一种果糖基转移酶的复合固定化方法
【技术领域】
[0001]一种果糖基转移酶的复合固定化方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]低聚果糖是指蔗糖中的果糖基通过β -1, 2糖苷键与I?3个D-果糖结合所形成的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖及其混合物的总称，又称果寡糖、蔗果三糖族低聚糖等，分子式为G-F-Fn (G为葡萄糖，F为果糖，η=1?3)。低聚果糖是一种益生元，其具有改善肠道菌群，抑制肠道腐败，润肠通便，促进矿物质的吸收，改善脂质代谢，增强免疫力等生理功效。目前，国内外很多企业多采用以蔗糖为原料的酶转化法来生产低聚果糖。
[0003]酶转化法生产低聚果糖的原理是以蔗糖为底物，利用果糖基转移酶的催化作用，进行分子间果糖基转移反应而获得低聚果糖。酶转化法生产低聚果糖又可分为间歇性生产与连续性生产两种方式。间歇性生产又名深层发酵生产，是指直接将果糖基转移酶与50%?60%蔗糖溶液混合，在一定温度和pH下反应生产低聚果糖。其优点是工艺设备简单，但酶无法实现重复利用，且低聚果糖产量也较低，生产成本较高。因此国内外多采用连续性生产的方式，即固定化酶法。
[0004]工业上果糖基转移酶的提取多采用机械破壁法，该法所用设备价格昂贵。相比而言，本发明所采用的自然裂解法成本较低。自然裂解法是指将菌株在合适的培养基中培养，待后期代谢废物积累，生存环境恶化，但菌体尚未死亡，尚未裂解的时候，过滤，用无菌水洗涤菌体，然后将菌体转移至无菌水中继续培养。随时间的延长，菌体会死亡裂解，内容物被释放出来，但果糖基转移酶尚未水解或仅有少量水解，此时进行过滤，即得酶液。
[0005]中国专利200910026901.7公开了一种以大孔阴离子树脂固定化果糖基转移酶的方法，它包括游离果糖基转移酶的制备及果糖基转移酶的固定化两部分。该发明以大孔阴离子树脂D380、D296R或D301-1II为载体，以戊二醛为交联剂，采用先吸附后交联的方法进行固定化。该法酶活回收率虽然可达81.2%，但循环使用次数仅10次，反复利用次数较少。该法中一部分酶静电吸附于树脂上，一部分共价交联于树脂上。在固定化酶与蔗糖反应过程中，靠静电作用吸附于树脂上的酶有可能被其他带负电的离子替换，从而脱离树脂，造成流失，导致固定化酶活力下降。
[0006]本方法的固定化工艺为复合固定化即先交联再包埋。以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂所得到的固定化酶为碎肩状，虽有利于酶促反应，但不易回收利用，存在成型和整形的问题。在此固定化酶的基础上再经海藻酸钙凝胶包埋则可较好地解决成型和整型的问题。经该法所得到的固定化酶酶活回收率高(70%以上)，分批反应时，可反复使用85次以上。
[0007]
【发明内容】
:
本发明针对现有技术的不足，提供了一种果糖基转移酶的复合固定化方法。本发明采用自然裂解法，通过简单的工艺设备，有效地提取了果糖基转移酶；有效地解决了壳聚糖共价固定化酶的成型和整型问题；克服了液体深层发酵的缺点，实现了酶的反复利用；获得了酶活回收率高、反复使用次数多的固定化果糖基转移酶。
[0008]本发明技术方案采用以下步骤:
一种果糖基转移酶的复合固定化方法，包括如下步骤:
(1)将产酶菌株接种于发酵培养基中，在温度28-32°C、通气量500-1500ml/min、搅拌速度80-150r/min的条件下，培养4_6天，制得发酵液；
上述发酵培养基组分如下，均为重量百分比:
蔗糖5%-15%，豆柏5%-10%，余量水，初始ρΗ6.5-7.5 ；
(2)将步骤(I)制得的发酵液经菌体破壁、过滤，制得果糖基转移酶粗酶液；
(3)将果糖基转移酶粗酶液进行真空减压浓缩，用高效液相色谱法测定浓缩后料液的酶活力，控制浓缩液的酶活在100U/ml以上；
(4)将浓缩后果糖基转移酶酶液分别与壳聚糖、海藻酸钠和氯化钙进行复合固定化处理，最终制得固定化果糖基转移酶。
[0009]根据本发明优选的，所述步骤(I)中的产酶菌株为黑曲霉或米曲霉。
[0010]根据本发明优选的，所述步骤(2 )中的菌体破裂采用的方法是自然裂解法。
[0011]根据本发明优选的，所述步骤(2)中，条件如下:用滤布将经步骤(I)发酵培养后的菌体进行过滤并收集菌体，用无菌水洗涤菌体3-5次，接入与发酵液相同体积的无菌水中继续培养菌体3-5d后，过滤除去破碎菌体，即得果糖基转移酶酶液。
[0012]根据本发明优选的，所述步骤(4)中，复合固定化包括共价固定化和包埋固定化两步。
[0013]根据本发明优选的，共价固定化的反应条件为:选择壳聚糖为共价固定化载体，将果糖基转移酶与壳聚糖载体按酶活100-200U/g载体的比例进行混合后，按0.5%-1% (w/w)的比例加入交联剂戊二醛，调节pH值6.5-7.5，共价固定化温度30-40°C，以100_160r/min的速度搅拌5-10h。
[0014]根据本发明优选的，包埋固定化的反应条件为:将共价固定化的果糖基转移酶充分洗涤后，离心甩干。将海藻酸钠溶液与经过共价固定化的果糖基转移酶在10-15?条件下充分混合，混合比例为每10ml海藻酸钠溶液中加入l_5g共价固定化的果糖基转移酶。将混合后料液缓缓滴入CaCl2S液中，形成滴丸。最后将形成的滴丸放入同浓度的CaCl 2溶液中硬化处理10-20h后，即获得复合固定化的果糖基转移酶。
[0015]根据本发明优选的，所述的海藻酸钠溶液浓度为2%_4% (w/w)。
[0016]根据本发明优选的，所述的CaCl2溶液浓度为3%_5% (w/w)o
[0017]有益效果
1、目前工业上果糖基转移酶的提取多采用机械破壁法，该法所用设备价格昂贵、技术复杂、成本非常高。而本发明中果糖基转移酶的提取采用的是自然裂解法。自然裂解法是指菌体在培养后期，尚未死亡、裂解时，对菌体进行过滤及洗涤，并将菌体转移至无菌水中继续培养直至菌体自然死亡裂解，内容物及酶液自行释放的过程。该种裂解法方法新颖、使用设备简单、成本非常低，极适合于工业化大规模生产的运用。
[0018]2、经树脂吸附固定的果糖基转移酶，在分批反应过程中，酶分子易脱落，使得该固定化酶的利用次数减少；经壳聚糖共价固定的果糖基转移酶，多呈碎肩状，该固定化酶与底物可充分接触并反应，但不易回收利用，需整型才可用于连续生产低聚果糖。而本发明中果糖基转移酶先经壳聚糖共价固定再用海藻酸钙包埋，酶分子不易脱落且有效地解决了壳聚糖共价固定化酶的成型和整型问题，更利于工业化生产低聚果糖。
[0019]3、利用本发明技术使酶的固定化效率高(酶活回收率达70%以上)，分批反应时，该固定化酶可反复使用85次以上。
【具体实施方式】
[0020]为了更好的阐述本发明的技术方案，下面通过实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
[0021]实例一
一种果糖基转移酶的复合固定化方法，包括如下步骤:
(1)将产酶菌株一黑曲霉接种于发酵培养基中，在温度28-32°C、通气量500ml/min、搅拌速度150r/min的条件下，培养6天，制得发酵液；
上述发酵培养基组分如下，均为重量百分比:
蔗糖5%，豆柏10%，余量水，初始ρΗ6.5 ；
(2)将步骤(I)制得的发酵液经菌体破壁、过滤，制得果糖基转移酶粗酶液；其中，菌体破裂采用自然裂解法，具体步骤包括:用滤布将经步骤(I)发酵培养后的菌体进行过滤并收集菌体，用无菌水洗涤菌体3次，接入与发酵液相同体积的无菌水中继续培养菌体3d后，过滤除去破碎菌体，即得果糖基转移酶酶液。
[0022](3)将果糖基转移酶粗酶液进行真空减压浓缩，用高效液相色谱法测定浓缩后料液的酶活力，控制浓缩液的酶活在120U/ml ；
(4)将浓缩后果糖基转移酶酶液分别与壳聚糖、海藻酸钠和氯化钙进行复合固定化处理，最终制得固定化果糖基转移酶。其中，复合固定化包括共价固定化和包埋固定化两步。
[0023]本实施例中，共价固定化的反应条件为:选择壳聚糖为共价固定化载体，将果糖基转移酶与壳聚糖载体按酶活200U/g载体的比例进行混合后，按1% (w/w)的比例加入交联剂戊二醛，调节pH值6.5，共价固定化温度30°C，以100r/min的速度搅拌10h。
[0024]本实施例中，包埋固定化的反应条件为:将共价固定化的果糖基转移酶充分洗涤后，离心甩干。将溶液浓度为2% (w/w)的海藻酸钠溶液与经过共价固定化的果糖基转移酶在10°C条件下充分混合，混合比例为每10ml海藻酸钠溶液中加入Ig共价固定化的果糖基转移酶。将混合后料液缓缓滴入溶液浓度为5% (w/w)的CaC12溶液中，形成滴丸。最后将形成的滴丸放入同浓度的CaC12溶液中硬化处理1h后，即获得复合固定化的果糖基转移酶。
[0025]经检测，果糖基转移酶的复合固定化效率高，酶活回收率达75%;分批反应时，可反复使用90次。
[0026]实例二
一种果糖基转移酶的复合固定化方法，包括如下步骤:
Cl)将产酶菌株一黑曲霉接种于发酵培养基中，在温度28-32°C、通气量1000ml/min、搅拌速度llOr/min的条件下，培养5天，制得发酵液；
上述发酵培养基组分如下，均为重量百分比:
蔗糖10%，豆柏7%，余量水，初始ρΗ7.0 ； (2)将步骤(I)制得的发酵液经菌体破壁、过滤，制得果糖基转移酶粗酶液；其中，菌体破裂采用自然裂解法，具体步骤包括:用滤布将经步骤(I)发酵培养后的菌体进行过滤并收集菌体，用无菌水洗涤菌体4次，接入与发酵液相同体积的无菌水中继续培养菌体4d后，过滤除去破碎菌体，即得果糖基转移酶酶液。
[0027](3)将果糖基转移酶粗酶液进行真空减压浓缩，用高效液相色谱法测定浓缩后料液的酶活力，控制浓缩液的酶活在150U/ml ；
(4)将浓缩后果糖基转移酶酶液分别与壳聚糖、海藻酸钠和氯化钙进行复合固定化处理，最终制得固定化果糖基转移酶。其中，复合固定化包括共价固定化和包埋固定化两步。
[0028]本实施例中，共价固定化的反应条件为:选择壳聚糖为共价固定化载体，将果糖基转移酶与壳聚糖载体按酶活150U/g载体的比例进行混合后，按0.75% (w/w)的比例加入交联剂戊二醛，调节PH值7.0，共价固定化温度35°C，以1