtClJP 0.015 mmol的氯化物溶液，氯化物选自ZnCl 2或CdCl 2或CuCl 2，再分别加入2 mmol的NaBH4,溶液产生大量气泡，继续搅拌2 h，制得黑色铂基合金纳米材料PtZn、PtCd和PtCu，用超纯水清洗，干燥备用；
(2 )三种铂基合金标记的分析物检测抗体孵化物的制备
称取1.0 mg铂基合金纳米材料PtZn,PtCd和PtCu，分散在0.5 mL、pH=7.4的PBS中，分别加入8 μ g的分析物a检测抗体、分析物b检测抗体和分析物c检测抗体，4 °C下孵化
12h，制得三种铂基合金标记的分析物检测抗体孵化物