一种双功能谷胱甘肽合成酶的纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种双功能谷胱甘肽合成酶的纯化方法，特别涉及一种大规模纯化双功能谷胱甘肽合成酶的纯化方法。
【背景技术】
[0002]谷胱甘肽广泛存在于动植物和微生物中，是生物体内最重要的非蛋白巯基化合物之一，具有还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)，生物体内大量存在并起主要作用的是GSH，广泛用于治疗肝脏疾病、肿瘤、氧中毒、衰老和内分泌疾病，并作为生物活性添加剂及抗氧化剂用于食品领域。
[0003]GSH由谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)经肽键缩合而成的三肽。相对分子质量为307.32，等电点为5.93，常温下为白色晶体，易溶于水、低浓度乙醇水溶液、液氨和二甲基甲酰胺。
[0004]经典的酶法生产GSH依赖于γ -谷氨酰半胱氨酸合成酶(Gsh I)和谷胱甘肽合成酶(Gsh II)两种酶，Gsh I催化L-谷氨酸和L-半胱氨酸合成γ -谷氨酰半胱氨酸，Gsh II催化γ_谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸合成GSH。在GSH合成过程中，由于Gsh I催化过程受到终产物GSH的反馈抑制，因此使生成γ -谷氨酰半胱氨酸的第一步反应成为整个GSH合成的限速步骤。
[0005]随着进一步研究，人们在单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)等十几种细菌中都发现了一种双功能谷胱甘肽合成酶(GshF)。该酶同时具有Gsh I与Gsh II的活性，可一步催化GSH合成，且该酶反馈抑制作用较小，非常适和应用于酶法合成谷胱甘肽。
[0006]利用双功能谷胱甘肽合成酶(GshF)高效率合成GSH，首先需要得到纯度较高的GshF ο为了得到较高纯化的酶，一般需要用到离子交换层析、凝胶层析等方法，而此类方法耗时长，成本高并且酶的回收率低，不适用于工业化大规模生产GshF。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是提供一种双功能谷胱甘肽合成酶的纯化方法，其克服了现有技术的上述缺陷。
[0008]本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的:
[0009]—种双功能谷胱甘肽合成酶的纯化方法，包括以下步骤:
[0010](1)制备含双功能谷胱甘肽合成酶的粗提液。
[0011](2)向粗提液中加入浓度为0.001M-0.5M(优选的为0.005M-0.2M)的二价金属离子，去除沉淀(该沉淀主要为杂蛋白)，得上清液。
[0012](3)将上清液的pH值调节至4-9，再加入浓度为0.005M-0.4M (优选的为0.005M-0.2M)的二价金属离子铜离子(Cu2+)、锰离子(Mn2+)或锌离子(Zn2+)的一种或几种，收集沉淀，该沉淀即为双功能谷胱甘肽合成酶。
[0013]优选地，上述技术方案中，粗提液的制备方法为:将含双功能谷胱甘肽合成酶的菌体溶于水中进行破碎处理，破碎后进行初沉淀，去除沉淀，得到含双功能谷胱甘肽合成酶的粗提液。初沉淀过程中可去除大量细胞碎片及杂蛋白。
[0014]优选地，上述技术方案中，初沉淀的方法为酸碱沉淀或饱和度2-30 %硫酸铵沉淀。
[0015]优选地，上述技术方案中，酸碱沉淀的方法为先将粗酶液的pH值调至7-9后，再调节pH值至3-7，去除沉淀；或先将粗酶液的pH值调至3-7后，再调节pH值至7_9，去除沉淀。
[0016]优选地，上述技术方案中，所述酸选自于盐酸、磷酸、硫酸或醋酸的一种或几种，所述碱选自于氢氧化钾、氢氧化钠、氨水、Tris或三乙醇胺的一种或几种。
[0017]优选地，上述技术方案中，步骤(1)的破碎处理为高压均质破碎、酶解破碎、冷冻破碎或超声破碎。
[0018]优选地，上述技术方案中，步骤⑵中的二价金属离子选自于钙离子(Ca2+)、镁离子(Mg2+)、铁离子(Fe2+)、钴离子(Co2+)、镉离子(Cd2+)或镍离子(Ni2+)的一种或几种。
[0019]优选地，上述技术方案中，步骤(2)和步骤(3)中的二价金属离子均选自于可溶性盐或可溶性盐的水合物中的一种或几种。
[0020]优选地，上述技术方案中，可溶性盐为硫酸盐、磷酸盐、醋酸盐、硝酸盐或氯化盐。
[0021]优选地，上述技术方案中，步骤⑴至步骤(3)的操作温度为4°C -40°C。
[0022]本发明上述技术方案，具有如下有益效果:
[0023]本发明的双功能谷胱甘肽合成酶的纯化方法，与传统的使用超滤、离子交换层析、凝胶筛层析等方法提纯同样量的蛋白相比，其更加简单，易于操作，耗时短、成本低，且该方法制备的GshF不溶于水，可重复使用，更加适用于工业化大规模生产GshF。
【附图说明】
[0024]图1为根据本发明的一种双功能谷胱甘肽合成酶的纯化方法的各步骤流程图。
[0025]图2为根据本发明的一种双功能谷胱甘肽合成酶的纯化方法的各步骤电泳图。
【具体实施方式】
[0026]下面结合附图对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。
[0027]本发明的双功能谷胱甘肽合成酶的纯化方法请参见图1的各步骤流程图。其纯化结果可参见图2的各步骤电泳图。
[0028]实施例1
[0029](1)取含有GshF酶的菌体溶于水中，菌体浓度约为100g/L，高压均质破碎。
[0030](2)使用盐酸调节破碎后酶液的pH值至5.0，25°C放置30分钟后，再使用氢氧化钠将酶液pH值调至7.0，离心去除沉淀。
[0031](3)在酶液中加入0.05M氯化钙，4-10°C放置30分钟后，离心除去沉淀杂质；
[0032](4)最后调节pH值至6.0，再加入0.02M氯化铜、0.01M氯化锰及0.02M硫酸锌，4-10°C放置30分钟后，离心收集沉淀，即为GshF酶。
[0033]将少量纯化后的固体GshF酶溶解，配成lmg/ml的溶液，使用现有技术记载的公知的测定GshF酶活性的方法，检测到GshF酶活性约为300U，其中将1 μ Μ底物在1分钟内完全转化定义为1个活性单位(U)。
[0034]实施例2
[0035](1)取含有GshF酶的菌体溶于水中，菌体浓度约为100g/L，高压均质破碎。
[0036](2)使用盐酸调节破碎后酶液的pH值至3.0，4°C放置30分钟后，再使用氢氧化钠将酶液pH值调至7.0，离心去除沉淀。
[0037](3)在酶液中加入0.001M氯化钙及0.001M氯化亚铁，4°C放置30分钟后，离心除去沉淀杂质；
[0038](4)最后调节pH值至4.0，再加入0.005M氯化铜、0.005M氯化锰及0.4M硫酸锌，4°C放置30分钟后，离心收集沉淀，即为GshF酶。
[0039]将少量固体GshF酶溶解，配成lmg/ml的溶液，使用现有技术记载的公知的测定GshF酶活性的方法，检测到GshF酶活性约为80U，其中将1 μ Μ底物在1分钟内完全转化定义为1个活性单位(U)。
[0040]实施例3
[0041](1)取含有GshF酶的菌体溶于水中，菌体浓度约为100g/L，高压均质破碎。
[0042](2)使用氨水调节破碎后酶液的pH值至9.0，40°C放置10分钟后，再使用磷酸将酶液pH值调至5.0，离心去除沉淀。
[0043](3)在酶液中加入0.5M氯化镁，40°C放置10分钟后，离心除去沉淀杂质；
[0044](4)最后调节pH值至9.0，再加入0.4M氯化铜及0.005M氯化猛，40°C放置10分钟后，离心收集沉淀，即为GshF酶。
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