一种可并行检测多种弧菌的基因芯片及其检测方法
【专利摘要】本发明涉及到一种可并行检测多种弧菌的基因芯片及其检测方法。提供了溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌四种水产环境中常见病原弧菌的种特异性基因——编码热休克蛋白的hsp60基因的寡核苷酸探针序列，毒力基因toxR的寡核苷酸探针序列。该检测方法基于碱基互补配对原则，结合经优化的普通PCR及荧光标记PCR反应体系，通过固定于固相醛基芯片上的寡核苷酸探针来实现检测的目的。本发明针对当前病原微生物检测方法瓶颈，提出了一种高通量、高特异性、高灵敏度、快捷高效的检测方法。
【专利说明】一种可并行检测多种弧菌的基因芯片及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物检测【技术领域】，具体涉及一种可并行检测多种弧菌的基因芯片及其检测方法。
[0002]【背景技术】
[0003]针对微生物检测的方法有多种，目前较广泛使用的有传统的生理生化实验法、免疫抗体检测技术、PCR检测技术等。传统的生理生化实验需要对待测样本的菌种分离培养，通过一系列繁琐的生理生化实验的特征、结果来甄别菌种，该方法虽然是微生物实验室中一种常用的、经典的鉴别方法，但其过程往往需要数天时间、需要耗费较大的人力物力、实验得到的表型特征可能受外界环境影响而出错、对于一些非典型株系及临近种较难根据表型分辨。特别是对于一些处于“活的不可培养状态”(VBNC)的细菌，传统的培养方法难以培养、甄别，这会在水产养殖和食品安全领域留下重大隐患。
[0004]PCR检测技术是通过设计特定的引物来大量扩增目的基因片段，根据待检测菌种的相关基因信息来鉴定菌种，PCR技术的灵敏度高而且快捷高效，特别是随着核酸测序技术的跨越式发展，使得PCR技术的耗费更低。但其检测的灵敏度往往受制于琼脂糖凝胶的灵敏度，且同时检测大量样本的能力有限，近年来在普通PCR技术的基础上又衍生出多重PCR技术能在一定程度上解决这个问题，但仍受限于可扩增的基因种类数。
[0005]免疫抗体检测技术特异性和灵敏度较高，但往往单次只能检验单一菌种，需要制备抗血清。
[0006]基因芯片技术自上世纪90年代以来进展飞速，其在功能基因组研究中作用巨大，随着材料学、机械自动化、全基因组测序等领域的不断发展，使得基因芯片在微生物检测领域也得到了越来越多的应用。基因芯片的基本原理是通过人工合成目的基因的核苷酸片段，点制于一定的载体上(如固相醛基芯片)；提取待测样本的全基因组DNA，通过PCR等方式扩增目的基因片段，并在这些基因片段上标记荧光物质；将之加入芯片上在合适的条件下杂交，同源性高的片段会通过碱基互补配对而结合，经过清洗扫描，会在相应的点处出现突光信号。
[0007]用于微生物检测领域的检测芯片也在原有芯片的基础上得到改进:使用的人工合成的寡核苷酸探针，再结合其他改进使得其特异性和灵敏度极高；荧光标记方法方式多样，大多使用荧光素Cy3标记的单碱基或者随机引物等物质，操作方便、耗费较低；芯片点制、扫描设备的自动化、智能化水平也在逐渐提高，可以大幅缩短检测时间、减少人为误差；芯片的高通量性体现在芯片打印密度的提高(目前已能达到每平方厘米打印IO4个探针)，这在环境监测、食品检测中的大量、复杂样品的检测方面优势明显。
[0008]本发明的溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌的基因芯片检测芯片能够实现对复杂样本的并行快捷、高通量、高特异性、高灵敏度检测，在此四种病原弧菌的基础上其还具有良好的可扩展性，这对于海水环境病原微生物的监控检测具有实际意义。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供一种可并行检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌的基因芯片及其检测方法，从而弥补现有技术的不足。
[0010]已有的基因芯片常常利用编码热休克蛋白的hsp60基因来做为菌株种类鉴定靶基因。该基因属于管家基因，其在细菌中广泛存在且具有种特异性差异，在当前的细菌分类学中通常被用为种类鉴定、系统发生分析的靶标。然而管家基因建立的鉴定探针只能鉴定到病原菌株的种类，在复杂的水产养殖环境中，往往同一菌中的不同株系其致病性有无、强弱也有差异，因此了解相关毒力基因是否存在具有实际意义。而 申请人:在长期的研究中发现，编码跨膜转录调控蛋白的toxR基因能够作为鉴定毒力基因的分子靶标，该基因对于致病菌株的毒素的产生具有关键性的调节功能，在致病菌株中也广泛存在。因此，本发明针对溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌的这两种基因分别选取特异性片段设计探针，以保证各个菌种探针只和对应的菌种产生特异性信号。
[0011]本发明的一种可并行检测多种弧菌的基因芯片，包括有芯片载体，在芯片载体上固定有用于检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌和创伤弧菌的核苷酸探针；
[0012]所述的用于检测溶藻弧菌的探针是从溶藻弧菌的hsp60基因和/或toxR基因中设计的；
[0013]所述的用于检测副溶血弧菌的探针是从溶藻弧菌的hsp60基因和/或toxR基因中设计的；
[0014]所述的用于检测哈维氏弧菌的探针是从溶藻弧菌的toxR基因中设计的；
[0015]所述的用于检测创伤弧菌的探针是从溶藻弧菌的hsp60基因中设计的。
[0016]所述的用于检测溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的核苷酸探针,其序列为SEQID NO:1 或 SEQ ID NO:2。
[0017]所述的用于检测副溶血弧菌(Vibrio parahaemoIyticus)的核苷酸探针,其序列为 SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:4。
[0018]所述的用于检测创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的核苷酸探针,其序列为SEQ IDNO:5。
[0019]所述的用于检测哈维氏弧菌(Vibrio haeveyi)的核苷酸探针,其序列为SEQ IDNO:6。
[0020]表1:本发明所用到的探针序列信息
[0021]
【权利要求】
1.一种可并行检测多种弧菌的基因芯片，包括有芯片载体，其特征在于，在芯片载体上固定有用于检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌和创伤弧菌的核苷酸探针；所述的用于检测溶藻弧菌的探针是从溶藻弧菌的hsp60基因和/或toxR基因中设计的； 所述的用于检测副溶血弧菌的探针是从溶藻弧菌的hsp60基因和/或toxR基因中设计的； 所述的用于检测哈维氏弧菌的探针是从溶藻弧菌的toxR基因中设计的； 所述的用于检测创伤弧菌的探针是从溶藻弧菌的hsp60基因中设计的。
2.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述的用于检测溶藻弧菌的核苷酸探针，其序列为 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO:2。
3.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述的用于检测副溶血弧菌的核苷酸探针，其序列为 SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:4。
4.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述的用于检测创伤弧菌的核苷酸探针，其序列为SEQ ID NO:5。
5.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述的用于检测哈维氏弧菌的核苷酸探针，其序列为SEQ ID NO:6。
6.权利要求1所述的基因芯片还固定有显示探针坐标位置的阳性质控探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:7 ;而与阳性质控探针杂交的阳性质控片段的核苷酸序列为SEQ ID NO: 8 ο
7.权利要求1所述的基因芯片的制备，包括如下步骤: 将核苷酸探针稀释至适当浓度后，在适当的温度、湿度条件下使用点制仪点制探针于固相醛基芯片上；然后将探针与芯片水合交联；洗脱去未连接的、连接不紧密的探针，封闭完成制备； 所述步骤核苷酸探针稀释至适当浓度，是使用缓冲液稀释至浓度为4-10 μ mol/L，与0.3M Na2HPO4溶液；按照1:1的比例混合后进行点制； 所述在适当的温度、湿度条件下使用点制仪点制探针于固相醛基芯片上:点样在室温20°C、湿度60%-70%的条件下进行。
8.权利要求1所述的基因芯片用于检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌中至少一种菌。
【文档编号】C40B50/18GK103451310SQ201310437410
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月23日 优先权日:2013年9月23日
【发明者】曲凌云, 朱鹏飞, 李壹, 田欣欣, 王琛 申请人:国家海洋局第一海洋研究所