一种肿瘤组织细胞原血红素定量检测试剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测试剂，具体地说是一种肿瘤组织细胞原血红素定量检测试剂 及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 渗出是局部组织器官内的液体和细胞成分进入组织间质、体腔、粘膜表面和体表 的过程。组织渗液中含有大量脱落细胞，还含有蛋白质、糖、甘油三脂、胆固醇和纤维蛋白原 破坏放出的凝血活酶。
[0003] 在抑癌基因P53发生突变的组织细胞中，失去了P53对糖代谢戊糖磷酸途径限 速酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的抑制，葡萄糖通过戊糖磷酸途径代谢，产生大量还原型辅酶 II(NADPH)。NADPH作为谷胱甘肽还原酶的辅酶，使氧化型谷胱甘肽（GSSG)还原成为还原 型谷胱甘肽（GSH)，细胞内GSH含量增高。谷胱甘肽过氧化物酶以还原型谷胱甘肽（GSH) 作为供氢体来分解H202，生成氧化型谷胱甘肽（GSSG)，使细胞内GSH:GSSG的比率下降。 GSH生成GSSG过程中形成细胞的低氧及还原性状态，激活氧感受器和缺氧信号传导通 路，导致蛋白质的巯基由氧化型向还原型转变，促使缺氧特异性转录因子-低氧诱导因子 (hypoxia-induciblefactor;HIF_la)的磷酸化并与HIF-lb结合而形成一个完整的HIF-1 转录复合体，与相应靶基因上的缺氧反应元件（HRE)结合，促进靶基因的表达。还通过第二 信使-活性氧族（R0S)与激酶系统发生联系，激活激酶系统。上述变化产生一种亲脂性物 质（Hydrophilicfattymolecules)进入肿瘤细胞血红素结合蛋白（HP蛋白）的疏水核内， 改变蛋白质a链⑶3His和0链⑶3Ser、E10Lys的极性量值，使位居其疏水核中的原血红 素脱落，成为肿瘤组织细胞原血红素，简称TCPH。这种肿瘤组织细胞原血红素是一种酶样物 质，具有过氧化物酶样作用。经过特定的氧化-还原反应使细胞内的酶染色，观察细胞酶的 显色情况即可测及肿瘤组织细胞原血红素。肿瘤性渗出组织渗液中的脱落肿瘤细胞可能含 有肿瘤组织细胞原血红素（Theprotohemeoftumorcells，TCPH)，而组织渗液中是否含有 肿瘤组织细胞原血红素对组织渗液性质的鉴定具有重要意义。
[0004] 经检索，目前尚无肿瘤组织细胞原血红素（TCPH)定量检测试剂。本发明试剂的检 测目的物是肿瘤组织细胞原血红素（Theprotohemeoftumorcells，TCPH)，这是一种新近 发现的恶性肿瘤组织细胞产生的生物因子。目前，本发明试剂是唯一能实现对该生物因子 的定量检测的试剂。近期已有《全自动肿瘤组织细胞原血红素检测分析仪》设计成功，苦无 配套试剂。为此，特设计了一种可供上述自动化分析仪器使用的肿瘤组织细胞原血红素定 量检测试剂。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种肿瘤组织细胞原血红素定量检测试剂。本发明制备的 试剂准确、方便、快速，以读取吸光度的方法、在全自动分析仪器上定量检测组织渗液中肿 瘤组织细胞原血红素（TCPH)的含量。
[0006] 本发明还提供了上述肿瘤组织细胞原血红素定量检测试剂的制备方法。
[0007] 本发明采用以下技术方案： 一种肿瘤组织细胞原血红素定量检测试剂，其特征在于，它是由试剂A和试剂B组 成；所述试剂A由0.3g/L~0.9g/L的3,3'，5,5' -四甲基联苯胺二盐酸、6g/L~24g/L的聚 乙烯吡咯烷酮K30、6ml/L~12ml/L的6-甲氧基喹啉、7. 98g/L~12. 33g/L的二甲基亚砜、 0. 01~0.lmol/LpH值为3. 2~6. 8磷酸盐缓冲液组成；所述试剂B为1%的过氧化氢溶液。
[0008] 所述试剂A与试剂B的体积比为1:1。
[0009] 作为本发明的一种优选，所述试剂A是由0.6g/L的3,3'，5,5'_四甲基联苯胺二 盐酸、12g/L的聚乙烯吡咯烷酮K30、10g/L的二甲基亚砜、8ml/L的6-甲氧基喹啉、0.lmol/ LpH值为5. 5的磷酸盐缓冲液组成。
[0010] 上述肿瘤组织细胞原血红素定量检测试剂的制备方法，它包括以下步骤： 1) 先将3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺二盐酸溶解于10ml二甲基亚砜中； 2) 配制磷酸盐缓冲液； 3) 取890ml步骤2)所制的缓冲液，将步骤1)所得溶液与其混合均匀； 4) 向步骤3)所得混合溶液中加入聚乙烯吡咯烷酮K30,充分搅拌使之完全溶解； 5) 向步骤4)所得混合溶液中加入6-甲氧基喹啉，并用步骤2)所制磷酸盐缓冲液定容 至1000ml，混合均匀即配制成试剂A; 6) 将试剂A与1%的过氧化氢溶液等体积混合后即得肿瘤组织细胞原血红素定量检测 试剂。
[0011] 本发明试剂的测试原理如下：肿瘤组织细胞原血红素是一种酶样物质，具有过氧 化物酶样作用，具备水解过氧化物的能力。肿瘤细胞原血红素与过氧化物反应，摘取过氧化 物的氧原子，并与氧原子结合形成氧化型肿瘤细胞原血红素；氧化型肿瘤细胞原血红素极 不稳定，迅即又脱掉氧原子传递给供氢体四甲基联苯胺，使原本不含发色集团的供氢体3， 3'，5, 5'-四甲基联苯胺脱氢，生成含发色集团醌基的蓝色物质联苯胺蓝。样本内若不含有 肿瘤组织细胞原血红素，则无联苯胺蓝生成，因之不显色；样本内若含有肿瘤组织细胞原血 红素，则有联苯胺蓝生成，反应液逐渐呈现蓝色。显色的深浅与样本内含有的肿瘤组织细胞 原血红素成正比。如此，测定反应液显色的吸光度即可测及样本内肿瘤组织细胞原血红素 的含量。
[0012] 本发明试剂的使用方法如下：使用本发明制备的定量检测原血红素分析试剂，在 全自动肿瘤组织细胞原血红素检测分析仪上进行测试。首先分析仪以试剂加样针自动在试 剂仓内吸取200yL本发明制备的试剂加入比色管中，再以样本加样针自动在样本瓶内吸 取200yL样本加入比色管中，37 °C温育使试剂与样本充分反应。在反应144秒的时间点上， 以光电比色法自动读取该样本与本发明制备的试剂反应后显色液的吸光度，以此吸光度值 通过仪器设定的标准曲线读取相对应的肿瘤组织细胞原血红素的含量值。
[0013] 本发明的有益效果是：本发明制备的试剂准确、方便、快速，以直接读数的定量方 法、在全自动分析仪器上批量检测组织渗液中肿瘤组织细胞原血红素（TCPH)的含量，其稳 定性好，该试剂在低温干燥环境下可以稳定保存2年；此外，它的准确度高，特异性强，检测 灵敏度也可达到10yg/L。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合具体实施例对本发明的内容做进一步的详细说明。
[0015] 实施例1 肿瘤组织细胞原血红素定量检测试剂的制备 1) 先将〇.3g的3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺二盐酸溶解于10ml二甲基亚砜中； 2) 配制pH为3. 2浓度为0. 05mol/L磷酸盐缓冲液； 3) 取890ml步骤2)所制的缓冲液，将步骤1)所得溶液与其混合均匀； 4) 向步骤3)所得混合溶液中加入6g聚乙烯吡咯烷酮K30,充分搅拌使之完全溶解； 5) 向步骤4)所得混合溶液中加入6-甲氧基喹啉6ml，并用步骤2)所制磷酸盐缓冲液 定容至1000ml，混合均勾即配制成试剂A; 6) 将试剂A与1%的过氧化氢溶液等体积混合后即得肿瘤组织细胞原血红素定量检测 试剂。
[0016] 实施例2 肿瘤组织