一种酶制剂，制备方法及其在降解苏丹红上的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种酶制剂及其制备方法，并将其酶制剂应用于降解苏丹红上，属于 生物工程和环境污染物处理领域。
【背景技术】
[0002] 苏丹红是一种亲脂性偶氮类化学染色剂（非食品添加剂），主要用于油彩、机油、 蜡和鞋油等产品的染色，在食品中非天然存在，主要包括I、II、III和IV四种类型。该类物 质具有致突变性和致癌性，对人体的肝肾器官具有明显的毒性作用，在我国禁止使用于食 品中。因此，环境中的苏丹红的存在直接影响人类身体健康。目前报道苏丹红的研究主要 集中在食品中苏丹红含量的分析与检测方面，而对环境中苏丹红的降解方法研究较少，相 关报道为Ti02光催化降解和一种锐顶镰孢菌的微生物降解。因此，研究环境中苏丹红的降 解具有重要的现实意义。
[0003]
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种降解苏丹红I，II，III，IV的微生物酶制剂及其制备 方法，该方法具有工艺简单、适合大规模工业化生产等特点，制备的酶制剂催化活性高、酶 活稳定，存储运输方便。
[0005] 本发明的一种降解苏丹红I，II，III，IV的酶制剂的制备方法，包括：
[0006] (1)将微生物菌种置于斜面培养基活化后置于无菌操作环境下，用接种针划取 0. 5cmX0. 5cm的菌块接种于预先设有种子培养基的摇瓶中，置于转速为120r/min的恒温 振荡器中，在28°C下恒温培养4天，得到种子液；
[0007] (2)将种子液转入含有发酵培养基的摇瓶中，在转速为120r/min的丨旦温振荡器 中，28°C下恒温培养7天；将培养好的发酵液离心lOmin收集菌丝体；
[0008] (3)用50mM磷酸缓冲液清洗菌丝体后再在液氮下研磨至均一粉末，收集菌丝体粉 末，加入50mM磷酸缓冲液，置于lOOOOrpm冷冻离心机中4°C离心lOmin后取上清液即为粗 酶液；然后在上清液中加入硫酸铵至终浓度为40%wt，在4°C下放置24h后置于lOOOOrpm 冷冻离心机中4°C离心lOmin，所得沉淀即为酶制剂。
[0009] 所述步骤（1)中的微生物为单色云芝（Coriolusunicolor)。
[0010] 所述步骤（1)中的斜面培养基为马铃薯琼脂培养基（PDA)，即将200g/L的去皮土 豆浆液与20g/L的葡萄糖和20g/L琼脂经热溶混匀制得，pH自然。
[0011] 所述步骤⑴中的种子培养基为马铃薯液体培养基（PDB)，即将200g/L的去皮土 豆浆液与20g/L的葡萄糖经混合后制得，pH自然。
[0012] 所述步骤（2)中的发酵培养基为马铃薯基础培养基（SPM)，即将200g/L的去皮土 豆浆液与20g/L的葡萄糖，3g/LΚΗ2Ρ04,1. 5g/LMgS04 · 7H20和微量维生素B1经混合后制 得，pH6. 0。
[0013] 所述步骤（3)中的菌丝体与磷酸缓冲液的添加比例为，菌丝体湿重/溶液体积= 1/1. 5〇
[0014] 所述步骤（3)中酶制剂分子量范围经SDS-PAGE分析为50-85KD，该酶制剂中还包 括分子量为55KD的多酚氧化酶。
[0015] 本发明将上述的微生物单色云芝（Coriolusunicolor)应用于降解苏丹红I、苏 丹红II、苏丹红III、苏丹红IV中的一种或多种上。
[0016] 更进一步，本发明将上述的酶制剂应用于降解苏丹红I、苏丹红II、苏丹红III、 苏丹红IV中的一种或多种上。对苏丹红I、苏丹红II、苏丹红III、苏丹红IV的降解率为 83% -91 %，可应用于环境染料污染物治理领域。
【附图说明】
[0017] 图1 :苏丹红I、苏丹红II、苏丹红III和苏丹红IV标准品色谱图。
[0018] 图2 :硫酸铵分级沉淀部位SDS-PAGE图。
【具体实施方式】
[0019] 下述试验和实施例用于进一步说明但不限于本发明。一种酶制剂，制备方法及其 在降解苏丹红上的应用，实施过程如下：
[0020] 实施例1
[0021] 本发明的酶制剂，可以从微生物单色云芝（Coriolusunicolor)发酵后的菌丝体 中获得。具体步骤如下：
[0022] 1.种子培养
[0023] (1)配置种子培养基：将200g去皮土豆切成小块，加适量水煮沸30min，用纱布过 滤，滤液中加入葡萄糖20g，自来水定容1L，平均分装于10个250mL的锥形瓶中（约lOOmL/1 个锥形瓶），在121°C下灭菌20min。
[0024] (2)种子培养：将单色云芝（Coriolusunicolor)菌种置于斜面培养基活化后置 于无菌操作环境下，用接种针划取0. 5cmX0. 5cm的菌块接种于预先设有种子培养基的摇 瓶中，置于转速为120r/min的恒温振荡器中，在28°C下恒温培养4天，得到种子液。
[0025] 2.发酵培养
[0026] (1)配置发酵培养基：将800g去皮土豆切成小块，加适量水煮沸30min，用纱布过 滤，滤液中加入葡萄糖80g，自来水定容4L，平均分装于20个500mL的锥形瓶中（约200mL/l 个锥形瓶），在121°C下灭菌20min。
[0027] (2)发酵培养：将种子液在无菌操作环境下接种于发酵培养基中，置于转速为 120r/min的恒温振荡器上，在28°C下恒温培养7天。
[0028] 3.酶制剂制备
[0029] (1)通过离心收集菌丝体200g(湿重），用50mM磷酸缓冲液清洗菌丝体后再在液 氮下研磨至均一粉末，收集菌丝体粉末，加入50mM磷酸缓冲液300mL，置于lOOOOrpm冷冻离 心机中4°C离心lOmin后取上清液即为粗酶液。
[0030] (2)往上清液中加入硫酸铵至终浓度为40 %wt，在4°C下放置24h后置于 lOOOOrpm冷冻离心机中4°C离心10min，所得沉淀即为酶制剂。
[0031] 实施例2
[0032] 本发明的酶制剂，用于降解苏丹红I、苏丹红II、苏丹红III、苏丹红IV中的一种或 多种上。具体步骤如下：
[0033] (1)取上述酶制剂600mg，溶于50mL50mM磷酸缓冲液。取0. 5mL酶液，用50mM磷 酸缓冲液稀释至lmL，分别取0. 2mL加入到苏丹红I、II、III、IV溶液中，溶液中苏丹红I、 II、III、IV最终浓度为10μg/mL，反应液体积2mL。
[0034] (2)反应液置于30°C振荡器上恒温孵化2天，HPLC检测反应液中苏丹红I、II、 III、IV终浓度。
[0035] (3)根据反应液中最终苏丹红质量，计算苏丹红降解率。
[0036] 图1为苏丹红I、苏丹红II、苏丹红III和苏丹红IV标准品色谱图。分析条件：分 析色谱柱YMC-Pack0DS-A-HG(5μm，4. 6X250mm)，流速lmL/min，流动相为色谱级甲醇。分 析仪器：DI0NEXUltimate3000高效液相色谱仪，检测波长478nm。
[0037] 图2为来源于单色云芝（Coriolusunicolor)菌丝体的粗酶液经硫酸铵40%、 60%、80%和90%分级沉淀后获得的蛋白质沉淀物经SDS-PAGE凝胶电泳和考马斯亮蓝成 像，可见40%部分显示出分子量大小为55KD的主条带，40%沉淀部位具有较强的多酚氧化 酶催化活性，且蛋白质质量分布范围为50-85KD。
[0038] 表1 :酶制剂对苏丹红I、II、III、IV的降解率
[0039]
【主权项】
1. 一种酶制剂，其特征在于，该酶制剂包含分子量为50-85KD的蛋白酶。2. 权利要求1所述的酶制剂，其特征在于，所述的分子量为50-85KD的蛋白酶中包括多 酚氧化酶，所述的多酚氧化酶为分子量为55KD的蛋白酶。3. 权利要求1或2所述的酶制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 将微生物菌种置于斜面培养基活化后置于无菌操作环境下，用接种针划取0. 5 cmXO. 5cm的菌块接种于预先设有种子培养基的摇瓶中，置于转速为120r/min的恒温振 荡器中，在28 °C下恒温培养4天，得到种子液； (2) 将种子液转入含有发酵培养基的摇瓶中，在转速为120r/min的丨旦温振荡器中，28 °C下恒温培养7天；将培养好的发酵液离心10min收集菌丝体； (3) 用50mM磷酸缓冲液清洗菌丝体后再在液氮下研磨至均一粉末，收集菌丝体粉末， 加入50mM磷酸缓冲液，置于10000rpm冷冻离心机中4 °C离心10min后取上清液即 为粗酶液；然后在上清液中加入硫酸铵至终浓度为40%wt，在4 °C下放置24h后置于 10000rpm冷冻离心机中4 °C离心10min，所得沉淀即为酶制剂。4. 权利要求3所述的酶制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（1)中的微生物菌种 %争色1云芝SCoriolus unicolor、。5. 权利要求3所述的酶制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（1)中的斜面培养基 为马铃薯琼脂培养基（PDA)，即将200g/L的去皮土豆浆液与20g/L的葡萄糖和20g/L琼 脂经热溶混匀制得，pH自然。6. 权利要求3所述的酶制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（1)中的种子培养基 为马铃薯液体培养基（PDB)，即将200g/L的去皮土豆浆液与20g/L的葡萄糖经混合后制 得，pH自然。7. 权利要求3所述的酶制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（2)中的发酵培养 基为马铃薯基础培养基（SPM)，即将200g/L的去皮土豆浆液与20g/L的葡萄糖，3g/L KH2P04,L5g/LMgS04 · 7H20和微量维生素B1经混合后制得，pH6. 0。8. 权利要求3所述的酶制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（3)中的菌丝体与磷酸 缓冲液的添加体积比为，菌丝体湿重/磷酸缓冲液=1/1. 5。9. 权利要求4所述的微生物菌种单色云芝在降解苏丹红I、苏丹红II、苏丹红III、苏 丹红IV中的一种或多种上的应用。10. 权利要求1-8任一项所述的酶制剂在降解苏丹红I、苏丹红II、苏丹红III、苏丹红 IV中的一种或多种上的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种降解苏丹红I,？II,？III,？IV的酶制剂及其制备方法。包括如下步骤：（1）将单色云芝菌株由斜面培养基转接入种子液中培养，然后转入装有基础液体培养基的三角瓶中，振荡培养，发酵液经过滤得到菌丝体，菌丝体用磷酸缓冲液洗涤多次，随后收集菌丝体，低温保藏备用；（2）菌丝体加入液氮后研磨成均一粉末，加入磷酸缓冲液，离心后取上清液；（3）将上述粗酶液采用40%硫酸铵沉淀，离心得沉淀即为酶制品。本发明的产品酶制剂为天然来源的产物，具有工艺简单、适合大规模工业化生产等特点，制备的酶制剂可以有效降解苏丹红I,？II,？III,？IV染料，具有降解效率高，降解周期短，降解后的溶液成分简单等特点，具有良好的应用前景。
【IPC分类】C12R1/645, C12N9/02, A62D3/02, A62D101/28
【公开号】CN105274066
【申请号】CN201510611552
【发明人】邓张双, 周金山, 陈良立, 施亚群
【申请人】三峡大学
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年12月2日