专利名称：β-呋喃果糖苷酶酶联免疫检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种β -呋喃果糖苷酶酶联免疫检测试剂盒。
背景技术：
β -呋喃果糖苷酶(EC 3. 2. 1. 26),也称转化酶，主要来源于酵母。催化下列反应， 蔗糖+水- 葡萄糖+果糖
该酶与蜂蜜中天然存在的蔗糖转化酶催化产物相同，因此，不法分子常常在蜂蜜生产加工过程中非法使用呋喃果糖苷酶，以廉价的糖浆添加此酶假冒蜂蜜。如果在人工糖浆中添加此酶，可以用同位素分析法检测，但是，若在C3糖(如甜菜糖)中加入此酶，则同位素分析法难以检测出来。蜂蜜是一种天然产品，根据GB/T 18796—2005蜂蜜国家标准，蜂蜜中不得添加或混入任何糖类、代糖类物质。假蜂蜜对社会造成了巨大危害。首先，蜂蜜造假使得蜂农收入下降，从事养蜂的人越来越少；其二，随着蜜蜂群的减少，整个生态环境也面临巨大压力， 带来的直接后果是农产品减产；第三，对蜂蜜产品行业的健康发展也造成了很大打击，假蜂蜜生产企业获利丰厚，真蜂蜜生产企业亏损累累。更为严重的是，消费者花了三四倍的价钱买到的却是假货，损害了广大消费者的权益。出口蜂蜜造假，严重损害我国商品在国际市场的形象。蜂蜜中除了糖与水，还有矿物质、维生素、胶体物质、蛋白质和氨基酸、芳香物质及其他成分每100克蜂蜜中含有1200 1500微克乙酞胆碱，0. 0. 4%的抑菌素， 还含有松属素类黄酮物质、色素、激素等有效物质和一些不明成分的物质等。蜂蜜的价值与这些物质密切相关，而假蜂蜜却仅是糖的替代品，其营养价值远不及蜂蜜。目前，β -呋喃果糖苷酶检测方法主要是高效液相色谱法，该方法仪器昂贵，检测时间长，前处理复杂，不适合高通量、快速检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高灵敏度、能够快速检测蜂蜜中β -呋喃果糖苷酶含量的呋喃果糖苷酶酶联免疫检测试剂盒。本发明解决上述技术问题采取的技术方案
一种β-呋喃果糖苷酶酶联免疫检测试剂盒，其包括β-呋喃果糖苷酶标准酶液、包被有β -呋喃果糖苷酶鼠单克隆抗体的酶标板、样品稀释液、β -呋喃果糖苷酶兔多克隆抗体工作液、酶标记二抗工作液、底物显色液、浓缩洗涤液和终止液。所述β -呋喃果糖苷酶标准酶液的浓度为10U/ml。所述包被有β-呋喃果糖苷酶鼠单克隆抗体的酶标板的制备方法为用 5-50mmol/L碳酸缓冲液作为包被液稀释β -呋喃果糖苷酶鼠单克隆抗体至2_2(^g/ml，混勻，加到96孔酶标板中，每孔ΙΟΟμΙ，40C反应14-16小时，然后倒掉孔中溶液，用所述浓缩洗涤液洗板4次，拍干，每孔加入150μ1封闭液，37°C封闭1小时，倒掉孔中溶液，浓缩洗涤液洗板4次，每孔加入200μ1保护剂，反应1-2小时，倒掉保护剂，拍干，真空干燥，装入铝箔袋
真空密封保存。所述保护剂为8% (w/w)酶稳定剂M。所述样品稀释液是在lOmmol/L pH7_10的碳酸盐缓冲液中加入1% (w/w)小牛血清、0.05% (w/w) Tween-20 和 0. 01% (w/w)叠氮钠制成。所述β -呋喃果糖苷酶兔多克隆抗体工作液是在封闭液中加入与所述封闭液质量比为1:2000-5000的β-呋喃果糖苷酶兔多克隆抗体制成。所述酶标记二抗工作液是在封闭液中加入与所述封闭液质量比为1:5000-10000 的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体制成。所述封闭液是在0. lmol/L pH7. 2-7. 4磷酸缓冲液中加入5% (w/w)的小牛血清和 0. 05% (w/w) Tween-20 制成。所述底物显色液包括A底物显色液和B底物显色液，所述A底物显色液是由20mg TMB加IOml无水乙醇，充分震荡溶解后加双蒸水定容至IOOml制成，所述B底物显色液是由 0. 47g 柠檬酸、1. 84g Na2HPO4. 12Η20，0· 75% (w/w)的过氧化氢尿素 0. 64ml，ρΗ5· 0-5. 4， 双蒸水定容至IOOml制成，使用时所述A底物显色液和B底物显色液质量比1 :1混合；所述浓缩洗涤液是在0. lmol/L pH7. 2-7. 4的磷酸盐缓冲液中加入0. 05% (w/w) Tween-20和 0. 01% (w/w)的叠氮钠制成；所述终止液为1. Omol/L的硫酸。本发明采用上述技术方案取得的有益效果是本发明试剂盒采用双抗夹心ELISA 方法测定蜂蜜样品中β “呋喃果糖苷酶的含量，剂量_反应曲线的线性相关系数> 0. 980， R2=O. 9993，灵敏度为10U/KG，符合国家ELISA检测质量要求。本试剂盒板内变异系数(CV%) 小于10%，测定结果稳定，精密度良好。本发明试剂盒的优点是样品处理简单，检测快速，检测时间仅为2. 5小时，灵敏、准确和高通量，为检测蜂蜜造假提供了有效的手段。
图1为本发明试剂盒的β -呋喃果糖苷酶剂量_反应曲线。
具体实施例方式实施例1 抗体的制备与纯化 1. 1鼠单克隆抗体的制备
选取健康的8周龄雌性BALB/C小鼠进行β-呋喃果糖苷酶免疫，免疫剂量以β-呋喃果糖苷酶计每次50-100μβ/只，每次免疫间隔两周，免疫5次。第一次免疫将免疫原β-呋喃果糖苷酶与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂注射，采用颈背部皮下多点注射，2-4次免疫将免疫原与等量的弗氏不完全佐剂混合制成乳化剂注射，采用颈背部皮下多点注射， 最后一次，不加佐剂进行腹部加强免疫。最后一次免疫3天后取小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤细胞。筛选阳性细胞株，经数次亚克隆，直至细胞株达到全阳性， 稳定分泌呋喃果糖苷酶抗体后，进行细胞冻存。培养该细胞株，注入致敏的小鼠腹腔， 收集腹水。经辛酸_硫酸铵沉淀，葡萄球菌蛋白A-S印arose CL-4B柱纯化，透析、冻干后保存。1.2兔多克隆抗体的制备选用健康的2公斤左右的新西兰大白兔为免疫动物，免疫剂量以β-呋喃果糖苷酶计 350μδ/只/次，颈背部皮下多点注射，每次免疫间隔为两周，免疫六次。第一次免疫将抗原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，二到六次免疫将抗原与等量的弗氏不完全佐剂混合制成乳化剂。三免后开始监测血清抗体效价。六免后7-10天颈动脉采血，分离血清。经硫酸铵沉淀，葡萄球菌蛋白A-S印arose CL-4B柱纯化、透析、冻干后保存。实施例2 试剂盒的组建
本发明的ELISA试剂盒包括鼠抗β -呋喃果糖苷酶单克隆抗体包被的酶标板，兔抗 β -呋喃果糖苷酶多克隆抗体、酶标记二抗工作液、β “呋喃果糖苷酶标准品、样品稀释液、 底物显色液、浓缩洗涤液和终止液。2. 1酶标板的包被
用棋盘法确定最适包被浓度，用包被液(5-50mmol/L碳酸缓冲液)稀释步骤1. 1中所得单克隆抗体至2-2(^g/ml混勻，加到96孔酶标板中，每孔ΙΟΟμΙ，4°C 14-16小时。倒掉孔中溶液，浓缩洗涤液洗板4次，拍干。每孔加入150μ1封闭液，37°C 1小时，倒掉孔中溶液，浓缩洗涤液洗板4次。每孔加入200μ1保护剂，反应1-2小时。倒掉保护剂，拍干，真空干燥， 装入铝箔袋真空密封保存。2. 2所用试剂的配制
样品稀释液是在lOmmol/L pH7_10的碳酸盐缓冲液中加入1% (w/w)小牛血清、0. 05% (w/w) Tween-20 和 0. 01% (w/w)叠氮钠制成。封闭液是在0. lmol/L pH7. 2-7. 4磷酸缓冲液中加入5%(w/w)的小牛血清和0. 05% (w/w) Tween-20 制成。β -呋喃果糖苷酶兔多克隆抗体工作液是在封闭液中加入与所述封闭液质量比为 1:2000-5000的β-呋喃果糖苷酶兔多克隆抗体制成。酶标记二抗工作液是在封闭液中加入与所述封闭液质量比为1:5000-10000的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体制成。底物显色液包括A底物显色液和B底物显色液，所述A底物显色液是由20mg TMB 加IOml无水乙醇，充分震荡溶解后加双蒸水定容至100ml制成，所述B底物显色液是由 0. 47g柠檬酸、1. 84g Na2HPO4. 12Η20，0· 75% 的过氧化氢尿素0. 64ml，ρΗ5. 0-5. 4，双蒸水定容至100ml制成，使用时所述A底物显色液和B底物显色液质量比1 :1混合。浓缩洗涤液是在0. lmol/L ρΗ7· 2-7. 4的磷酸盐缓冲液中加入0. 05% (w/w) Tween-20和0. 01% (w/w)的叠氮钠制成。终止液为1. Omol/L的硫酸。实施例3蜂蜜样品中β-呋喃果糖苷酶检测 3. 1.样品前处理
准确称取一定量蜂蜜样品，加入3倍重量样品稀释液，50-80°C恒温水浴5-10分钟，取出，冷却至室温备用。3. 2试剂盒检测
(1)取出包被好的酶标板，每孔加入ΙΟΟμΙ标准品或样品，37°C孵育40分钟。(2)洗板倒掉孔内溶液，每孔加入洗涤液200-300μ1，倒掉洗涤液，反复3_4次， 将酶标板拍干。
(3)加入ΙΟΟμΙ多抗工作液，37°C孵育40分钟。(4)浓缩洗涤液洗板。(5)加入ΙΟΟμΙ酶标二抗工作液，37°C孵育40分钟。(6)浓缩洗涤液洗板。(7)加入ΙΟΟμΙ显色液，37°C孵育10分钟。(8)加入50μ1终止液终止反应。(9)用酶标仪测定450nm和595nm波长吸光值(OD)值。3. 3结果分析
获得的不同浓度标准品450nm OD值减去本底595nm OD值，以β -呋喃果糖苷酶浓度为纵坐标，以减去本底的标准品OD值为横坐标，绘制标准曲线。计算样品450nm OD值减去本底595nm OD值，利用回归方程计算样品中β-呋喃果糖苷酶含量。实施例4 试剂盒灵敏度实验
准确称取一定量的封盖蜜，加入3倍重量的样品稀释液，加入不同剂量β -呋喃果糖苷酶的标准液，配制成每公斤蜂蜜分别含0、5、10、20、40、80单位的β -呋喃果糖苷酶的标准品，用上述ELISA试剂盒的使用方法检测，每个浓度设三个重复，结果见表1。表1标准品OD值测定结果
权利要求
1.一种β-呋喃果糖苷酶酶联免疫检测试剂盒，其特征在于其包括β-呋喃果糖苷酶标准酶液、包被有β-呋喃果糖苷酶鼠单克隆抗体的酶标板、样品稀释液、β-呋喃果糖苷酶兔多克隆抗体工作液、酶标记二抗工作液、底物显色液、浓缩洗涤液和终止液。
2.根据权利要求1所述的呋喃果糖苷酶酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述 β -呋喃果糖苷酶标准酶液的浓度为10U/ml。
3.根据权利要求1所述的呋喃果糖苷酶酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述包被有β-呋喃果糖苷酶鼠单克隆抗体的酶标板的制备方法为用5-50mmol/L碳酸缓冲液作为包被液稀释β -呋喃果糖苷酶鼠单克隆抗体至2-2(^g/ml，混勻，加到96孔酶标板中，每孔100μ1，4 反应14-16小时，然后倒掉孔中溶液，用所述浓缩洗涤液洗板4次，拍干，每孔加入150μ1封闭液，37°C封闭1小时，倒掉孔中溶液，浓缩洗涤液洗板4次，每孔加入200μ1 保护剂，反应1-2小时，倒掉保护剂，拍干，真空干燥，装入铝箔袋真空密封保存。
4.根据权利要求3所述的呋喃果糖苷酶酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述保护剂为8% (w/w)酶稳定剂Μ。
5.根据权利要求1所述的呋喃果糖苷酶酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述样品稀释液是在10mmol/L pH7_10的碳酸盐缓冲液中加入1% (w/w)小牛血清、0. 05% (w/w) Tween-20 和 0. 01% (w/w)叠氮钠制成。
6.根据权利要求1所述的呋喃果糖苷酶酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述β-呋喃果糖苷酶兔多克隆抗体工作液是在封闭液中加入与所述封闭液质量比为 1:2000-5000的β-呋喃果糖苷酶兔多克隆抗体制成。
7.根据权利要求1所述的呋喃果糖苷酶酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述酶标记二抗工作液是在封闭液中加入与所述封闭液质量比为1:5000-10000的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体制成。
8.根据权利要求3或6或7所述的β-呋喃果糖苷酶酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述封闭液是在0. lmol/L pH7. 2-7. 4磷酸缓冲液中加入5% (w/w)的小牛血清和0. 05% (w/w) Tween-20 制成。
9.根据权利要求1所述的呋喃果糖苷酶酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述底物显色液包括A底物显色液和B底物显色液，所述A底物显色液是由20mg TMB加IOml无水乙醇，充分震荡溶解后加双蒸水定容至IOOml制成，所述B底物显色液是由0. 47g柠檬酸、1. 84g Na2HPO4. Iffl20,0. 75% (w/w)的过氧化氢尿素 0. 64ml, ρΗ5· 0-5. 4，双蒸水定容至 IOOml制成，使用时所述A底物显色液和B底物显色液质量比1 :1混合；所述浓缩洗涤液是在 0. lmol/L pH7. 2-7. 4 的磷酸盐缓冲液中加入 0. 05% (w/w) Tween-20 和 0. 01% (w/w)的叠氮钠制成；所述终止液为1. 0mol/L的硫酸。
全文摘要
本发明涉及一种β-呋喃果糖苷酶酶联免疫检测试剂盒，其包括β-呋喃果糖苷酶标准酶液、包被有β-呋喃果糖苷酶鼠单克隆抗体的酶标板、样品稀释液、β-呋喃果糖苷酶兔多克隆抗体工作液、酶标记二抗工作液、底物显色液、浓缩洗涤液和终止液。本发明试剂盒采用双抗夹心ELISA方法测定蜂蜜样品中β-呋喃果糖苷酶的含量，剂量-反应曲线的线性相关系数＞0.980，R2=0.9993，灵敏度为10U/KG，符合国家ELISA检测质量要求。本试剂盒板内变异系数(CV%)小于10%，测定结果稳定，精密度良好。本发明试剂盒的优点是样品处理简单，检测快速，检测时间仅为2.5小时，灵敏、准确和高通量，为检测蜂蜜造假提供了有效的手段。
文档编号G01N33/577GK102495211SQ20111040337
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月7日 优先权日2011年12月7日
发明者史延茂, 吴萌, 李君华, 闫静辉, 陈英珠, 齐颖颖 申请人:河北省科学院生物研究所