一种黑曲霉在制备β-呋喃果糖苷转移酶中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制品领域，具体涉及一种黑曲霉在制备β-呋喃果糖苷转移酶中 的应用。
【背景技术】
[0002] 蔗果低聚糖（F0S)，是由1~3个果糖基通过β-1，2糖苷键与蔗糖（GF)中的果糖 基结合生成的蔗果三糖（GF2)、蔗果四糖（GF3)和蔗果五糖（GF4)等的混合物，是一种新型的 功能性低聚果糖。F0S热量低，具有降血脂、防龋齿、防止有害菌生长等优异性能，还具有促 进人体双歧杆菌等益生菌生长等生理活性，因此被广泛应用于食品、饲料和化妆品等行业。
[0003] 目前生产F0S的方法主要有5种：（1)直接从天然植物原料中提取；（2)利用天 然多糖的酶水解、酸水解反应获得；(3)通过化学合成的方法获得；(4)利用菌体进行液体 深层发酵获得；（5)利用转移酶、水解酶催化的糖基转移反应合成（苏加坤，王机，姚评佳， 等.β-呋喃果糖苷转移酶的抑制及其在低聚果糖生产中的应用.化学与生物工程，2007， 24(5) :64-66)。前三种方法原料需求量大、能源消耗较高，且F0S的得率较低。菌体液体深 层发酵法所生产出来的产品成分复杂，不仅要除去大量的菌丝体，蛋白质和无机盐等杂质， 而且还容易发生美拉德褐变，给后期的分离纯化带来诸多的困难，并且易使产品色度加深， 影响感官质量。而利用微生物及其相应的酶制备F0S不仅能够提高生产效率，还能够降低 生产成本，具有良好的发展前景。
[0004] β-咲喃果糖苷转移酶（β-Fructofuranosidase，简称β-FFase)是一种来自于 植物和微生物中的酶，以蔗糖为原料，由β-呋喃果糖苷转移酶β-进行果糖基转移反应而 合成蔗果低聚糖，蔗糖既是果糖的供应者也是接收者（刘冬梅，于淑娟，李国基，等.一种新 型的功能性低聚糖-蔗果低聚糖及其生产方法，食品工业，1998, 3 :14-16)。植物中的果糖 基转移酶催化活性很弱，产率低，且受到季节限制，而来自微生物的果糖基转移酶比植物的 催化活性高，可催化较高浓度的蔗糖进行转糖基反应，反应过程受杂菌污染的机会较少，使 用方便。
[0005] 但目前报道的生产菌株产量不高，其中β-的酶活低且不稳定（马歌丽，张学军， 靳丽.黑曲霉产β-呋喃果糖苷酶酶学性质研究.中国酿造，2009, 207 (6) :22-24)，因此筛 选出高产和稳定的菌株并分离纯化出其转移酶，是目前该行业的重要研究内容之一。
【发明内容】
[0006] 本发明目的在于提供一种黑曲霉在制备β-呋喃果糖苷转移酶中的应用，利用一 种黑曲霉，通过发酵培养制备粗酶液，进一步通过层析分离制备电泳纯呋喃果糖苷转 移酶。
[0007] 本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
[0008] -种黑曲霉在制备β-呋喃果糖苷转移酶中的应用，包括如下步骤：
[0009] (1)以体积百分比5%~10%的接种量，将处于对数期生长的黑曲霉F0S-0620的 菌悬液接种于发酵诱导培养基中，进行诱导发酵培养，将得到的培养液离心或过滤得菌泥， 用无菌水清洗后再离心或过滤，冷冻干燥，得到黑曲霉菌体；
[0010] (2)在上述黑曲霉菌体中加入提酶缓冲液，使黑曲霉F0S-0620菌体浓度为5mg/ mL~30mg/mL，加入蜗牛酶，混匀后进行菌体破壁，破壁后的菌液经离心后的上清液为 β-呋喃果糖苷转移酶粗酶液，经分离纯化，得到β-呋喃果糖苷转移酶。
[0011] 步骤⑴所述诱导发酵培养的条件为30°C~40°C，100r/min~200r/min摇床培 养，发酵时间为36h~72h。
[0012] 所述的发酵诱导培养基：按重量份计，蔗糖2~10份，酵母浸膏1~5份，玉米粉 1~5份，NaN030. 1~0. 5份，pH6. 0~7. 5,用蒸馈水定容至100份，灭菌后冷却即可。
[0013] 步骤（2)所述蜗牛酶的浓度为0· 2mg/mL~0· 8mg/mL。
[0014] 步骤（2)所述提酶缓冲液中含有胰蛋白酶抑制剂和二硫苏糖醇，其浓度分别为 1yg/mL~3μg/mL和 0· 5μmol/ml,~2. 0μmol/mL〇
[0015] 所述β-呋喃果糖苷转移酶粗酶液分离纯化的步骤如下：所述粗酶液经过高流速 离子型琼脂糖凝胶（DEAESepharoseFastFlow)阴离子交换层析柱和苯基-琼脂糖凝胶 (PhenylSepharoseCL-4B)疏水亲和层析柱中的一种或两种层析，制得β-咲喃果糖苷转 移酶。
[0016] 所述阴离子交换层析是将粗酶液上样至阴离子交换层析柱上，先用不含NaCl的 Tris-HCl缓冲液将层析柱洗至基线，再用含OmM~300mM的NaCl的Tris-HCl缓冲液进行 NaCl梯度洗脱，分部收集，测定每个洗脱峰的β-呋喃果糖苷转移酶酶活，合并具有β-呋 喃果糖苷转移酶的组分，透析除盐后用聚乙二醇20000浓缩；
[0017] 所述疏水亲和层析是经阴离子交换层析后所得的β-呋喃果糖苷转移酶组分上 样至疏水亲和层析柱上，先用含（NH4)2S04S25 %的Tris-HCl缓冲液将层析柱洗至基线， 再用含〇%~25% (NH4)#04的Tris-HCl缓冲液进行从高浓度到低浓度的梯度洗脱，分部 收集，测定每个洗脱峰的呋喃果糖苷转移酶酶活，合并具有呋喃果糖苷转移酶的组 分，透析除盐并用聚乙二醇20000浓缩。
[0018] 所述Tris-HCl缓冲液的浓度为20mM~lOOmM，pH为7. 0~7. 5 ;
[0019] 所述阴离子交换层析和疏水亲和层析中洗脱的流速分别为lmL/min和0. 5mL/ min〇
[0020] 步骤⑴所述清洗和离心或过滤的操作至少重复1次；步骤⑵所述菌体破壁时 间为2h~5h，破壁温度为30°C~40°C。
[0021] 所得电泳纯β-呋喃果糖苷转移酶可用于制备蔗果低聚糖（F0S)，温度为20°C~ 60 °C，pH为5. 0~8. 0。优选地，所述β-呋喃果糖苷转移酶用于制备F0S的温度为33 °C， pH为 6. 5。
[0022] 本发明与现有技术相比，具有如下优点：
[0023] (1)本发明中使用的黑曲霉F0S-0620进行急性毒理实验证明是食用安全的，其发 酵产酶稳定，培养基来源广泛，发酵生产成本低，具有良好的商业前景。
[0024] (2)利用本发明方法的黑曲霉F0S-0620,得到的β-呋喃果糖苷转移酶活力高，例 如以200g/L的蔗糖为底物测定酶液的酶活，其最大酶活达到16. 95U/mg。
[0025] (3)所制备的β-呋喃果糖苷转移酶活力高，β-呋喃果糖苷转移酶制备蔗果低聚 糖的条件简单，最适酶作用温度为33°C，在20°C~60°C酶活稳定性较好，在60°C保温30min仍有50%的酶活性，具备较好的高温耐受性；该酶的最适pH为6. 5,在pH5. 0~8. 0内具有 较好的酶活稳定性。本发明所公开的条件可使β-呋喃果糖苷转移酶的酶活损失少，得到 的β-呋喃果糖苷转移酶纯度高，增加了工业用耐高温果糖苷转移酶的种类。
[0026] (4)本发明方法制备的β-呋喃果糖苷转移酶纯度高，用来制备固定化酶后，可以 多次重复使用，提高了使用率。
[0027] (5)本发明方法制备的β-呋喃果糖苷转移酶加入到F0S的转化体系中，所得的 F0S糖液不需要经过脱色，不需要经过离子交换柱脱盐，只需要经过简单的过滤，浓缩后即 可得到固形物中的总低聚糖的含量多50 %的F0S糖浆，符合GB/T23528-2009低聚果糖中的 非强制性国家标准，整个工艺简单，操作方便，生产成本明显降低。
[0028] 本发明所述黑曲霉是黑曲霉（Aspergillusniger)F0S-0620,已于2012年9月 28日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市 朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No. 6640。该菌株已经在专利CN103045489A中公开，属于现有技术。
【附图说明】
[0029] 图1为实施例1中黑曲霉F0S-0620的β-呋喃果糖苷转移酶粗酶液用阴离子交 换层析柱（DEAESepharoseFastFlow)分离后的蛋白质曲线图（其中第3个峰有β-咲 喃果糖苷转移酶活性）。
[0030] 图2为实施例1中黑曲霉F0S-0620粗酶液经阴离子柱分离后第3个峰的蛋白质用 疏水亲和层析（PhenylSepharoseCL-4B)分离后的蛋白质曲线图（其中第3个峰有β-咲 喃果糖苷转移酶活性）。
[0031] 图3为实施例1中β-