一种人果糖二磷酸醛缩酶B基因检测方法及试剂盒与流程

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种人果糖二磷酸醛缩酶B基因检测试剂盒，及其检测方法。

背景技术：

遗传性果糖不耐受症(Hereditary Fructose Intolerance，简称HFI)是为果糖代谢病的一种，为常染色体隐性遗传病，是由于醛缩酶B基因(ALDOB基因)突变致B型醛缩酶缺乏或活性降低，从而导致患者出现果糖代谢的异常。欧洲发病率约1:26100，而我国发病率目前尚不清楚。随着人民生活水平的提高，对糖的消费越来越多，HFI发病率会逐渐增多。

临床上遗传性果糖不耐受症患儿较少见，由于各种配方奶中大多含有蔗糖，所以出生后即人工喂养的新生患儿在2-3天内即可出现呕吐、腹泻、脱水、休克和出血倾向等急性肝功能衰竭症状。本病的临床诊断需要依靠血液生化检查和果糖耐量试验，但这两种方法均是损伤性的。采用分子生物学的方法辅助诊断具有损伤小、可行性好的优点。

现检测人果糖二磷酸醛缩酶B基因多态性的方法主要有直接测序和等位基因特异性寡核苷酸分析法(ASO)辅助检测。直接测序虽然准确率较高，但耗时长，成本高。等位基因特异性寡核苷酸分析法是利用PCR扩增产物后，变性在尼龙膜上点样，固定，然后用标记引物杂交，最后需放射自显影。这种方法的缺点在于操作复杂，对操作人员的技术要求高，需要放射显影，分辨率不高，耗时长。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种高准确性、低成本、高通量、快速的检测试剂盒，可用于检测人果糖二磷酸醛缩酶B基因是否存在突变。

本发明所采取的技术方案是：

一种人果糖二磷酸醛缩酶B基因检测试剂盒，所述检测试剂盒包括用于特异性扩增人果糖二磷酸醛缩酶B基因上3个多态性位点的引物对，3个多态性位点分别为A150P、A175D、N335K，所述引物对包括公共上游引物和分型下游引物，所述分型下游引物包括野生型特异引物和突变型特异引物，对应3个多态性位点的公共上游引物、野生型特异引物和突变型特异引物如下表所示：

表1、各个多态性位点的引物序列

F代表公共上游引物，W代表野生型特异引物，M代表突变型特异引物。

优选地，每个公共上游引物的5'端标记有荧光染料。所述荧光染料是FAM、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5、JOE、VIC、PET中的一种或多种。

本发明所述人果糖二磷酸醛缩酶B基因检测试剂盒还包括对照基因序列，所述对照基因序列包括正常序列和突变序列。

所述正常序列：

CAAAGGGAGAACTCCTTCCCTTTATTAGAAGCCCCATGGATCAGGTACAAAGGTACAAAGAAGCCTTTCTCTCTTTTGTGACTTGCAGGGCTTGATGGCCTCTCAGAGCGCTGTGCTCAGTACAAGAAAGATGGTGTTGACTTTGGGAAGTGGCGTGCTGTGCTGAGGATTGCCGACCAGTGTCCATCCAGCCTCGCTATCCAGGAAAACGCCAACGCCCTGGCTCGCTACGCCAGCATCTGTCAGCAGGTGCTCTGCCTTCCCCTTGGGCTGAAAAAGAGTAGGCTAGAGTTTTCTTCAGAGCTTTTCTTTTCAATTATACTATAACTACAAATGGACCTCCTTTTCCCAGAAGGGGATGGTATCCCCAGCAATATTCAGCAACATTGCTGTAAAAAGAAGAAAATCTGAGTGAAGGTTTGACTGGTTTCCCATGAGAGGCAGACAGGGTCAAGGTGGGGTCACATTTACTCTAACCAGTCTCCTCTCTCATATTTGTCTTCTAGGCTAACTGCCAGGCGGCCAAAGGACAGTATGTTCACACGGGTTCTTCTGGGGCTGCTTCCACCCAGTCGCTCTTCACAGCCTGCTATACCTACTAGGGTCCAATGCCCGCCAGCCTAGCTCCAGTGCTTCTAGTAGGAGGGCTGAAAGGGAGCAACTTTTCCTCCAATCCTGGAAATTCGACACAATTAGATTT(SEQ ID NO.10)

所述突变序列：

CAAAGGGAGAACTCCTTCCCTTTATTAGAAGCCCCATGGATCAGGTACAAAGGTACAAAGAAGCCTTTCTCTCTTTTGTGACTTGCAGGGCTTGATGGCCTCTCAGAGCGCTGTGCTCAGTACAAGAAAGATGGTGTTGACTTTGGGAAGTGGCGTCCTGTGCTGAGGATTGCCGACCAGTGTCCATCCAGCCTCGCTATCCAGGAAAACGCCAACGCCCTGGCTCGCTACGACAGCATCTGTCAGCAGGTGCTCTGCCTTCCCCTTGGGCTGAAAAAGAGTAGGCTAGAGTTTTCTTCAGAGCTTTTCTTTTCAATTATACTATAACTACAAATGGACCTCCTTTTCCCAGAAGGGGATGGTATCCCCAGCAATATTCAGCAACATTGCTGTAAAAAGAAGAAAATCTGAGTGAAGGTTTGACTGGTTTCCCATGAGAGGCAGACAGGGTCAAGGTGGGGTCACATTTACTCTAACCAGTCTCCTCTCTCATATTTGTCTTCTAGGCTAAGTGCCAGGCGGCCAAAGGACAGTATGTTCACACGGGTTCTTCTGGGGCTGCTTCCACCCAGTCGCTCTTCACAGCCTGCTATACCTACTAGGGTCCAATGCCCGCCAGCCTAGCTCCAGTGCTTCTAGTAGGAGGGCTGAAAGGGAGCAACTTTTCCTCCAATCCTGGAAATTCGACACAATTAGATTT(SEQ ID NO.11)

所述的人果糖二磷酸醛缩酶B基因检测试剂盒还包括PCR缓冲液、热启动Taq酶、超纯水、荧光分子量内标和等位基因分型标准物。

本发明还提供了使用上述人果糖二磷酸醛缩酶B基因检测试剂盒的使用方法，包括对样品中人果糖二磷酸醛缩酶B基因的3个多态性位点的扩增采用聚合酶链式反应，其扩增产物的检测采用高效液相色谱、多重荧光毛细管电泳或聚丙烯酰氨凝胶电泳。

其中，聚合酶链式反应的扩增程序为：95℃2分钟；94℃30秒、60℃30秒、72℃30秒，共10个循环；94℃30秒、59℃30秒、72℃30秒，共18个循环；72℃10分钟。

本发明的有益效果是：

(1)基于聚合酶链式反应，提高了多态性位点检测的模板量，大大降低假阳性；

(2)公共上游引物通过配备不同的荧光基团，能在一次电泳下最多可以检测4-96个样本的基因分型，具有高效节约的特点；

(3)聚合酶链式反应在1个小时内完成，毛细管电泳检测过程也不足1个小时，整个检测过程在3小时内完成，具有用时少，快速和准确度高的特点；

(4)可以省去DNA抽提步骤，唾液卡、FTA卡和血滤纸可以直接扩增，减少了操作步骤，简化了其操作流程；

(5)本发明能够准确判断正常及突变样本的基因分型。

附图说明

图1是试剂盒中正常序列对照野生型特异引物的3个位点检测图谱；

图2是试剂盒中突变序列对照突变型特异引物的3个位点检测图谱；

图3是实施例1的检测图谱；

图4是实施例2的检测图谱；

图5是实施例3的检测图谱；

图6是实施例4的检测图谱；

图7是实施例5的检测图谱；

图8是实施例6的检测图谱。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明针对的3个人果糖二磷酸醛缩酶B基因的多态性位点所在的序列如下表所示：

表2、各个多态性位点的序列

W代表野生型序列，M代表突变型序列。

人果糖二磷酸醛缩酶B基因检测试剂盒，所述检测试剂盒包括用于特异性扩增人果糖二磷酸醛缩酶B基因上3个多态性位点的引物对，3个多态性位点分别为A150P、A175D、N335K，所述引物对包括公共上游引物和分型下游引物，所述分型下游引物包括野生型特异引物和突变型特异引物，其中上游引物为共用引物，包括荧光标记和靶序列特异结合区；下游引物包括分型识别位点和长度调节区，所述荧光染料是FAM、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5、JOE、VIC、PET中的一种或多种。还包括对照基因序列、PCR缓冲液、热启动Taq酶、超纯水、荧光分子量内标和等位基因分型标准物，所述对照基因序列包括正常序列和突变序列。

具体为如下表所示：

表3、试剂盒的组成

扩增后

本发明试剂盒的具体使用方法：

1、样本DNA的提取

根据样本的实际情况，选择合适的方法提取样本DNA，常见的方法有：磁珠法、阴离子交换树脂法和碱裂解法等等。若样本是血滤纸、FTA卡、唾液卡等，可简化步骤，直接扩增。

2、PCR反应

PCR反应的扩增体系如下：

PCR反应的扩增程序如下：

3、遗传分析仪荧光电泳检测

12μL去离子甲酰胺与0.5μL分子量内标(AGCU Marker SIZ-500)混合。再加入1μL PCR反应产物或ALDOB Allelic Ladder，涡旋混匀3500r/min离心2min，95℃变性3min，冰浴3min，用遗传分析仪ABI3130XL进行检测分析。

实施例1：

①标准图谱的建立

按上述使用方法对照基因序列进行检测，获得如图1和2所示的正常序列对照野生型特异引物的3个位点检测图谱以及突变序列对照突变型特异引物的3个位点检测图谱；

②样品检测及对照

按上述使用方法对一号样品进行检测，获得如图3所示的图谱，可知一号样品为A150P位点单位点突变。

实施例2：

其整体流程与实施例1相同，二号样品的检测结果如图4所示，可知二号样品为A175D位点单位点突变。

实施例3：

其整体流程与实施例1相同，三号样品的检测结果如图5所示，可知三号样品为N335K位点单位点突变。

实施例4：

其整体流程与实施例1相同，四号样品的检测结果如图6所示，可知四号样品为A150P和A175D位点双位点突变。

实施例5：

其整体流程与实施例1相同，五号样品的检测结果如图7所示，可知五号样品为A150P和N335K位点双位点突变。

实施例6：

其整体流程与实施例1相同，六号样品的检测结果如图8所示，可知六号样品为A175D和N335K位点双位点突变。

以上对本发明的较佳实施方式进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可作出种种的等同变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东华美众源生物科技有限公司

<120> 一种人果糖二磷酸醛缩酶B基因检测方法及试剂盒

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<212> DNA

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ctaatcggca atcctcagca cagg 24

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cttgcagggc ttgatggcct c 21

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tgtccatcca gcctcgctat ccaggaaaac gccaacgccc tggctcgcta cgacagcatc 240

tgtcagcagg tgctctgcct tccccttggg ctgaaaaaga gtaggctaga gttttcttca 300

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