一种定量检测食烷烃戈登氏菌的特异性引物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种定量检测食烷烃戈登氏菌的特异性引物，属于环境微生物【技术领域】，引物由SEQ?ID?NO.1所示的上游引物和由SEQ?ID?NO.2所示的下游引物组成。通过环境样品DNA提取、定量PCR检测、PCR产物分析等步骤，采用本发明提供的特异性引物可以进行食烷烃戈登氏菌的定量检测。本发明具有特异性高、灵敏度高和检测速度快耗时短等优点。
【专利说明】一种定量检测食烷烃戈登氏菌的特异性引物
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物定量检测【技术领域】，涉及一种定量检测食烷烃戈登氏菌的特异性引物。
技术背景
[0002]食烧烃戈登氏菌(Gordonia alkanivorans)是一种不具备运动能力、橘红色菌落、过氧化氢酶阳性、氧化酶阴性、高GC含量的革兰氏阳性放线菌。特别是对直链烷烃等石油烃具有较高的降解速率，在石油污染土壤和水体治理过程中起重要作用，因而受到各国研究者的广泛关注。此外，该菌还具有较好的耐盐特性，可以在6%NaCl的高盐环境下生存。因而可以在高盐环境下对石油烃污染物进行降解。我们前期分离得到了一株食烷烃戈登氏菌CGMCC N0.6845，并以该菌株为核心制备了石油降解复合菌剂，对石油污染海水等高盐环境下的石油污染治理具有明显促进效果。该菌数量在石油污染治理过程中的动态变化极大地影响石油降解效果。然而目前对于环境中该菌数量的定量分析方法并不完善。因此，如何有效地检测其数量变化成为亟待解决的重要问题。
[0003]目前，关于定量检测环境中微生物数量的技术主要是稀释涂布平板技术。稀释涂布平板技术具有操作简便的优点，然而由于该菌生长速度缓慢，平均检测耗时约5天，因此难以使用该技术快速定量分析该菌数量变化。定量PCR技术具有灵敏度高、检测速度快的优点，因此被应用于多种微生物的检测。例如:中国专利(200910272677)公布了一种检测蜡样芽孢杆菌所需的特异引物及方法；中国专利(201010590692)公布了一种针对产气荚膜梭菌的快速检测方法及检测引物组；美国专利(US20060141492)公布了一系列定量检测多氯联苯脱氯菌群的特异性引物。影响定量PCR技术定量准确度的因素有很多，其中特异性引物的设计是关键因素之一。随着微生物基因组数据的不断积累，采用基因组比对的生物信息学方法识别微生物的特异基因已逐渐成为一种有效的策略。根据特异基因进一步采用计算机软件设计特异性引物可以大大提高定量PCR技术的准确度。`
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对环境中食烷烃戈登氏菌定量检测的问题，提供一种定量检测食烷烃戈登氏菌的特异性引物。
[0005]本发明的技术方案概述如下:
[0006]一种定量检测食烷烃戈登氏菌的特异性引物，由SEQ ID N0.1所示的上游引物和由SEQ ID N0.2所示的下游引物组成。
[0007]本发明的优点:
[0008]①特异性高，仅针对食烷烃戈登氏菌进行定量检测；②灵敏度高，最高可达1.2X105cfu/ml ;③检测速度快，最快12小时即可完成定量检测。
【专利附图】
【附图说明】[0009]图1为采用本发明的特异性引物进行MPN-PCR的琼脂糖凝胶电泳图谱。其中，泳道M为λ -Hind III digest ;泳道I~5为实施例1的结果，泳道8~12为实施例2的结
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【具体实施方式】
[0010]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0011]本发明涉及的食烧烃戈登氏菌(Gordonia alkanivorans)由本申请的发明人从石油污染盐溃化土壤中分离筛选得到，具有石油烃高效降解特征和耐盐特征。菌株于2012年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心并已存活，保藏单位地址:北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编:100101，电话:010-64807355，其微生物保藏编号为CGMCC N0.6845。 [0012]将食烷烃戈登氏菌(CGMCC N0.6845)基因组序列与同属菌株进行BLAST比对，采用0RTH0MCL剔除高度同源序列，获得食烷烃戈登氏菌种内特异性序列。进一步将其与全部微生物基因组序列进行BLAST比对，剔除高度同源序列，获得食烷烃戈登氏菌的特异性序列。针对获得的特异性序列，采用Primer Primier设计引物。根据Tm值和长度等指标对引物进行筛选，最终获得针对食烷烃戈登氏菌的特异性引物，其中上游引物G0R_F2 (SEQID N0.1所示)和下游引物G0R_R2 (SEQ ID N0.2所示)长度均为19bp的核苷酸。其序列如下:
[0013]G0R_F2:5，-GGTCGGATTGTCGCAGGAG-3，；(SEQ ID N0.1)
[0014]G0R_R2:5，-TCGAGCGTGACGAGGGTGT-3，。(SEQ ID N0.2)
[0015]采用本发明的一种定量检测食烷烃戈登氏菌的特异性引物定量检测食烷烃戈登氏菌:
[0016](I)采用常规酚-氯仿抽提方法提取含有食烷烃戈登氏菌的环境样品DNA ；
[0017](2 )采用 MPN-PCR 进行定量检测，PCR 反应体系 50ul 包括 20pM G0R_F1、20pM G0R_Rl (或 20pM G0R_F2 和 20pM G0R_R2)、lul DNA 模板、200uM dNTP、15uM 镁离子和 2.5U Taq酶。PCR反应条件:94°〇预变性51^11，941:变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸2min，最后72°C延伸 IOmin ；
[0018](3) PCR产物分析，取2ul PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，100V电压45min,紫外光下拍照；
[0019](4)根据PCR反应结果计算环境样品中的食烷烃戈登氏菌浓度。
[0020]本发明以环境微生物学为理论依据，综合微生物基因组学和微生物生态学的相关理论知识，针对食烷烃戈登氏菌难以定量检测的问题，设计特异性引物，可以用于环境中食烷烃戈登氏菌的定量检测，特别是可以用于评价石油污染修复过程中的食烷烃戈登氏菌数量的动态变化。
[0021]以下通过具体实施例阐述本发明，目的在于帮助读者更好地理解本发明的精神实质，但不作为对本发明实施范围的限定。
[0022]实施例1
[0023]采用本发明的一种定量检测食烷烃戈登氏菌的特异性引物定量检测食烷烃戈登氏菌:[0024](1)将含有食烷烃戈登氏菌CGMCC N0.6845的石油降解菌剂加入到石油污染海水中，培养10天后，采用常规酚-氯仿抽提方法提取DNA ；
[0025](2)采用SEQ ID N0.1所示上游引物和SEQ ID N0.2所示下游引物对步骤(1)获得的DNA进行MPN-PCR定量检测。PCR反应体系50ul包括:20pM SEQ ID N0.1所示上游引物、20pMSEQ ID N0.2所示下游引物、lul DNA模板(采用无菌水梯度稀释至101、ΙΟ2、ΙΟ3、104 和 ΙΟ5 倍)、200uM dNTP、15uM 镁离子和 2.5U Taq 酶。PCR 反应条件:94°C预变性 5min,94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸2min，最后72°C延伸lOmin。取2ulPCR产物进行
1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，100V电压45min，紫外光下拍照(结果如图1所示。其中，泳道Μ为λ -Hind III digest ;泳道1~5为本实施例的结果。泳道1为采用稀释101倍的DNA进行MPN-PCR的结果，泳道2为采用稀释102倍的DNA进行MPN-PCR的结果，泳道3为采用稀释103倍的DNA进行MPN-PCR的结果，泳道4为采用稀释104倍的DNA进行MPN-PCR的结果，泳道5为采用稀释105倍的DNA进行MPN-PCR的结果)。计算得到食烷烃戈登氏菌浓度为6.2X106cfu/ml，检测共花费时间13小时。
[0026]实施例2
[0027]采用本发明的一种定量检测食烷烃戈登氏菌的特异性引物定量检测食烷烃戈登氏菌:
[0028](1)同实施例1;
[0029](2)采用SEQ ID N0.1所示上游引物和SEQ ID N0.2所示下游引物对步骤(1)获得的DNA进行MPN-PCR定量检测。PCR反应体系同实施例1。PCR反应条件:94°C预变性5min，94°C变性lmin，57°C退火lmin，72°C延伸2min，最后72°C延伸lOmin。PCR产物分析同实施例1。(结果如图1所示。其中，泳`道Μ为λ-Hind III digest ;泳道8~12为本实施例的结果。泳道8为采用稀释101倍的DNA进行MPN-PCR的结果，泳道9为采用稀释102倍的DNA进行MPN-PCR的结果，泳道10为采用稀释103倍的DNA进行MPN-PCR的结果，泳道11为采用稀释104倍的DNA进行MPN-PCR的结果，泳道12为采用稀释105倍的DNA进行MPN-PCR的结果)。计算得到食烷烃戈登氏菌浓度为7.8X 106cfu/ml，检测共花费时间12小时。
【权利要求】
1.一种定量检测食烷烃戈登氏菌的特异性引物，其特征在于由SEQ ID N0.1所示的上游引物和 由SEQ ID N0.2所示的下游引物组成。
【文档编号】C12N15/11GK103695528SQ201310304653
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年7月19日 优先权日:2013年7月19日
【发明者】王新新, 吴亮, 谭耀模, 杨勇, 亓俊良, 安伟, 牛志刚, 陈宇 申请人:中国海洋石油总公司, 中海油能源发展股份有限公司, 中海石油环保服务（天津）有限公司