幽门螺杆菌定量和毒力多重基因检测体系及其试剂盒和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种多重基因检测产品W及该产品所用到的检测体系，属于生物技术 领域。
【背景技术】
[0002] 幽口螺杆菌(H.p^ori)是一种革兰阴性、微需氧、弯曲状杆菌，主要寄居在人体胃 部。幽口螺杆菌感染与慢性萎缩性胃炎、消化性溃瘍、胃黏膜相关淋己组织淋己瘤和胃癌等 发生发展密切相关，因此引起临床的广泛关注。1994年，国际癌症研究机构IARC已将其列为 人类I类致癌因子，是目前为止唯一被列为明确对人类致癌的细菌性病原微生物。很多报告 认为幽口螺杆菌感染与冠屯、病、类风湿、肝胆病、肺结核、妊娠呕吐、直结肠癌及多种皮肤病 等疾病有关，其致病性与感染剂量和多种毒力基因的表达密切相关。流行病学显示，全球几 乎有一半的人口感染此菌，发展中国家甚至高达60%~70%。因此，幽口螺杆菌感染是世界各 国需要面对的公共卫生问题。
[0003] 目前幽口螺杆菌定量和毒力检测方法均有其局限性。例如：1)分离培养鉴定:幽口 螺杆菌培养成菌落后，经生化反应鉴定。由于幽口螺杆菌培养需要微需氧条件，对营养条件 要求苛刻，因此检出率极低，作为常规诊断手段不易推广，且幽口螺杆菌培养需要一定的 时间，不利于快速诊断。2)组织病理切片染色法:该方法是把患者胃镜检查活检组织切片， 染色后可观察到组织中的幽口螺杆菌。该方法受幽口螺杆菌载量影响明显，且操作繁琐、费 时，不适于大通量样本的检测。3)尿素酶依赖性试验(尿素呼气试验）：根据标志物不同分 为1化呼吸试验及1化呼吸试验，临床应用广泛，。缺点是费用高、易受抑菌药物和抑酸药物的 影响、敏感度低。4)免疫学检查:检测血清中或唾液和尿液中抗体（IgG)或直接检测粪便中 幽口螺杆菌的菌体抗原或毒力因子成分。其缺点是不能反映现症感染。5)定量分析:常用的 是real-time PCR，但该方法检测单一，通量小，对多个基因分析时成本高。幽口螺杆菌致 病性与其感染量、产生的多种毒力因子密切相关。但是目前常规的检测方法均存在时间长、 灵敏度低、费用高、通量低、不能同时进行多种相关因素检测等缺点。
[0004] 综上所述，如何快速、准确、全面地对幽口螺杆菌进行鉴定、定量和毒力分析是本 领域的技术人员迫切亟待解决的问题。
【发明内容】
[000引本发明要解决的技术问题是提供一种可W快速、全面、准确、低成本的幽口螺杆菌 定量和毒力多重基因检测体系及其试剂盒，W及采用该检测体系在制备诊断产品方面的应 用。
[0006]本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是:一种幽口螺杆菌定量和毒力 多重基因检测体系，可在同一个反应体系中进行其菌种鉴定、定量、毒力和耐药性分析。包 括对菌种鉴定基因16S rRNA进行检测的引物，分别对毒力基因 cagA、vacA-sl、vacA-s2、 vacA-ml、vacA-m2、iceAl、iceA2、d叫A、oipA和luxS进行检测的引物，分别对耐药基因23S rRNA的2143位点、rdxA的148位点、pbplA的1777位点和gyrA的261位点的进行多态性检测的 引物，W及分别对幽口螺杆菌的拷贝数进行定量分析的基因 ureC和β-globin进行检测的引 物;所述各引物的正向引物的5'端均设有正向通用引物序列，所述各引物的反向引物的5' 端均设有反向通用引物序列。所述检测体系进行PCR反应后进行毛细管电泳分析。
[0007] 针对16S rRNA基因的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID No.l所示，针对16S rRNA 基因的反向引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 2所示； 针对cagA基因的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID齡.3所示，针对。日邑4基因的反向引 物的核巧酸序列如SEQ ID No.4所示； 针对￥日。4-31或￥日。4-32基因的正向引物的核巧酸序列如56〇10齡.5所示，针对￥日。八- 31或￥曰〇4-32基因的反向引物的核巧酸序列如56〇10齡.6所示； 针对vacA-ml基因的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID齡.7所示，针对￥日。4-1111基因的 反向引物的核巧酸序列如SEQ ID No.8所示； 针对vacA-m2基因的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID齡.9所示，针对￥日。4-1112基因的 反向引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 10所示； 针对iceAl基因的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID齡.11所示，针对^641基因的反向 引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 12所示； 针对iceA2基因的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID齡.13所示，针对^642基因的反向 引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 14所示； 针对dupA基因的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID齡.15所示，针对(1啡4基因的反向引 物的核巧酸序列如SEQ ID No. 16所示； 针对oipA基因的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID齡.17所示，针对〇1口4基因的反向引 物的核巧酸序列如SEQ ID No. 18所示； 针对luxS基因的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID齡.19所示，针对111技基因的反向引 物的核巧酸序列如SEQ ID No.20所示； 针对23SrRNA基因的正向引物的核巧酸序列如SEQIDNo.21所示，对应23SrRNA基因 2143位点为碱基A的反向引物的核巧酸序列如SEQ ID No.22所示，对应23S rRNA基因2143 位点为碱基G的反向引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 23所示； 针对rdxA基因的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID No.24所示，对应rdxA基因148位点 为碱基C的反向引物的核巧酸序列如SEQ ID No.25所示，对应rdxA基因148位点为碱基T的 反向引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 26所示； 针对pbplA基因的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID齡.27所示，对应口6口心基因1777位 点为碱基A的反向引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 28所示，对应pbplA基因1777位点为碱基 G的反向引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 29所示； 针对gyrA基因的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID No.30所示，对应gyrA基因261位点 为碱基C或T的反向引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 31所示，对应gyrA基因261位点为碱基G 或A的反向引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 32所示； 针对ureC基因的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID齡.33所示，针对山"6(：基因的反向引 物的核巧酸序列如SEQ ID No.34所示； 针对β-g 1 obiη基因的正向引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 35所示，W及针对β-g 1 ob iη 基因的反向引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 36所示； 所述正向通用引物的核巧酸序列如SEQ ID No.37所示； 所述反向通用引物的核巧酸序列如SEQ ID No.38所示。
[0008] 针对 16S rRNA、ureC、cagA、vacA-s 1、vacA-ml、vacA-m2、iceAl、iceA2、dupA、οipA 和luxS基因的正向引物在检测体系中的终浓度均为200nM;针对16S rRNA、ureC、cagA、 vacA-sl、vacA-ml、vacA-m2、iceAl、;[。642、01口4、111技、和6-邑1013；[]1基因的反向引物在检测 体系中的终浓度均为10化Μ;针对dupA和β-globin基因的正向引物在检测体系中的终浓度 均为lOOnM; 针对23S rRNA基因的2143位点、rdxA基因的148位点、pbp 1A基因的1777位点和gyrA基 因的261位点的正向引物在检测体系中的终浓度均为10化Μ;对应23S rRNA基因2143位点为 碱基A的反向引物在检测体系中的终浓度均为300nM;对应23S rRNA基因2143位点为碱基G 的反向引物在检测体系中的终浓度均为35化M;对应rdxA基因148位点为碱基C、对应pbplA 基因1777位点为碱基A、对应gyrA基因261位点为碱基C或T的反向引物、对应rdxA基因148位 点为碱基T、对应pbp 1A基因1777位点为碱基G的反向引物在检测体系中的终浓度均为 400nM;对应gyrA基因261位点为碱基G或A的反向引物在检测体系中的终浓度均为450nM。
[0009] 上述幽口螺杆菌检测体系还包括PCR缓冲液、MgCb溶液、dNTPs、热启动DM聚合 酶、带巧光的通用标签混合物和DNA模板;所述带巧光的通用标签混合物中包括反向通用引 物和带有巧光标记的正向通用引物。
[0010] 上述巧光标记为CY5、CT3或FAM等。
[0011] 上述幽口螺杆菌检测体系还包括阳性对照液和阴性对照液;所述阳性对照物是包 括所有目的基因祀点的质粒混合物;所述阴性对照液是无核酸酶超纯水。
[0012] 上述幽口螺杆菌检测体系反应时体系中的组分用量为10X的PCR缓冲液1体积，带 巧光的通用标签混合物和2mmol/L的dNTPs共1体积，25mmol/L的MgCb溶液2体积，引物混合 物1体积，抓/μL的热启动DNA聚合酶1体积，DNA模板2体积，纯水2体积。
[001引上述DNA模板的使用量为5~50ng/体系。
[0014] 本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是:一种采用上述检测体系制 备幽口螺杆菌检测和诊断产品的应用。
[0015] 本发明为解决上述技术问题提出的又一种技术方案是:一种采用上述检测体系的 幽口螺杆菌定量和毒力多重基因检测试剂盒。
[0016] 本发明具有积极的效果： (1)本发明的幽口螺杆菌定量和毒力多重基因检测体系及试剂盒，采用了多对特异性 引物和通用引物，将多重P