一种阿胶胶液半成品或成品中驴、牛源性成分的定量检测方法、组合物及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种阿胶胶液半成品及成品中驴、牛源性成分的定量检测方法、组合物及试剂盒，属于分子生物学技术领域，该方法为根据驴和牛看家基因单拷贝基因，设计驴和牛通用引物及驴和牛特异性探针，提取待测样品DNA，采用TaqMan qPCR的方法对阿胶胶液半成品或成品进行驴源或牛源成分定量检测，根据标准曲线和待测样本的Ct值计算阿胶胶液单位质量中驴和牛源核基因的拷贝数，计算出阿胶中驴源和牛源所占比例，进而对阿胶样品驴源或牛源成分定量，本发明的方法、组合物及试剂盒检测特异性好、灵敏度强、不仅实现阿胶中驴源和牛源定性检测，还可以实现定量分析，为阿胶企业质量把控提供技术推广和应用。
【专利说明】
一种阿胶胶液半成品或成品中驴、牛源性成分的定量检测方 法、组合物及试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及一种阿胶胶液及成品中动物源性成分定量检测方法，具体涉及一种阿 胶胶液半成品或成品中驴、牛源性成分的定量检测方法、组合物及试剂盒，属于分子生物学
技术领域。
【背景技术】
[0002] 阿胶为马科动物驴的皮，经煎煮、浓缩制成的固体胶，原产自山东省泛东阿区，始 载于《神农本草经》，与人参、鹿茸并称为"滋补三宝"，至今已有近三千年历史。阿胶补血圣 药，味甘平，入肺、肝、肾经，具有补血止血、滋阴润燥等功效，药食两用，长期服用可补血养 血、美白养颜、抗衰老、抗疲劳、提高免疫力，适用人群广泛。李时珍著《本草纲目》载："阿胶 《本经》上品。
[0003] 2015版《中国药典》明确规定阿胶为马科动物驴(Equus animus L.)的皮经去毛、 煎煮并佐以黄酒、豆油、冰糖熬制而成。然而随着胶类市场的不断发展，随着熬胶原料供应 的紧张和原料价格上涨，一些驴皮供应商拿廉价马皮、骡子皮甚至牛皮下脚料、猪皮冒充驴 皮，掺假手段高明，有的甚至将驴耳朵缝制马皮上等变成驴皮的特征来冒充驴皮，成为企业 原料质量把控的一大难题，或多或少会掺入牛皮等无意掺假现象在所难免，作为阿胶生产 企业更加迫切需要阿胶整个生产过程的质量把控，不让牛皮掺入阿胶中，生产纯正的驴皮 源阿胶，这就要求发展更加可行、灵敏的检测技术来满足阿胶生产企业及监管部门质量控 制与监管的需求。
[0004] 随着分子生物学技术的发展，一些基于DNA的生物学鉴定手段逐渐丰富起来，DNA 分子法主要是利用显示生物特征的各种生物物种所具有的不同DNA序列信息进行鉴别，它 可以突破依据感官检测的局限性，与传统分析方法相比，更加具有客观性和准确性。以聚合 酶链式反应(PCR)为基础的技术已逐步成为了食品药品中动物源性成分种属鉴定的核心方 法。近年来实时荧光PCR技术的飞速发展大大提高了检测的灵敏度、特异性和准确性，并使 得成分含量的定量溯源成为可能，由于荧光定量整个检测过程为闭管操作，所以有效的减 少了实验过程中的污染的危险，目前广泛应用于各个领域。
[0005] 近年来随着阿胶掺假现象不断被媒体曝光，逐渐引起科研工作者的重视，国内外 科研机构及阿胶企业开展了大量利用分子生物学技术手段鉴定驴皮、马皮真伪鉴定的科学 研究工作，专利授权号为(CN.104046700B)利用qPCR技术解决了快速鉴别驴皮、马皮、驴骡 及马骡皮的技术难题，专利(CN201510018058.3)公开了阿胶中驴、马、猪及牛源性多重实时 荧光PCR检测方法，专利(CN 201510403781.3)利用巢式PCR技术鉴别阿胶真伪，但都是针对 阿胶成品的真伪利用线粒体为靶基因进行定性检测，由于线粒体基因在所有的动物不同组 织细胞中拷贝数不同而不能量化，无法区分阿胶中是污染还是有意掺假，更不能知晓掺假 比例，因此，阿胶掺假量化研究十分必要。而基于DNA检测技术的阿胶中驴源和牛源成分量 化分析方法研究目前在国内外还尚未报道。
【发明内容】
[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供一种阿胶胶液半成品或成品中驴、牛源性成分 的定量检测方法、组合物及试剂盒，该方法、组合物及试剂盒检测特异性好、灵敏度强、不仅 实现阿胶中驴源和牛源定性检测，可以实现定量分析，为阿胶企业质量把控技术推广应用。
[0007] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：
[0008] 一种阿胶胶液半成品或成品中驴、牛源性成分的定量检测方法，根据驴和牛看家 基因单拷贝基因，设计引物及探针，提取待测样品DNA，采用TaqMan qPCR的方法对阿胶胶液 半成品或成品进行驴源或牛源成分定量检测，根据标准曲线和待测样本的Ct值计算阿胶胶 液单位质量中驴和牛源核基因的拷贝数，计算出阿胶中驴源和牛源所占比例，进而定量。
[0009] 本发明还具有以下附加技术特征：
[0010] 进一步的，采集阿胶胶液样本，根据阿胶现代加工工艺流程，在阿胶生产的不同阶 段化皮后和胶汁分离阶段取样200ml，利用专利CN. 201410317118阿胶DNA提取技术提取核 酸DNA。经实验证明阿胶在化皮后和胶汁分离阶段所提取的核酸DNA完整性好。利用基因信 息学技术寻找驴和牛的单拷贝基因，设计特异引物及特异性探针，采用TaqMan qPCR的方法 对阿胶中进行驴源和牛源成分定量检测，根据标准曲线和待测样本的Ct值计算阿胶单位体 积中驴和牛源核基因的拷贝数，推算出阿胶中驴源和牛源所占比例，进而达到定量的目的。 [0011]优选的，所述待测样品为阿胶生产过程中化皮和胶汁分离阶段的样品。
[0012]优选的，所述看家基因为驴和牛的特征基因 LHB基因。
[0013]优选的，包括以下引物、探针，序列分别如下：
[0014] (1)驴特异引物：
[0015] 上游引物LVF: 5 ' -TGGACCCCATGGTCTCCTTC-3 '，如SEQ N0 · 1所示；
[0016] 下游引物LVR: 5 ' -CAGGAGTTGGGGTGGATGTG-3 '，如SEQ N0 · 2所示；
[0017] (2)驴特异探针：
[0018] Equus asinus-Probe: 5，-CGGGGGTCCCAGAGACCACC-3，，如SEQ N0 · 3所示；
[0019] ⑶牛特异引物：
[0020] NF: 5，-CTTTGCTGGGTTTGGTTCCG-3，，如SEQ N0 · 4所示；
[0021 ] NR: 5，-CAGCGGCCAAAGCCTAAATC-3，，如SEQ N0 · 5所示；
[0022] (4)牛特异探针：
[0023] Bovine-Probe: 5，-CGGGTGTGGGGCAGGTGG-3，，如SEQ N0· 6所示；
[0024] 其中，所述驴、牛特异性探针的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，所述 报告基团为FAM、HEX、TAMRA、R0X、CY5中的任一种，所述淬灭基团为Dab cy 1、BHQ1、BHQ2中的 任一种。
[0025]优选的，驴特异探针：
[0026] Equus asinus-Probe:5'FAM-CGGGGGTCCCAGAGACCACC-BHQ2 3,，如SEQ N0.3所示； [0027] 牛特异探针：
[0028] Bovine-Probe: 5，J0E-CGGGTGTGGGGCAGGTGG-BHQ2-3，，如SEQ N0 · 3所示。
[0029] 优选的，所述提取阿胶样品DNA为使用专利号为CN. 201410317118.7的专利公开的 方法提取。
[0030] 优选的，所述标准曲线的制作具体为:将驴和牛的目标靶基因分别克隆到PMD18-T 载体中，通过测序筛选阳性克隆，分别取已知浓度的驴、牛阳性克隆质粒作为标准样，按照 10倍体积梯度稀释作为标准模板，标准模板与待测样品DNA同时进行定量PCR扩增，反应结 束后，根据各个浓度梯度的Ct值和浓度值绘制荧光定量PCR标准曲线；
[0031] 其中驴目标靶基因序列为：
[0033]其中牛目标靶基因序列为：
[0035] 优选的，所述PCR扩增体系为:含TaqMan reaction Μ?χ(2χ)10μ1，驴特异探针0.25 μΜ，牛特异探针0.4μΜ，驴特异性正反向引物LVF/LVR 0.8μΜ，牛特异性正反向引物NF/NR 0.8yM，R0X参比荧光（50 X )0.4μ1，待测样本总DNA2yl，用双蒸水补足20μ1反应体系；所述 PCR扩增条件为:95 °C lOmin; 95 °C 10s，63 °C，35s，在此收集荧光信号，45个循环。
[0036] 优选的，所述PCR扩增阶段反应需在至少2通道型号的荧光定量PCR仪上进行。
[0037] 本发明另提供一种阿胶胶液半成品或成品中驴、牛源性成分的定量检测引物、探 针组合物，包括以下引物、探针：
[0038] (1)驴特异引物：
[0039] 上游引物LVF: 5 ' -TGGACCCCATGGTCTCCTTC-3 '，如SEQ N0 · 1所示；
[0040] 下游引物LVR: 5 ' -CAGGAGTTGGGGTGGATGTG-3 '，如SEQ N0 · 2所示；
[0041 ] (2)驴特异探针：
[0042] Equus asinus-Probe: 5，-CGGGGGTCCCAGAGACCACC-3，，如SEQ N0 · 3所示；
[0043] (3)牛特异引物：
[0044] NF: 5 ' -CTTTGCTGGGTTTGGTTCCG-3 '，如SEQ N0 · 4所示；
[0045] NR: 5，-CAGCGGCCAAAGCCTAAATC-3，，如SEQ N0 · 5所示；
[0046] (4)牛特异探针：
[0047] Bovine-Probe: 5，-CGGGTGTGGGGCAGGTGG-3，，如SEQ N0 · 6所示；
[0048] 其中，所述驴、牛特异性探针的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，所述 报告基团为FAM、HEX、TAMRA、R0X、CY5中的任一种，所述淬灭基团为Dab cy 1、BHQ1、BHQ2中的 任一种。
[0049] 优选的，驴特异探针：
[0050] Equus asinus-Probe:5'FAM-CGGGGGTCCCAGAGACCACC-BHQ2 3,，如SEQ N0.3所示；
[0051 ] 牛特异探针：
[0052] Bovine-Probe:5,J0E-CGGGTGTGGGGCAGGTGG-BHQ2-3,，如SEQ N0.3所示。
[0053] 本发明还一种阿胶胶液半成品或成品中驴、牛源性成分的定量检测试剂盒，包括 上述引物、探针组合物以及荧光PCR反应所需试剂。
[0054] 优选的，所述PCR扩增体系为:含TaqMan reaction Μ?χ(2χ)10μ1，驴特异探针0.25 μΜ，牛特异探针0.4μΜ，驴特异性正反向引物LVF/LVR 0.8μΜ，牛特异性正反向引物NF/NR 0.8yM，R0X参比荧光（50 X )0.4μ1，待测样本总DNA2yl，用双蒸水补足20μ1反应体系；所述 PCR扩增条件为:95 °C lOmin; 95 °C 10s，63 °C，35s，在此收集荧光信号，45个循环。
[0055] 具体的，一种阿胶胶液中驴、牛源性成分的实时荧光定量PCR量化检测方法，其步 骤如下：
[0056] (1)驴和牛特异基因的引物、探针设计。本发明通过比对驴和牛的特征基因序列， 设计驴特异性引物和牛特异性引物以及各自特异性探针。基于阿胶高温炮制降解为DNA小 片段情况，本发明采用Mini-qPCR技术，PCR扩增片段长度范围在70~200bp左右，大大提高 了检测成功率。本发明提供引物及探针序列如下：
[0057]驴特异引物：
[0058] 上游引物LVF: 5 ' -TGGACCCCATGGTCTCCTTC-3 ' ；
[0059] 下游引物LVR: 5 ' -CAGGAGTTGGGGTGGATGTG-3 ' ；
[0060] 驴特异探针：
[0061] Equus asinus-Probe:5，FAM-CGGGGGTCCCAGAGACCACC-BHQ2 3，
[0062] 牛特异引物(5'->3，）
[0063] NF:5 '-CTTTGCTGGGTTTGGTTCCG 3 '
[0064] NR:5 '-CAGCGGCCAAAGCCTAAATC-3 '
[0065] 牛特异探针：
[0066] Bovine-Probe:5，J0E-CGGGTGTGGGGCAGGTGG-BHQ2 3，
[0067]上述2种特异探针的5'端荧光修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团。所述报告基 团可以为?六1、冊乂、了六11^、1?(^丄￥5等，所述淬灭基团可以为〇31^71、8即1、8即2等。
[0068] (3)本发明提供了一种阿胶取样方法。根据阿胶现代加工工艺流程，在化皮后和胶 汁分离阶段取样200ml，利用专利CN. 201410317118.7阿胶DNA提取技术提取核酸DNA，其方 法在专利201410317118.7中有详细的记载，在此不再赘述。经实验证明阿胶在化皮后和胶 汁分离阶段所提取的核酸DNA完整性好。
[0069] (4)本发明优先选用20μ1的实时荧光多重PCR扩增体系，含TaqMan reaction Mix (2Χ)10μ1,驴探针E asinus-P 0.25μΜ,牛探针Bovine-P 0.4μΜ,驴特异性正反向引物LVF/ LVR0.8μΜ，牛特异性正反向引物NF/NR 0.8μΜ，R0X参比荧光（50 X ) 0.4μ1，待测样本总DNA2y 1，用双蒸水补足20μ1反应体系。阴性模板对照加无菌双蒸水。
[0070] (5)本发明优先选用？0財广增条件:？0財广增条件为：95°(：1〇1^11;95°(：1〇8,63°(：， 35s，在此收集荧光信号，45个循环。
[0071] (6)标准曲线的制作：将驴和牛的目标靶基因分别克隆至PMD18-T载体中，通过测 序筛选阳性克隆，分别取已知浓度的驴、牛阳性克隆质粒作为标准样，按照10倍体积梯度稀 释作为标准模板（10 8104拷贝/μL)。依照上述荧光定量PCR体系和PCR扩增条件(步骤4和5) 与待测样本同时进行定量PCR扩增。反应结束后，根据各个浓度梯度的Ct值和浓度值绘制荧 光定量PCR标准曲线。
[0072] (7)根据待测样本的Ct值和标准曲线计算样本中含驴源和牛源基因拷贝数，进而 推算驴源和牛源所占百分含量。
[0073]上述所涉及到的引物探针全部为本发明所设计，并在上海生工生物工程股份有限 公司合成。上述多重实时荧光定量PCR检测步骤中，进行PCR扩增时，扩增阶段反应需在至少 2通道型号的荧光定量PCR仪上进行，根据不同型号的定量PCR仪的要求对标记荧光素进行 相应的调整。
[0074] 有益效果：
[0075] 本发明有益效果在于:本发明公开了一种阿胶胶液中驴、牛源性成分的实时荧光 定量PCR量化检测方法，其创新性在于：
[0076] (1)本发明创造性的选取了阿胶生产过程中化皮和胶汁分离阶段取样，克服了由 于阿胶成品经过长时间高温炮制导致DNA降解而提取困难不完整的难题；
[0077] (2)本发明利用基因信息学技术分析寻找驴和牛的基因组单拷贝看家基因，并设 计特异引物和探针，通过绘制标准曲线和确立基因质量比系数，实现对阿胶中掺有牛源成 分的比例进行定量检测。
[0078] (3)本发明在阿胶生产加工质量监控及监管部门监管中具有很高的应用价值。
[0079] (4)本发明的所使用的引物、探针组合物特异性强，灵敏度好，能够有效实现阿胶 胶液动物源成分的定量检测。
[0080] (5)本发明的方法重复性好、特异性强、准确度高、通量大、使用方便、耗时短3小时 之内可完成检测。
【附图说明】
[0081 ]图1.为阿胶不同生产阶段提取的DNA琼脂糖凝胶电泳图。
[0082]图2.阿胶胶液PCR扩增结果琼脂糖凝胶电泳图。
[0083] 图3.驴和牛特征核酸同源性BLAST分析图。
[0084] 图4.驴源牛源特征基因与其他物种基因序列同源性比对图。
[0085] 图 5.为驴源的标准曲线扩增图，y5户=-3.702x+29.702(Eff % =86.265，R2 = 0·998)〇
[0086] 图6.为驴源的DNA标准品不同梯度浓度的扩增曲线图。
[0087] 图7.为牛源的标准曲线扩增图，y 牛=-3.58x+31.38(Eff%=90.238，R2 = 0.998)。
[0088] 图8.为牛源的DNA标准品不同梯度浓度的扩增曲线图。
[0089] 图9.为驴源和牛源灵敏度定量检测图，定量检测限为0.5%。
【具体实施方式】
[0090] 以下结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应该理解为对本发明的限 制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换， 均属于本发明的范围。除非特别说明，本发明采用的除引物、探针之外的试剂、方法和设备 为本领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明使用的试剂和试剂盒均为市购。 [0091 ] 1.下列实施例中，所用实验材料、试剂与仪器如下：
[0092] 实验材料：
[0093] 牛、猪、驴、马、骆驼、牦牛、山羊、绵羊、兔、鱼、鸡、鸭、狗、水貂及狐狸等动物皮张或 新鲜组织，阿胶同一批次不同生产阶段，同一生产阶段不同批次的样本共30份，均购自济南 市。
[0094]所用试剂：
[0095] 动物组织提取试剂盒为OMEGA品牌。DNA分子量MakerDLlOOO、电泳上样缓冲液等 PCR反应试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。引物与探针由生工生物工程(上海)有限公 司负责合成。2 XTaqMan Master Mix为DBI Bioscience品牌。DNA测序由山东省农业科学院 生物技术中心测序中心完成。
[0096] 所用仪器:ABI 7500荧光定量PCR仪为ABI公司产品，Takara PCR仪为宝生物工程 (大连)有限公司产品。5424D型高速离心机为Eppendorf公司产品。
[0097] 实施例1
[0098] (l)DNA提取:本发明提供了一种阿胶取样方法。根据阿胶现代加工工艺流程，在化 皮、胶汁分离、撤沫提杂双效后、浓缩阶段、凝胶成胶膏阶段及加工成品阿胶取样200ml (l〇〇g)，利用专利CN. 201410317118阿胶DNA提取技术提取核酸DNA。经实验证明阿胶在化皮 后、胶汁分离阶段、双效前和浓缩前所提取的核酸DNA相对完整度好，进入浓缩后和加辅料 时期DNA已降解为小片段，胶膏时期（已接近成品阿胶)DNA已成弥散条带，相对前期已降解 严重，见图1，对浓缩后和加辅料及胶膏时期的样本提取DNA并用不同扩增片段长度的引物 对进行扩增，阿胶胶液DNA提取及扩增琼脂糖凝胶电泳图见【附图说明】图2，结果显示浓缩后 和加辅料及胶膏200bp范围的小片段基因均可以得到很好扩增，但750bp大小的片段除浓缩 阶段前能扩出来，加辅料前加辅料后及胶膏成品阶段均扩增不出条带。
[0099] (2)驴或牛内标准基因的筛选与获得：分别进Aftp://ftp.ensembl .org/pub/ release_84/fasta/equus_caballus/和ftp://ftp·ensembl·org/pub/release_84/fasta/ bos_taurus/目录下，分别下载cdna、ncma和pep下级文件内的文件，解压后合并cDNA列表和 ncRNA列表生成核酸序列文件，作为牛和驴基因核酸序列信息库(驴全基因组信息还未公布 只能借鉴马的全基因组信息），服务器本地BLASTn运行，按照E值和identity筛选，筛选得到 牛物种内同其他物种在核酸水平及蛋白质水平比对同源性小的目标序列。通过筛选结合文 献查找最终找到驴和牛的特征基因，该基因据文献报道为单拷贝基因。通过BLAST分析驴和 牛特征核酸同源性85%。见【附图说明】图3和图4.
[0100] (3)驴和牛特异基因的引物、探针设计:本发明通过比对驴和牛的特征基因序列， 分别设计驴和牛特异引物以及各自特异性探针。基于阿胶高温炮制降解为DNA小片段情况， 本发明采用Mini-qPCR技术，PCR扩增片段长度范围100~200bp左右，大大提高了检测成功 率。本发明提供引物及探针序列如下：
[0101]表1引物及探针序列信息
[0103] (4)阿胶中牛源性、驴源性成分的定量检测:选用20μ1的实时荧光多重PCR扩增体 系，含TaqMan reaction Μ?χ(2χ)10μ1，Ε asinus-P 0.25yM，Bovine_P 0·3μΜ,驴特异性正 反向引物LVF/LVR 0.8μΜ，牛特异性正反向引物NF/NR 0.8Mm，R0X参比荧光（50χ)0.4μ1，待 测样本总DNA2yl，用双蒸水补足20μ1反应体系。阴性模板对照加无菌双蒸水。20μ1反应体系 见表2.
[0104] 表2 20ylPCR反应体系
[0106] (5)本发明优先选用PCR扩增条件:PCR扩增条件为:95°C3min;95°C10s，63°C，35s， 在此收集荧光信号，45个循环。
[0107] (6)标准曲线的制作：将驴和牛的目标靶基因分别克隆的PMD18-T载体中，通过测 序筛选阳性克隆，分别取已知浓度的驴、牛阳性克隆质粒作为标准样，按照10倍体积梯度稀 释作为标准模板（10 8104拷贝/μL)。依照上述荧光定量PCR体系和PCR扩增条件(步骤4和5) 与待测样本同时进行定量PCR扩增。反应结束后，根据各个浓度梯度的Ct值和浓度值绘制荧 光定量PCR标准曲线。根据待测样本的Ct值和标准曲线按照数学公式计算样本中含驴源和 牛源基因拷贝数，进而推算驴源和牛源所占百分含量。
[0108] (7)阿胶样品中驴源和牛源百分比含量计算:标准曲线的计算公式:y驴=-3.702x+ 29.702江€€%=86.265，1?2 = 0.998)，驴的标准曲线见图5，扩增曲线图见图6;7牛=-3.581+ 31.38(Eff % =90.238，R2 = 0.998)牛的标准曲线见图7,扩增曲线图见图8。通过标准曲线 及待测样本ct值即可计算出待测样本含有驴源性及牛源性拷贝数。
[0109] 实施例2特异性验证
[0110] 利用所设计的引物及探针，分别以牛、猪、马、驴、骡子、山羊、绵羊、兔、鱼、鸡、鸭、 狗、骆驼、水貂及狐狸等动物的总基因组DNA为模板，进行实时荧光定量PCR检测，验证引物 及探针的特异性。其结果见表3,结果表明本发明所设计的引物及探针具有很强的特异性。
[0111] 表3特异性验证实验
[0114] 实施例3灵敏度实验
[0115] 按照驴皮中掺入1%。，5%〇，1 %，5 %，10 %，20 %，50 %的牛皮混匀（质量比），提取 DNA，进行实时荧光定量PCR检测，评估本发明的检测限，见【附图说明】图9,结果表明本方法定 量检测限为0.5%，说明本发明所提供的方法具有很高的灵敏度。
[0116] 实施例4模拟掺假定量检测
[0117] 按照驴皮中掺入0 %、1%、2 %、5 %、10 %、20 %、50 %和100 %的比例掺入牛皮，按 照本专利所述定量方法进行定量检测，设5个平行试验，结果见表4，结果显示含有牛源成分 越低如1 %，2%、5%定量相对误差值越大，随着牛皮源百分比含量的增加如10%、20%、 50%相对误差减小，造成误差的原因可能是操作误差或检测误差造成，结果证明但基本符 合实际掺假比例情况，验证了本发明的定量方法的可行性。
[0118] 表4混合样本驴和牛源成分定量检测
[0121]实施例5阿胶胶液样品的定量检测
[0122] 按照不同的掺入比例，驴皮中掺入0%，5%，10%，20%，50%的牛皮进行实验室阶 段的熬制，完全按照生产过程进行模拟，在化皮阶段取样，该步骤由山东国胶堂阿胶药业有 限公司提供供试样本，由本实验室以未知样本处理，提取DNA，每个样品设5个平行试验，通 过标准曲线法对阿胶中驴、牛源性进行定量分析，实验结果见表5,结果表明牛皮实际掺入 比例与定量检测结果基本一致，进一步验证了本发明的定量方法的可行性。
[0123] 表5阿胶胶液样本定量检测
[0124]
[0125] 上述虽然结合实施例对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护 范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员 不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
【主权项】
1. 一种阿胶胶液半成品或成品中驴、牛源性成分的定量检测方法，其特征在于，根据驴 和牛看家基因单拷贝基因，设计引物及探针，提取待测样品DNA，采用TaqMan qPCR的方法对 阿胶胶液半成品或成品进行驴源或牛源成分定量检测，使用梯度浓度的目标靶基因作为标 准模板，PCR扩增后制作标准曲线，根据标准曲线和待测样本的Ct值计算阿胶胶液单位质量 中驴和牛源核基因的拷贝数，计算出阿胶中驴源和牛源所占比例，进而定量。2. 根据权利要求1所述的阿胶胶液半成品或成品中驴、牛源性成分的定量检测方法，其 特征在于，所述看家基因为驴和牛的特征基因 LHB基因。3. 根据权利要求1所述的阿胶胶液半成品或成品中驴、牛源性成分的定量检测方法，其 特征在于，包括以下引物、探针，序列分别如下： (1) 驴特异引物： 上游引物LVF: 5 ' -TGGACCCCATGGTCTCCTTC-3 '，如SEQ NO · 1所示； 下游引物LVR: 5 '-CAGGAGTTGGGGTGGATGTG-3 '，如 SEQ NO. 2所示； (2) 驴特异探针： Equus asinus-Probe: 5 '-CGGGGGTCCCAGAGACCACC-3 '，如SEQ NO· 3所示； (3) 牛特异引物： NF: 5 ' -CTTTGCTGGGTTTGGTTCCG-3 '，如SEQ NO · 4所示； NR: 5 ' -CAGCGGCCAAAGCCTAAATC-3 '，如 SEQ NO · 5所示； (4) 牛特异探针： Bovine-Probe: 5 '-CGGGTGTGGGGCAGGTGG-3 '，如SEQ NO · 6所示； 其中，所述驴、牛特异性探针的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，所述报告 基团为?六1、冊父、了六11^、1?(^、0￥5中的任一种，所述淬灭基团为〇31^71、8即1、8即2中的任一 种。4. 根据权利要求1所述的阿胶胶液半成品或成品中驴、牛源性成分的定量检测方法，其 特征在于，所述提取阿胶样品DNA为使用专利号为CN. 201410317118.7的专利公开的方法提 取。5. 根据权利要求1所述的阿胶胶液半成品或成品中驴、牛源性成分的定量检测方法，其 特征在于，所述标准曲线的制作具体为:将驴和牛的目标靶基因分别克隆到PMD18-T载体 中，通过测序筛选阳性克隆，分别取已知浓度的驴、牛阳性克隆质粒作为标准样，按照10倍 体积梯度稀释作为标准模板，标准模板与待测样品DNA同时进行定量PCR扩增，反应结束后， 根据各个浓度梯度的Ct值和浓度值绘制荧光定量PCR标准曲线。6. 根据权利要求5所述的阿胶胶液半成品或成品中驴、牛源性成分的定量检测方法，其 特征在于，所述PCR扩增体系为:含TaqMan reaction Mix(2x) 10μ1，驴特异探针0.25μΜ，牛 特异探针〇. 4μΜ，驴特异性正反向引物LVF/LVR 0.8μΜ，牛特异性正反向引物NF/NR 0.8μΜ， ROX参比荧光（50 X )0.4μ1，待测样本总DNA2yl，用双蒸水补足20μ1反应体系;所述PCR扩增 条件为:95°C10min;95°C10s，63°C，35s，在此收集荧光信号，45个循环。7. 根据权利要求5或6所述的阿胶胶液半成品或成品中驴、牛源性成分的定量检测方 法，其特征在于，所述PCR扩增阶段反应需在至少2通道型号的荧光定量PCR仪上进行。8. -种阿胶胶液半成品或成品中驴、牛源性成分的定量检测引物、探针组合物，其特征 在于，包括以下引物、探针： (1) 驴特异引物： 上游引物LVF: 5 ' -TGGACCCCATGGTCTCCTTC-3 '，如SEQ NO · 1所示； 下游引物LVR: 5 '-CAGGAGTTGGGGTGGATGTG-3 '，如 SEQ NO. 2所示； (2) 驴特异探针： Equus asinus-Probe: 5 '-CGGGGGTCCCAGAGACCACC-3 '，如SEQ NO· 3所示； (3) 牛特异引物： NF: 5 ' -CTTTGCTGGGTTTGGTTCCG-3 '，如SEQ NO · 4所示； NR: 5 ' -CAGCGGCCAAAGCCTAAATC-3 '，如 SEQ NO · 5所示； (4) 牛特异探针： Bovine-Probe: 5 '-CGGGTGTGGGGCAGGTGG-3 '，如SEQ NO · 6所示； 其中，所述驴、牛特异性探针的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，所述报告 基团为?六1、冊父、了六11^、1?(^、0￥5中的任一种，所述淬灭基团为〇31^71、8即1、8即2中的任一 种。9. 一种阿胶胶液半成品或成品中驴、牛源性成分的定量检测试剂盒，其特征在于，包括 权利要求8所述引物、探针组合物以及荧光PCR反应所需试剂。10. 根据权利要求9所述胶胶液半成品或成品中驴、牛源性成分的定量检测试剂盒，其 特征在于，所述PCR扩增体系为:含TaqMan reaction Mix(2x) 10μ1，驴特异探针0.25μΜ，牛 特异探针〇. 4μΜ，驴特异性正反向引物LVF/LVR 0.8μΜ，牛特异性正反向引物NF/NR 0.8μΜ， ROX参比荧光（50 X )0.4μ1，待测样本总DNA2yl，用双蒸水补足20μ1反应体系;所述PCR扩增 条件为:95°C10min;95°C10s，63°C，35s，在此收集荧光信号，45个循环。
【文档编号】C12Q1/68GK105950717SQ201610272618
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年4月28日
【发明人】步迅, 张全芳, 刘艳艳, 范阳阳
【申请人】山东省农业科学院生物技术研究中心