一种粉蚧科昆虫基因条形码检测试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种粉蚧科昆虫基因条形码检测技术，可以快速检测21种粉蚧，至少包括20次用量以上的引物PseJ /PseN试剂和基因条形码序列盘；引物PseJ序列：5'? CCTTCAACTAATCATAAAAATATNAG ?3'，引物PseN序列：5'? TAAACTTCT GGATGTCCAAAAAATCA?3'；所述基因条形码序列盘存有93条标准条码序列，详细序列为SEQ ID NO.1到SEQ ID NO.93所示。本发明的粉蚧科昆虫基因条形码检测技术，是一种高效、准确、便捷的粉蚧科昆虫分子检测技术，可在分子水平将粉蚧科21种昆虫种类区分，能满足使用需求。
【专利说明】
-种粉蚁科昆虫基因条形码检测试剂盒及其检测方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种PCR检测试剂盒及其检测方法，尤其设及一种粉阶科昆虫基因条 形码检测试剂盒及其检测方法，属于植物检疫技术领域。
【背景技术】
[0002] 粉阶是一类分布广、寄主多的植食性昆虫，除少部分为资源昆虫外，多为农林业中 发生普遍且危害严重的害虫(Ben-Dov，2002)。该类群的成虫和若虫主要在寄主植物的幼嫩 部位取食危害，导致生长势衰弱；亦可传播病原微生物导致植物病害大面积的发生；另外虫 体排出的蜜露常诱致煤烟病的产生，影响光合作用，对农林业生产、城市景观等的生态影响 巨大。
[0003] 长期W来，基于形态特征的粉阶科分类研究的操作性和准确性一直受到质疑。粉 阶体形较小或微小，有些种类鲜见雄虫，可供比较的形态学特征有限;粉阶的个体大小、巧U 毛长短、透明孔的有无等重要的形态分类特征不稳定，极易受外部环境的影响而发生变化 (齐晓丰，2002);同时传统阶虫形态分类对专业知识和经验要求较高，只有分类专家或者经 过专口培训的人员才能有效开展此项工作;此外，传统的昆虫形态鉴定方法必须W完整成 虫作为形态学研究对象，若虫、卵与残缺的虫体等情况均难于通过形态特征进行快速有效 地鉴定化ondo，2008;化SUgi，2011)。
[0004] 近年来，昆虫分子生物学迅速发展起来，在分子鉴定和系统演化两个方面的应用 较为广泛，通过研究昆虫核酸分子结构探求各类群之间的亲缘关系和进化关系(Frgzal， 2008,郑斯竹，2015)。利用分子生物学技术，可W有效地掲示自然种群中遗传结构、基因流 动和选择作用等问题，为粉阶的分类鉴定提供新的技术和方法(魏亦寒，2105)。尤其是DNA 条形码技术的出现，越来越多的研发人员加入了DNA条形码技术研究行列，使该领域成为生 物学研究的热点之一 (Hebert, 2006)。何衍彪等(2007)对大洋臀纹粉阶、相橘臀纹粉阶、无 花果臀纹粉阶/icus等3种近缘种粉阶的mtDNA COI序列W及18S和 28S基因序列进行研究发现阶虫COI基因序列变异程度高于其他基因；Park等(2011)通过 重新设计COI基因序列的正向引物，对盾阶科和粉阶科进行了物种鉴定的有效性研究，掲示 了介壳虫DNA条形码序列核巧酸组成的特性(Deng et aJ.，2012); Saccaggi等（2008) 通过mtDNA COI基因序列特征分析成功将葡萄绵粉阶jP/anococcus巧CUS、相橘臀纹粉阶和 长尾粉阶iongisjoint/s区别开来。但运些数据仍远达不到广泛解决粉阶科种 类准确鉴定的问题。
[0005] DNA条形码技术是利用一段或几段标准的、易扩增的、种间差异显著大于种内差异 的DNA片段来鉴别物种的新技术，该概念最早由加拿大学者化bed提出。与传统的分类鉴定 技术相比，DNA条形码技术具有许多无可比拟的优点：（1)操作简单，对物种分类鉴定知识缺 乏的人也可W通过标准技术流程对物种进行鉴定；（2)不受个体发育阶段和形态特征的限 审IJ，只要个体存在完整的目标DNA片段即可满足鉴定需求；（3)该技术可W作为传统分类学 的辅助手段，帮助传统分类学家修正W往的分类结论，解决形态分类无法解决的难题。正是 由于DM条形码技术具有W上及其它很多优点，越来越多的研发人员加入了 DNA条形码技术 研究行列，使该领域成为生物学研究的热点之一(Hebert,2006)。但是关于粉阶的基因条码 快速检测技术研究，国内外相关的系统报道仍然不多。因此，建立准确可靠的粉阶条形码检 测技术，不仅对我国检疫部口具有重要的意义，更是对我国基因资源的补充，特别是粉阶害 虫资源的补充，为我国在争夺有限的资源方面能做出一定的贡献，同时也为粉阶的分类鉴 定提供新的方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于解决上述的技术问题，提供一种一种粉阶科昆虫基因条形码检 测试剂盒及其检测方法。
[0007] 本发明的目的通过W下技术方案来实现： 一种粉阶科昆虫基因条形码检测试剂盒，至少包括一基因条形码序列盘和20次用量W 上的引物PseJ与引物PseN;所述引物PseJ与引物PseN序列号为， PseJ:5'- CCTTCAACTAATCATAAAAATATNAG -3'； PseN:5'-TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3； 所述基因条形码序列盘内存有93条标准条码序列，所述标准条码序列如SEQ ID NO. 1 到沈Q ID NO.93所示。
[000引优选地，所述试剂盒还包括20次用量W上的下列试剂：Taq buffer ,MgCb, dNTP miX，Taq DNA聚合酶，d地20, DNA标准样。
[0009]优选地，一种粉阶科昆虫基因条形码检测试剂盒的检测方法，用所述试剂盒进行 扩增包括W下步骤： 51、 DNA模板的制备:采用GenMagBio动物细胞组织/细胞基因组DNA磁珠法提取试剂 盒，提取待检测样品； 52、 DNA条形码序列的扩增：WSl中的DNA检测样品为模板，采用引物PseJ与引物PseN 进行PCR扩增，所述引物PseJ与引物PseN序列号为， PseJ:5'- CCTTCAACTAATCATAAAAATATNAG -3'； PseN: 5 ' -TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3;所述PCR反应体系采用标准体系，总体积为 50化或25化； 所述PCR反应条件:95°C预变性4min;35个循环:94°C变形1111111，48°(：退火1111111，72°(：延 伸90s;最后72°C延伸4min，4°C保存； 53、 混合8化待测样品与化1 eXGlycerol DNA上样缓冲液上样，Wdna Marker DLlOO 为分子量标记，室溫下恒压120 V，用3%琼脂糖凝胶电泳45min，0.5% ymol/L的邸染色，凝胶 成像系统检测样品，拍照分析； 54、 PCR结果判定： 混合8化PCR产物与2 yL 6 XGlycerol DNA上样缓冲液上样，Wdna Marker DLlOO为 分子量标记，室溫下恒压120 V，用3 %琼脂糖凝胶电泳45分钟，0.5% ymol/L的邸染色，凝胶 成像系统检测样品，拍照;照片显示粉阶与标准DNA样品在70化P位置有清晰的扩增条带，即 为目标条带； 55、 RCR产物测序获得基因序列； S6、粉阶科昆虫基因比对 将待测粉阶测序得到的序列与基因条形码序列盘中标准基因条码序列进行比对，若比 对相似度100%，则认定其为该种类;当没有与任何标准条码序列相似度达100%，则进行氨基 酸遗传距离的比对判定是否在目标范围内。
[0010] 优选地，所述PCR反应体系为50化，其中含5化IOXTaq buffer含有KCl、2mmol/L MgCl2、200ymol/L dNTP mix、2U hq DNA 聚合酶、化L DNA模板、引物各lymol/l; 所述PCR反应体系为25化，其中模板DNA化L，含Mg2+的10 X反应缓冲液2.扣UdNTPs 0.2mmol/L化L，5pmol/L上游引物和下游引物各化L，1.0 U hq DNA聚合酶0.化L，无菌水 补至2如L。
[0011] 优选地，所述Sl中的样品为渡萝洁粉阶、李比利氏灰粉阶、灰粉阶属一种斯smi coccus neobreWjOes、萍绵粉阶、绵粉阶属一种化6/33(：?〇(：?(：?帖 3^^6/336、绵粉阶属一种/%aoacocct/s joarras、石蒜绵粉阶、扶桑绵粉阶、枯臀纹粉阶、臀纹粉阶属一种PJanococct/s巧ct/s、日本 臀纹粉阶、臀纹粉阶属一臀纹粉阶属一韦々Planococcus minor、 臀纹粉阶属一种户Jaoococcus rarae、粉阶属一种Pset/c/ococcus 薦根粉阶、康氏 粉阶、粉阶属一种A?et/c/ococct/s Cr乃7tt/s、杰克贝尔氏粉阶、拟长尾粉阶、粉阶属一种 Pseudococcus vIburn1。
[0012] 优选地，所述S6粉阶科昆虫基因比对结果包括如下步骤， 561、 当得到的序列与标准基因条码序列相似度100%，则认定其为该种类； 562、 当没有与任何标准条码序列相似度达100%，则将待测粉阶基因序列按"无脊椎动 物密码子"翻译为氨基酸，与标准基因条码序列所对应的氨基酸序列使用"P-distance模 型"计算遗传距离，若与未知种类粉阶基因序列遗传距离小于1%的标准基因条码种类，即为 目标种类;若遗传距离都大于1%，判定未知粉阶种类不在此21种粉阶范围内。
[0013] 本发明的有益效果主要体现在：（1)目标基因短，降低了实验对标本质量的需求， 扩增效率高；（2)种间变异大而种内变异小，W区分不同物种;包含足够的系统进化信息W 定位物种在分类系统中的位置，能满足使用需求。（3)操作简单，对物种分类鉴定知识缺乏 的人也可W通过标准技术流程对粉阶科物种进行鉴定；（4)不受个体发育阶段和形态特征 的限制，只要个体存在完整的目标DNA片段即可满足鉴定需求。
【附图说明】
[0014] 下面结合附图对本发明技术方案作进一步说明： 图1:扶桑绵粉阶、石蒜绵粉阶、康氏粉阶=种粉阶样品的引物PseJ /Pse府广增结果图。
[0015] 图2:实施例中的样品扩增条带示意图。
【具体实施方式】
[0016] 本发明掲示了一种粉阶科昆虫基因条形码检测试剂盒及其检测方法，本方法能高 效、准确、便捷的粉阶科昆虫分子检测技术，可在分子水平将粉阶科21种昆虫种类区分，能 满足使用需求。
[0017] -种粉阶科昆虫基因条形码检测试剂盒，可W快速检测21种粉阶，所述粉阶具体 如表1所示，所述试剂盒至少包括基因条形码序列盘和20次用量W上的引物PseJ /PseN试 剂： 引物PseJ序列：5 ' - CCTTCAACTAATCATAAAAATATNAG -3 '， 引物PseN序列：5 ' - TAAACTTCT GGATGTCCAAAAAATCA-3 ' ； 所述基因条形码序列盘存有93条标准条码序列，详细序列为SEQ ID NO.1到SEQ ID NO. 93所示。
[001引亲1 :粉阶种类与么疏
优选地，所述试剂盒还包括20次用量W上的下列试剂:Taq buffer,MgCb，dNTP mix, Taq DNA聚合酶，d地20, DNA标准样。
[0019] W下详细阐述下采用该试剂盒的检测和区分方法： 选取扶桑绵粉阶、石蒜绵粉阶、康氏粉阶、四纹豆象、白腹皮蠢、红蜡阶六份样品作为待 检测样品。步骤如下： 1)总DNA提取 DNA的提取采用GenMa浊io动物细胞组织/细胞基因组DNA磁珠提取试剂盒进行提取。 具体过程如下： 直接将1-2头昆虫样品放入2mm试管，无水乙醇浸泡保存标本用无菌蒸馈水冲洗浸泡4~ 5次，弃水;干标本无菌蒸馈水浸泡化后吸干水分。置于2mL离屯、管，MM400球磨仪中震荡娠磨 (30次/3)303，加入180化17313 8证'6'、20化？'〇16111日36 1(，震荡混匀，常溫过夜，55°(：震 荡溫浴3-化，12000巧m离屯、IOmin，取上清，加入200化Binding Buf fer和200化无水乙醇， 充分混匀，加入20化磁珠，轻柔颠倒混匀lOmin。离屯、管置于磁力架，吸弃管内液体，保留磁 珠 ，Wash Buffer I SOOuL颠倒混匀2min置于磁力架，弃去管内液体，Wash Buffer n同样 洗涂两次，离屯、管仍置于磁力架上，缓慢加入Wash Buffer虹，Imin后移走管内液体。加入 20化Elution Buffer,55°C水浴IOmin洗脱磁珠上吸附的DNA，4°C储存备用。
[0020] 2)序列扩增与测定 PCR反应体系：总体积为50 化，其中含5 yl IOXTaq buffer with KC1、2 mmol/L MgCbJOO ymol/L dNTP mix、2 U Taq DNA 聚合酶、3 yL DNA模板、引物各I ymol/l; 所述PCR反应体系为25化，其中模板DNA化L，含Mg2+的10 X反应缓冲液2.扣UdNTPs 0.2mmol/L化L，5pmol/L上游引物和下游引物各化L，1.0 U hq DNA聚合酶0.化L，无菌水 补至2如L。
[0021] 反应条件：95°C 预变性 4min;35 个循环：94°C 变形 1111111，48°(：退火1111111，72°(：延伸 90s;最后72°C延伸4min，4°C保存； 混合8 yL待测样品与2 yL 6 X Glycerol DNA loading Buffer上样，Wdna Marker DLlOO为分子量标记，室溫下恒压120 V，用3%琼脂糖凝胶电泳45 min，0.5% ymol/L的邸染 色，进行凝胶成像系统检测样品，拍照、分析； 电泳图，如图2所示，图中1为扶桑绵粉阶;图中2为石蒜绵粉阶;图中3为康氏粉阶;图中 4为四纹豆象;图中5为白腹皮蠢；图中6为红蜡阶。
[0022] 六个样品中、=种粉阶、红蜡阶扩增出7(K)bp大小的条带，四纹豆象、白腹皮蠢未扩 增出条带，排除的运两种不在粉阶科昆虫之内，且符合实际，排除准确。
[0023] W上扩增出条带的产物WPCR引物作为测序引物，进行双向测序，由苏州金唯智 生物科技有限公司完成。
[0024] 3)基因比对 利用现有的比对软件和计算机技术，将未知种类粉阶测序得到的序列结果与基因条形 码序列盘中标准基因条码序列进行比较，具体结果按W下方式运行： A:当序列与标准基因条码序列相似度100%，则认定其为该种类； B:当序列没有与任何标准条码序列相似度达100%，则将未知种类粉阶基因序列按"无 脊椎动物密码子"翻译为氨基酸，与标准基因条码的氨基酸序列使用"P-distance模型"计 算遗传距离，与未知种类粉阶基因序列遗传距离小于2%的标准基因条码种类，即为目标种 类;如果遗传距离都大于1%，说明未知粉阶种类不在此21种粉阶范围内。
[00巧]准确性检测： 所得5条序列依次输入基因条形码序列盘进行计算比对，结果如下： 1)石蒜绵粉阶序列与序列盘中谷斑粉阶标准条码基因相似度为100%，鉴定结果准确。
[0026] 2)扶桑绵粉阶序列与序列盘中扶桑绵粉阶标准条码基因相似度为98%，与序列盘 中扶桑绵粉阶标准条码基因遗传距离0.2%，按结果认定规则认定为扶桑绵粉阶，鉴定结果 准确。
[0027] 3)康氏粉阶序列与序列盘中康氏粉阶标准条码基因相似度为98%~100%，与序列盘 中的康氏粉阶标准条码基因遗传距离在0%~0.88%之间，按结果认定规则认定为康氏粉阶， 鉴定结果准确。
[0028] 4)红蜡阶与序列盘中粉阶标准条码基因遗传距离为31.9%~39.7%，远大于2%，按结 果认定规则认定非21种粉阶。
[0029] 所有结果与供试的样本种类相符，结果符合要求，表明该试剂盒可W准确鉴定运3 种粉阶。
[0030] 本发明尚有多种具体的实施方式，凡采用等同替换或者等效变换而形成的所有技 术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。
【主权项】
1. 一种粉蚧科昆虫基因条形码检测试剂盒，其特征在于：至少包括一基因条形码序列 盘和20次用量以上的引物PseJ与引物PseN;所述引物PseJ与引物PseN序列号为， PseJ:5'_ CCTTCAACTAATCATAAAAATATNAG -3'； PseN:5'-TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3； 所述基因条形码序列盘内存有93条标准条码序列，所述标准条码序列如SEQ ID NO.1 到SEQ ID NO.93所示。2. 根据权利要求1所述的一种粉蚧科昆虫基因条形码检测试剂盒，其特征在于:所述试 剂盒还包括20次用量以上的下列试剂：Taq buffer，MgCl2，dNTP mix，Taq DNA聚合酶， CldH2O，DNA 标准样。3. -种粉蚧科昆虫基因条形码检测试剂盒的检测方法，其特征在于，用所述试剂盒进 行扩增包括以下步骤： 51、 DNA模板的制备：采用GenMagBio动物细胞组织/细胞基因组DNA磁珠法提取试剂 盒，提取待检测样品； 52、 DNA条形码序列的扩增：以Sl中的DNA检测样品为模板，采用引物PseJ与引物PseN 进行PCR扩增，所述引物PseJ与引物PseN序列号为， PseJ:5'_ CCTTCAACTAATCATAAAAATATNAG -3'； PseN: 5 ' -TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3;所述PCR反应体系采用标准体系，总体积为 50yL 或 25yL; 所述PCR反应条件:95°C预变性4min;35个循环:94°C变形lmin，48°C退火lmin，72°C延 伸90s;最后72°C延伸4min，4°C保存； 53、 混合8yL待测样品与2yL 6 XGlycerol DNA上样缓冲液上样，以DNA Marker DLlOO 为分子量标记，室温下恒压120 V，用3%琼脂糖凝胶电泳45min，0.5% ymol/L的EB染色，凝胶 成像系统检测样品，拍照分析； 54、 PCR结果判定： 混合8yL PCR产物与2 yL 6 X Glycerol DNA上样缓冲液上样，以DNA Marker DLlOO为 分子量标记，室温下恒压120 V，用3 %琼脂糖凝胶电泳45分钟，0.5% μ mol/L的EB染色，凝胶 成像系统检测样品，拍照；照片显示粉蚧与标准DNA样品在700bp位置有清晰的扩增条带，即 为目标条带； 55、 RCR产物测序获得基因序列； 56、 粉蚧科昆虫基因比对 将待测粉蚧测序得到的序列与基因条形码序列盘中标准基因条码序列进行比对，若比 对相似度100%，则认定其为该种类;当没有与任何标准条码序列相似度达100%，则进行氨基 酸遗传距离的比对判定是否在目标范围内。4. 如权利要求3所述的一种粉蚧科昆虫基因条形码检测试剂盒的检测方法，其特征在 于，所述PCR反应体系为50yL，其中含5yL IOXTaq buffer 含有KCl、2mmol/L MgCl2、200μ mol/L dNTP mix、2U Taq DNA 聚合酶、3yL DNA模板、引物各Ιμπιο?/L; 所述？〇?反应体系为25以1^，其中模板0嫩2以1^，含1%2+的10\反应缓冲液2.5以1^，(11?1^ 0.2mmol/L 2yL，5pmol/L上游引物和下游引物各lyL，1.0 U Taq DNA聚合酶0.2yL，无菌水 补至25yL。5. 如权利要求3所述的一种粉蚧科昆虫基因条形码检测试剂盒的检测方法，其特征在 于，所述Sl中的样品为菠萝洁粉蚁、李比利氏灰粉蚁、灰粉蚁属一种 /3eo/7rerij〇es、萍绵粉蚁、绵粉蚁属一种/%e/3acocct/s amoae、绵粉蚁属一种PAe/jacocct/s parn/s、石蒜绵粉蚧、扶桑绵粉蚧、桔臀纹粉蚧、臀纹粉蚧属一种/^a/3〇 C〇CCtAs /ict/s、日本 臀纹粉蚁、臀纹粉蚁属一臀纹粉蚁属一种Planococcus minor、 臀纹粉蚁属一rarae、粉蚁属一种Pset/c/ococct/s 鹿根粉蚁、康氏 粉蚁、粉蚁属一种JpSeuczococcus CiTPius、杰克贝尔氏粉蚁、拟长尾粉蚁、粉蚁属一种 Pseudococcus viburni。6. 如权利要求3所述的一种粉蚧科昆虫基因条形码检测试剂盒的检测方法，其特征在 于，所述S6粉蚧科昆虫基因比对结果包括如下步骤， 561、 当得到的序列与标准基因条码序列相似度100%，则认定其为该种类； 562、 当没有与任何标准条码序列相似度达100%，则将待测粉蚧基因序列按"无脊椎动 物密码子"翻译为氨基酸，与标准基因条码序列所对应的氨基酸序列使用"P-distance模 型"计算遗传距离，若与未知种类粉蚧基因序列遗传距离小于1%的标准基因条码种类，即为 目标种类;若遗传距离都大于1%，判定未知粉蚧种类不在此21种粉蚧范围内。
【文档编号】C12Q1/68GK105925697SQ201610381928
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】郑斯竹, 杨晓军, 詹国辉
【申请人】苏州市外来有害生物防控技术中心