一种体外酶法生产谷胱甘肽的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化工领域，特别设及一种体外酶法生产谷脫甘肤的方法。
【背景技术】
[0002] 谷脫甘肤是一种具有多种生物学功能的化合物，由k半脫氨酸，k谷氨酸和甘氨 酸=种氨基酸通过肤键缩合得到。它不仅能清除体内自由基，还具有保护肝脏，提高机体免 疫力的作用，因此谷脫甘肤被广泛应用于生物医药和食品领域，国内外医药市场对谷脫甘 肤的需求也日趋增长。
[0003]截止日前，工业生产谷脫甘肤的方法主要有发酵法，酶催化合成法，化学合成法W及生物萃取法四种。发酵法的工艺过程中产品分离W及后处理比较麻烦，化学合成法成本 高、操作复杂、反应过程繁琐，萃取法产量太低，而酶法相比其他几种方法具有反应过程可 控性强、催化反应专一性强W及后期处理简单等优点。
[0004] 酶法生产谷脫甘肤是通过在反应体系中添加少量S憐酸腺巧（ATP)，在k半脫氨 酸，k谷氨酸和甘氨酸S种氨基酸S种氨基酸底物的条件下，利用r-谷氨酷半脫氨酸合成 酶和谷脫甘肤合成酶两种合成谷脫甘肤的关键酶催化来合成谷脫甘肤。运两种酶分别催化 生成谷脫甘肤过程中的两步反应。
[0005]现在很多研究中使用谷脫甘肤合成双功能酶来催化产生谷脫甘肤，谷脫甘肤合成 双功能酶是兼具r-谷氨酷半脫氨酸合成酶和谷脫甘肤合成酶两种催化位点的酶。并使用 多聚憐酸激酶在底物多聚憐酸盐和ADP的条件下，催化ATP再生，使生成谷脫甘肤的反应成 本降低。但是已报道的W生产谷脫甘肤为目的所应用的谷脫甘肤合成双功能酶都存在明显 的产物抑制效应，进而导致产物产量很难提高。运样既不易于工业生产时对产物的后期分 离，又不能很好的满足市场需求。
[0006]本研究方法提供了一种通过利用化Steurellamultocida来源的谷脫甘肤合成双 功能酶生产谷脫甘肤的方法。Pasteurellamultocida来源运种谷脫甘肤合成双功能酶的 产物抑制作用弱，Km值大，适合在较高的氨基酸底物浓度条件下，高产量的生产谷脫甘肤。
[0007]本研究方法提供了一种利用谷氨酸棒状杆菌来源的聚憐酸激酶利用六偏憐酸盐 为底物，用于催化再生ATP.谷氨酸棒状杆菌来源的聚憐酸激酶利用的六偏憐酸盐比较常 见易得，用六偏憐酸盐作为憐酸供体，方便了ATP再生过程。
[000引与公知技术相比，本发明具有W下优点：
[0009] (1)本发明利用的谷脫甘肤合成双功能酶产物抑制效应弱，利于提高谷脫甘肤的 产量。
[0010] (2)使用聚憐酸激酶W常见的四聚憐酸、六偏憐酸盐为憐酸供体为体系源源不断 的提供ATP，降低生产成本。
[0011] (3)采用充氮气无氧振荡反应方式，防止生成的谷脫甘肤氧化，保存产物中的谷脫 甘肤，提高谷脫甘肤产量。
[0012] (4)本发明中的底物比例低至Gly:Gys:Gly= (1-3) :1: (1-3)，体系中剩余氨基酸 减少，易于产物分离。
【发明内容】
[0013] 本发明的目的在于提供一种异源表达的谷脫甘肤合成双功能酶和聚憐酸激酶，W 高浓度的谷氨酸、半脫氨酸和甘氨酸为底物，W六偏憐酸盐提供憐酸基团在聚憐酸激酶的 催化条件下生成ATP提供能量，最终产生高产量的谷脫甘肤。
[0014] 本发明首先构建基因工程菌，异源表达来自Pasteurellamultocida中的谷脫甘 肤合成双功能酶基因。即将基因GS克隆至原核表达载体祀T2化中得到谷脫甘肤合成双功 能酶基因表达载体，即重组质粒祀T2化-gs。同时我们也将来自谷氨酸棒状杆菌中的聚憐酸 激酶（PPK)基因克隆至原核表达载体祀T28a中，得到重组质粒祀T28a-卵k。然后将分别将 表达载体转入大肠杆菌化210E3)中，IPTG诱导表达，即可在胞内获得谷脫甘肤合成双功 能酶和聚憐酸激酶。
[0015] 经表达后，通过超声破碎将大肠杆菌中的谷脫甘肤合成双功能酶释放出来，获得 粗酶液。在六偏憐酸盐提供憐酸供体的条件下，W=种底物氨基酸为底物在粗酶液催化下 进行反应生成谷脫甘肤。为了防止反应时反应体系中的氧气使底物氨基酸或者谷脫甘肤发 生氧化进而降低谷脫甘肤的产量，实验采用充氮气无氧振荡反应方式，保存产物中的谷脫 甘肤，提高谷脫甘肤产量。为了进一步提高谷脫甘肤的产量并易于后期产物分离，本实验 在Gly:Gys:Gly= 2:1:2的比例条件下把底物浓度提高到200mM。
[0016] 本发明提供的方法，W能利用常见的六偏憐酸盐为底物的谷氨酸棒状杆菌来源的 聚憐酸激酶催化再生ATP，利用化Steurellamultocida来源的产物抑制作用比较低的谷 脫甘肤合成双功能酶，在底物氨基酸浓度较高的条件下生产谷脫甘肤。为高产量低成本地 生产谷脫甘肤提供了一种工业化路线。
【附图说明】 阳017] 图1 :DNA琼脂糖凝胶电泳。左侧为谷脫甘肤合成双功能酶基因gs的PCR产物，右 侧为DNA大小标准品。
[0018] 图2:构建好的表达载体祀T2化-gs，将gs基因克隆到祀T2化载体上，基因的两端 有NdeI和EcoRI酶切位点，其编号为质粒1。
[0019] 图3 :DNA琼脂糖凝胶电泳。左侧为多聚憐酸激酶基因卵k的PCR产物，右侧为DNA 大小标准品。
[0020] 图4 :祀T28a-ppk质粒图谱，将卵k基因克隆到祀T28a载体上，基因的两端有化O I和EcoRI酶切位点，其编号为质粒2。
[0021] 图5 :诱导表达谷脫甘肤合成双功能酶GS蛋白电泳图。泳道1为祀T2化空质粒 表达后破胞上清，泳道2为GS酶表达后破胞上清。
[0022] 图6:诱导表达多聚憐酸激酶PPK蛋白电泳图。泳道1为祀T28a空质粒表达后破 胞上清，泳道2为PPK酶表达后破胞上清。
[0023] 图7 :20mM反应体系有氧静置反应与充氮气无氧反应进程对比。
[0024] 图8:50mM反应体系中分别添加10mM、20mM、30mM、40mM、50mlATP时，各时段的转化 率对比。"IOhGS"为50mM反应体系中只加入了GS酶，仅靠外源添加的ATP提供能量，反应 I化后取样检测得到的转化率。"2化GS"为50mM反应体系中只加入了GS酶，仅靠外源添加 的ATP提供能量，反应IOh后取样检测得到的转化率。"1化GS+PPK"为50mM反应体系中加 入了GS酶和PPK酶，靠外源ATP和PPK酶重生的ATP提供能量，并在反应1化后取样检测 的转化率。"22hGS+PPK"为50mM反应体系中加入了GS酶和PPK酶，靠外源ATP和PPK酶 重生的ATP提供能量，并在反应2化后取样检测的转化率。
[00巧]图9 :不同浓度的四聚憐酸作为憐酸供体参与禪合反应，24h后用四氧喀晚法测得 的G甜转化率。
【具体实施方式】
[00%] 1、克隆己斯德菌（Pasteurellamultocida)菌株GS谷脫甘肤合成双功能酶基因 W及谷氨酸棒状杆菌中PPk多聚憐酸激酶基因。
[0027] 2、己斯德菌（Pasteurellamultocida)菌株GS谷脫甘肤合成双功能酶基因W及 谷氨酸棒状杆菌中PPk聚憐酸激酶基因重组载体构建。
[0028] 3、诱导表达谷脫甘肤合成双功能酶基因GSW及多聚憐酸激酶PPK。将构建好的重 组表达载体祀T2化-GS质粒转入大肠杆菌感受态细胞E.COli化21 0E3)，在IPTG作用下诱 导表达。
[0029] 4、超声破碎表达菌体，提取粗酶液进行反应。合成反应中的酶添加量采用考马斯 亮蓝测蛋白法进行标定。
[0030] 5、酶法合成谷脫甘肤。在TriS-HCl缓冲盐体系和辅因子Mg2+存在下，W谷氨酸、 甘氨酸和半脫氨酸为底物，六偏憐酸盐或四聚憐酸为憐酸供体，通过谷脫甘肤合成双功能 酶和多聚憐酸激酶合成谷脫甘肤。
[0031] 6、谷脫甘肤的检测。采用四氧喀晚法测定反应液中G甜的含量，在抑7. 2的缓冲 条件下，反应产物与四氧喀晚结合，20min后测定结合物在305nm下的吸光度值。由GSH标 准曲线计算出样品中GSH的含量。
[0032] 下面结合实施例对本发明具体方法进一步说明： 阳〇3引 实施例1
[0034] 1 Pasteurella皿Itocida菌株谷脫甘肤合成双功能酶基因gs的克隆W及重组载 体构建
[0035] 1. 1Pasteurellamultocida菌株GS基因的克隆
[0036] 利用全基因合成的方法合成化Steurellamultocida菌株中的谷脫甘肤合成双功 能酶GS基因DNA。W该基因DNA为模板，根据GenBank序列设计引物，并添加相应的酶切 位点（NdeI和EcoRI)与保护碱基。
[0037] PCR扩增谷脫甘肤合成双功能酶GS基因所用引物如下：
[0038] 上游引物：5，-GCATATGATGGCCAAGAAGGAC-3，
[0039]下游引物：5 ' -GCTCGAGTTACTTGGCGAG-3，
[0040] PCR体系反应体系含有0. 2yL基因组DNA，上下游引物各0. 5yLExtaq混合液 10yL加双蒸水补至20yL。反应条件为预变性94°C5min，变性94°C30s，退火55°C30s， 延伸72°CImin，循环30次，72°C10min，4°C保存。运样即可克隆扩增到目的谷脫甘肤合成 双功能酶GS基因，核酸电泳图见图1。
[0041] I. 2重组载体质粒I的构建
[0042] 将克隆的GS基因与祀T22b载体（购于Novagen公司）分别用内切酶NdeI和 EcoRI进行双酶化37°C酶切3h，载体与外源基因片段按摩尔比1:3的比例，利用肥B的 T4DNA连接酶16°C连接过夜，用该连接产物转化至大肠杆菌ToplO感受态细胞，涂布带有氨 节青霉素抗性LB琼脂平板，37°C过夜培养后，挑取单菌落，在LB液体培养基中过夜培养，并 进行菌落PCR验证。试剂盒提取质粒，进行质粒双酶切验证，测序结果正确后可获得阳性重 组载体。测定序列如序列1所示，该序列编码如序列2所示的氨基酸序列。所构建的重组 载体质粒1的图谱如图2所示。 阳0创实施例2
[0044] 1谷氨酸棒状杆菌菌株中PPk聚憐酸激酶基因的克隆与重组载体构建
[0045] 利用全基因合成的方法合成大肠杆菌菌株中PPk聚憐酸激酶基因。W该菌株全基 因为模板，根据GenBank序列设计引物，并添加相应的酶切位点（NcoI和EcoRI)与保 护碱基。
[0046] PCR扩增多聚憐酸激酶基因卵k所用引物如下：
阳〇47] 上游引物 W48]