一种阿胶胶液半成品或成品中驴、马源性成分的定量检测方法、组合物及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种阿胶胶液半成品或成品中驴、马源性成分的定量检测方法、组合物及试剂盒，属于分子生物学技术领域，该方法为根据驴和马看家基因单拷贝基因，设计驴和马通用引物及驴和马特异性探针，提取待测样品DNA，采用TaqMan qPCR的方法对阿胶胶液半成品或成品进行驴源或马源成分定量检测，根据标准曲线和待测样本的Ct值计算阿胶胶液单位质量中驴和马源核基因的拷贝数，计算出阿胶中驴源和马源所占比例，进而对阿胶样品驴源或马源成分定量，本发明的方法、组合物及试剂盒检测特异性好、灵敏度强、不仅实现阿胶中驴源和马源定性检测，还可以实现定量分析，为阿胶企业质量把控提供技术推广和应用。
【专利说明】
一种阿胶胶液半成品或成品中驴、马源性成分的定量检测方 法、组合物及试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及一种阿胶胶液半成品或成品中驴、马源性成分的定量检测方法、组合 物及试剂盒，属于分子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 阿胶为马科动物驴的皮，经煎煮、浓缩制成的固体胶，原产自山东省泛东阿区，始 载于《神农本草经》，与人参、鹿茸并称为"滋补三宝"，至今已有近三千年历史。阿胶补血圣 药，味甘平，入肺、肝、肾经，具有补血止血、滋阴润燥等功效，药食两用，长期服用可补血养 血、美白养颜、抗衰老、抗疲劳、提高免疫力，适用人群广泛。李时珍著《本草纲目》载："阿胶 《本经》上品。
[0003] 2015版《中国药典》明确规定阿胶为马科动物驴(Equus animus L.)的皮经去毛、 煎煮并佐以黄酒、豆油、冰糖熬制而成。然而随着胶类市场的不断发展，随着熬胶原料供应 的紧张和原料价格上涨，一些驴皮供应商拿廉价马皮、骡子皮甚至牛皮冒充驴皮，掺假手段 高明，有的甚至将驴耳朵缝制马皮上等变成驴皮的特征来冒充驴皮，另外由于驴、马及骡子 同属马科动物，仅凭外观更是难以鉴别，成为企业原料质量把控的一大难题，或多或少会掺 入马皮或骡子皮等无意掺假现象在所难免，作为阿胶生产企业更加迫切需要阿胶整个生产 过程的质量把控，不让马皮、骡子皮或牛皮掺入阿胶中，生产纯正的驴皮源阿胶，这就要求 发展更加可行、灵敏的检测技术来满足阿胶生产企业及监管部门质量控制与监管的需求。
[0004] 随着分子生物学技术的发展，一些基于DNA的生物学鉴定手段逐渐丰富起来，DNA 分子法主要是利用显示生物特征的各种生物物种所具有的不同DNA序列信息进行鉴别，它 可以突破依据感官检测的局限性，与传统分析方法相比，更加具有客观性和准确性。以聚合 酶链式反应(PCR)为基础的技术已逐步成为了食品药品中动物源性成分种属鉴定的核心方 法。近年来实时荧光PCR技术的飞速发展大大提高了检测的灵敏度、特异性和准确性，并使 得成分含量的定量溯源成为可能，由于荧光定量整个检测过程闭管操作，所以有效的减少 了实验过程中外源污染的危险，目前广泛应用于各个领域。
[0005] 近年来随着阿胶掺假现象不断被媒体曝光，逐渐引起科研工作者的重视，国内外 科研机构及阿胶企业开展了大量利用分子生物学技术手段鉴定驴皮、马皮真伪鉴定的科学 研究工作，专利授权号为(CN.104046700B)利用qPCR技术解决了快速鉴别驴皮、马皮、驴骡 及马骡皮的技术难题，专利(CN201510018058.3)公开了阿胶中驴、马、猪及牛源性多重实时 荧光PCR检测方法，专利(CN 201510403781.3)利用巢式PCR技术鉴别阿胶真伪，但都是针对 阿胶成品的真伪利用线粒体为靶基因进行定性检测，由于线粒体基因在所有的动物不同组 织细胞中拷贝数不同而不能量化，无法区分阿胶中是污染还是掺假，更不能知晓掺假比例， 因此，阿胶掺假量化研究十分必要。而基于DNA检测技术的驴源和马源成分量化分析方法研 究目前在国内外还尚未报道。
【发明内容】
[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供一种阿胶胶液半成品或成品中驴、马源性成分 的实时荧光定量检测方法、组合物及试剂盒，该方法、组合物及试剂盒检测特异性好、灵敏 度强、不仅实现阿胶中驴源和马源定性检测，还可以实现定量分析，为阿胶企业质量把控提 供技术推广和应用。
[0007] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：
[0008] -种阿胶胶液半成品或成品中驴、马源性成分的定量检测方法，根据驴和马看家 基因单拷贝基因，设计引物及探针，提取待测样品DNA，采用TaqMan qPCR的方法对阿胶胶液 半成品或成品进行驴源或马源成分定量检测，根据标准曲线和待测样本的Ct值计算阿胶胶 液单位质量中驴和马源核基因的拷贝数，计算出阿胶中驴源和马源所占比例，进而对阿胶 样品驴源或马源成分定量。
[0009] 本发明还具有以下附加技术特征：
[0010] 进一步的，采集阿胶胶液样本，根据阿胶现代加工工艺流程，在阿胶生产过程中化 皮和胶汁分离阶段分别取样200ml，利用专利CN. 201410317118阿胶DNA提取技术提取核酸 DNA。经实验证明阿胶在化皮阶段和胶汁分离阶段所提取的核酸DNA完整性好。利用基因信 息学技术寻找驴和马看家基因单拷贝基因，设计特异引物及特异性探针，采用TaqMan qPCR 的方法对阿胶中进行驴源和马源成分定量检测，根据标准曲线和待测样本的Ct值计算阿胶 单位质量中驴和马源核基因的拷贝数，推算出阿胶中驴源和马源所占比例，进而达到定量 的目的。
[0011]优选的，所述待测样品为阿胶生产过程中化皮和胶汁分离阶段的样品。
[0012]优选的，所述看家基因为驴和马的特征基因LHB基因。
[0013]优选的，所述引物为驴和马通用引物，所述探针为驴、马特异性探针，序列分别如 下：
[0014] (1)驴和马通用引物：
[0015] UF: 5 ' -TGGACCCCATGGTCTCCTTC-3 '，如SEQ N0 ? 1所示；
[0016] UR: 5 ' -CAGGAGTTGGGGTGGATGTG-3 '，如SEQ N0 ? 2所示；
[0017] ⑵驴、马特异性探针：
[0018] 驴特异探针：
[0019] Equusasinus-Probe:P:5，CGGGGGTCCCAGAGACCACC3，JnSEQN0.3K* ;
[0020]马特异探针：
[0021] Equus caballus-Probe:5，CTGCCAGATCAAGACCACTGACTGC 3，，如SEQ N0 ? 4所示；
[0022] 其中，所述驴、马特异性探针的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，所述 报告基团为FAM、HEX、TAMRA、R0X、CY5中的任一种，所述淬灭基团为Dab cy 1、BHQ1、BHQ2中的 任一种。
[0023]进一步的，驴特异探针：
[0024] Equus asinus-Probe:P:5，FAM-CGGGGGTCCCAGAGACCACC-BHQ2 3,，如SEQ N0.3所 示；
[0025]马特异探针：
[0026] Equus caballus-Probe:5，J0E-CTGCCAGATCAAGACCACTGACTGC-BHQ2 3,，如SEQ NO. 4所示。
[0027] 优选的，所述提取阿胶样品DNA为使用专利号为CN. 201410317118.7的专利公开的 方法提取。
[0028] 优选的，所述标准曲线的制作具体为:将驴和马的目标靶基因分别克隆到PMD18-T 载体中，通过测序筛选阳性克隆，分别取已知浓度的驴、马阳性克隆质粒作为标准样，按照 10倍体积梯度稀释作为标准模板，梯度稀释为1〇 7_1〇3拷贝AU，标准模板与待测样品DNA同 时进行定量PCR扩增，反应结束后，根据各个浓度梯度的Ct值和浓度值绘制荧光定量PCR标 准曲线；
[0029] 其中：马的目标靶基因序列为：
[0031]其中：驴的目标靶基因序列为：
[0033] 优选的，所述PCR扩增体系为:含TaqMan reaction Mix(2x)10yl，驴特异探针0.2 ~0.5yM，马特异探针0.2~0.5yM，驴和马通用引物正反向序列均为0.5yM，R0X参比荧光50x 0.4yl，待测样本总DNA2yl，用双蒸水补足20yl反应体系;所述PCR扩增条件为:95°C lOmin; 95 °C 10s，60 °C，35s，在此收集荧光信号，45个循环。
[0034] 优选的，所述PCR扩增阶段反应需在至少2通道型号的荧光定量PCR仪上进行。
[0035] 本发明还提供一种阿胶胶液半成品或成品中驴、马源性成分的定量检测引物、探 针组合物，包括以下引物、探针：
[0036] (1)驴和马通用引物：
[0037] UF: 5 ' -TGGACCCCATGGTCTCCTTC-3 '，如SEQ N0 ? 1所示；
[0038] UR: 5 ' -CAGGAGTTGGGGTGGATGTG-3 '，如SEQ N0 ? 2所示；
[0039] (2)驴、马特异性探针：
[0040] 驴特异探针：
[0041 ] Equus asinus-Probe: P: 5，CGGGGGTCCCAGAGACCACC 3，，如SEQ N0 ? 3所示；
[0042]马特异探针：
[0043] Equuscaballus-Probe:5，CTGCCAGATCAAGACCACTGACTGC3，JnSEQN0.4K*; [0044]其中，所述驴和马特异性探针的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，所述 报告基团为FAM、HEX、TAMRA、R0X、CY5中的任一种，所述淬灭基团为Dab cy 1、BHQ1、BHQ2中的 任一种。
[0045] 进一步的，驴特异探针：
[0046] Equus asinus-Probe:P:5，FAM-CGGGGGTCCCAGAGACCACC-BHQ2 3,，如SEQ N0.3所 示；
[0047] 马特异探针：
[0048] Equus caballus-Probe:5，J0E-CTGCCAGATCAAGACCACTGACTGC-BHQ2 3,，如SEQ NO. 4所示。
[0049] 本发明另提供一种阿胶胶液半成品或成品中驴、马源性成分的定量检测试剂盒， 包括上述引物、探针组合物以及荧光PCR反应所需试剂。
[0050] 优选的，所述荧光PCR反应体系为20yl，所需试剂包括含TaqMan reaction Mix(2 X ) lOiil，驴特异探针0.2~0.5yM，马特异探针0.2~0.5yM，驴和马通用引物正、反向序列均 为0.5yM，R0X参比荧光50 X 0.4yl，待测样本总DNA2yl，双蒸水。
[0051]本发明的阿胶胶液和成品中驴、马源性成分的实时荧光定量PCR量化检测方法，其 具体步骤如下：
[0052] (1)驴或马内标准基因的筛选与获得
[0053] 进入ftp: //ftp ? ensembl .org/pub/release-84/fasta/equus_caballus/ 目录下， 分别下载cdna、ncma和pep下级文件内的Equus_caballus ? EquCab2.pep.abinitio ? fa和 Equus_caballus .EquCab2 .pep? all ? fa文件，解压后合并cDNA列表和ncRNA列表生成核酸序 列文件，作为马基因核酸序列信息库(驴全基因组信息还未公布），服务器本地BLASTn运行， 按照E值和identity筛选，筛选得到马物种内同其他物种在核酸水平及蛋白质水平比对同 源性小的目标序列。通过筛选结合文献查找最终找到驴和马的特征基因 LHB基因，该基因据 文献报道为单拷贝基因。通过BLAST分析驴和马特征核酸同源性为96%，氨基酸序列同源性 为93%。与最近的白犀牛(Ceratotherium)的同源性只有83%。核酸序列同源比对见附图说 明图1。
[0054] (2)驴和马特异基因的引物、探针设计。本发明通过比对驴和马的特征基因序列， 在共同的一致序列区域设计驴和马的通用引物，在存在差异区域设计驴和马各自特异性探 针。基于阿胶高温炮制降解为DNA小片段情况，本发明采用Mini-qPCR技术，PCR扩增片段长 度范围100~200bp左右，大大提高了检测成功率。
[0055] (3)本发明提供了一种阿胶取样方法。根据阿胶现代加工工艺流程，在化皮后和胶 汁分离阶段取样200ml，利用专利CN. 201410317118.7阿胶DNA提取技术提取核酸DNA，其方 法在专利201410317118.7中有详细的记载，在此不再赘述。经实验证明阿胶在化皮后和胶 汁分离阶段所提取的核酸DNA完整性好。
[0056] (4)本发明优先选用20yl的实时荧光多重PCR扩增体系，含TaqMan reaction Mix (2X)10]il，Equus asinus-Probe 0.2~0.5liM，Equus caballus-Probe 0.2~0.5liM，特异 性正反向引物UF/UR 0.5~yM(目的产物大小177bp)，R0X参比荧光（50X)0.4yl，待测样本 总DNA2yl，用双蒸水补足20yl反应体系。阴性模板对照加无菌双蒸水。
[0057] (5)本发明优先选用？0財广增条件：？0財广增条件为：95°(：10111111;95°(：108,60°(：， 35s，在此收集荧光信号，45个循环。
[0058] (6)标准曲线的制作：将驴和马的目标靶基因分别克隆的PMD18-T载体中，通过测 序筛选阳性克隆，分别取已知浓度的驴、马阳性克隆质粒作为标准样，按照10倍体积梯度稀 释作为标准模板（107104拷贝/y 1)。依照上述荧光定量PCR体系和PCR扩增条件(步骤4和5) 与待测样本同时进行定量PCR扩增。反应结束后，根据各个浓度梯度的Ct值和浓度值绘制荧 光定量PCR标准曲线。
[0059] (7)根据待测样本的Ct值和标准曲线计算样本中含驴源和马源基因拷贝数，进而 计算出驴源和马源所占百分含量。
[0060] 上述所涉及到的驴和马靶基因及引物探针全部为本发明所设计，并在上海生工生 物工程股份有限公司合成。上述多重实时荧光定量PCR检测步骤中，进行PCR扩增时，扩增阶 段反应需在至少2通道型号的荧光定量PCR仪上进行，根据不同型号的定量PCR仪的不同要 求可以对标记荧光素进行相应的调整。
[0061 ] 有益效果：
[0062] 本发明有益效果在于:本发明公开了一种阿胶胶液半成品中驴、马源性成分的实 时荧光定量PCR量化检测方法，其创新性在于：
[0063] (1)本发明创造性的选取了阿胶生产过程中化皮和胶汁分离阶段取样，克服了由 于阿胶成品经过长时间高温炮制导致DNA降解而提取困难不完整的难题；
[0064] (2)本发明利用基因信息学技术分析寻找驴和马的基因组单拷贝看家基因，并设 计特异引物和探针，通过绘制标准曲线和确立基因质量比系数，实现对阿胶中掺有马源成 分比例的定量检测，弥补了现有技术缺乏定量检测的不足。
[0065] (3)本发明的所使用的引物、探针组合物特异性强，灵敏度好，能够有效实现阿胶 胶液动物源成分的定量检测。
[0066] (4)本发明在阿胶生产加工质量监控及监管部门监管中具有很高的应用价值。
[0067] (5)本发明的方法重复性好、特异性强、准确度高、通量大、使用方便、耗费时间短2 小时之内即可完成检测。
【附图说明】
[0068]图1.阿胶不同生产阶段提取的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图。
[0069] 图2_a?驴和马特征核酸同源性BLAST Graphic Summary分析图；
[0070] 图2_b?驴和马特征核酸同源性BLAST Sequences producing significant alignments 分析图。
[0071] 图3.驴源马源特征基因与其他物种基因序列同源性比对图的上部图。
[0072] 图 4.为驴源的标准曲线扩增图，ys^=-3.325x+32.761(Eff % =99.884，R2 = 0.986)〇
[0073] 图 5.为马源的标准曲线扩增图，y马=-3.197x+30.994(Eff% = 105.473，R2 = 0.983)〇
[0074]图6.为驴源的DNA标准品不同梯度浓度的扩增曲线图，其中每个梯度浓度为三个 平行样，图中标注指的为三个平行样中的一个。
[0075]图7.为马源的DNA标准品不同梯度浓度的扩增曲线图，其中每个梯度浓度为三个 平行样，图中标注指的为三个平行样中的一个。
[0076]图8.为驴源和马源成分灵敏度定量检测图，定量检测限为1%，其中图中最上部重 合在一起的线均为100%驴。
【具体实施方式】
[0077] 下列实施例中，所用实验材料、试剂与仪器如下：
[0078] 实验材料:阿胶生产各个环节中的半成品、阿胶成品、驴、马、牛、猪、骡子、山羊、绵 羊、兔、鱼、鸡、鸭、狗、骆驼、水貂及狐狸等动物组织材料，均为济南市购。
[0079] 所用试剂:动物组织提取试剂盒为OMEGA品牌。DNA分子量MakerDLlOOO、电泳上样 缓冲液等PCR反应试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。引物与探针由生工生物工程(上 海)有限公司负责合成。2XTaqMan Master Mix为DBI Bioscience品牌。DNA测序由山东省 农业科学院生物技术中心测序中心完成。
[0080] 所用仪器:ABI 7500荧光定量PCR仪为ABI公司产品，Takara PCR仪为宝生物工程 (大连)有限公司产品。5424D型高速离心机为Eppendorf公司产品。
[0081 ] 实施例1
[0082] (l)DNA提取:本发明提供了一种阿胶取样方法。根据阿胶现代加工工艺流程，在化 皮、胶汁分离、撤沫提杂双效后、浓缩阶段、凝胶成胶膏阶段及加工成品阿胶取样200ml (l〇〇g)，利用专利CN. 201410317118阿胶DNA提取技术提取核酸DNA。经实验证明阿胶在化皮 后和胶汁分离阶段所提取的核酸DNA完整性好，其他阶段均有不同程度的降解，但经过不同 片段的扩增，100~300bp的小片段基因扩增产物均可以得到很好，阿胶不同生产加工阶段 DNA提取琼脂糖凝胶电泳见图1。
[0083] (2)驴或马内标准基因的筛选与获得
[0084] 进入ftp: //ftp ? ensembl .org/pub/release-84/fasta/equus_caballus/ 目录下， 分别下载cdna、ncma和pep下级文件内的Equus_caballus ? EquCab2.pep.abinitio ? fa和 Equus_caballus .EquCab2 .pep? all ? fa文件，解压后合并cDNA列表和ncRNA列表生成核酸序 列文件，作为马基因核酸序列信息库(驴全基因组信息还未公布），服务器本地BLASTn运行， 按照E值和identity筛选，筛选得到马物种内同其他物种在核酸水平及蛋白质水平比对同 源性小的目标序列。通过筛选结合文献查找最终找到驴和马的特征基因，该基因据文献报 道为单拷贝基因。通过BLAST分析驴和马特征核酸同源性为96%，氨基酸序列同源性为 93%。与最近的白犀牛(Ceratotherium)的同源性只有83%。见【附图说明】图2.和图3.
[0085] (3)驴和马特异基因的引物、探针设计。本发明通过比对驴和马的特征基因序列， 在共同的一致序列区域设计驴和马通用引物，在存在差异区域设计驴和马各自特异性探 针。基于阿胶高温炮制降解为DNA小片段情况，本发明采用Mini-qPCR技术，PCR扩增片段长 度范围100~200bp左右，大大提尚了检测成功率。本发明提供引物及探针序列如下：
[0086]驴和马的通用引物（177bp):
[0087] UF:5 '-TGGACCCCATGGTCTCCTTC-3 '；
[0088] UR:5 '-CAGGAGTTGGGGTGGATGTG-3 '；
[0089] 驴特异探针：
[0090] Equus asinus-P:5，FAM-CGGGGGTCCCAGAGACCACC-BHQ2 3,；
[0091]马特异探针：
[0092] Equus caballus-P:5，J0E-CTGCCAGATCAAGACCACTGACTGC-BHQ23，〇
[0093] (5)阿胶中马源性、驴源性成分的定量检测:选用20yl的实时荧光多重PCR扩增体 系，含TaqMan reaction Mix(2X)lOyl,Equus asinus-Probe 0?25yM,Equus caballus- Probe 0.4yM，特异性正反向引物UF/UR 0.8yM(目的产物大小177bp)，R0X参比荧光（50 X ) 0.4yl，待测样本总DNA2yl，用双蒸水补足20yl反应体系。阴性模板对照加无菌双蒸水。20yl 反应体系见表1。
[0094] 表1 20yl PCR反应体系
[0096] (6)本发明优先选用PCR扩增条件:PCR扩增条件为：95°C10min;95°C10s，60°C， 35s，在此收集荧光信号，45个循环。
[0097] (7)标准曲线的制作:将驴和马的目标靶基因分别克隆到PMD18-T载体中，通过测 序筛选阳性克隆，目的基因阳性克隆测序进一步验证。驴和马的重组质粒标准品片段长度 为2950bp，紫外分光光度计检测重组质粒浓度，稀释到lng/ul，通过拷贝数计算公式：（6.02 X 1023) X (ng/ul X 10-9)/(DNA length X 660) = copies/ul计算得到lng/yl的重组质粒拷 贝数为3.09X 108c〇PieS。按照10倍体积梯度稀释作为标准模板（10 7~104拷贝Ail)。依照上 述荧光定量PCR体系和PCR扩增条件(步骤5和6)与待测样本同时进行定量PCR扩增。反应结 束后，根据各个浓度梯度的Ct值和浓度值绘制荧光定量PCR标准曲线。根据待测样本的Ct值 和标准曲线计算出样本中含驴源和马源基因拷贝数，进而推算驴源和马源所占百分含量。 [0098] (8)阿胶样品中驴源和马源百分比含量计算:标准曲线的计算公式:y驴=_3.325x+ 32.761江€€%=99.884，1?2 = 0.986)，驴的标准曲线见图4扩，扩增曲线见图6;7马=-3.197叉 +30.994(Eff% = 105.473，R2 = 0.983)马的标准曲线见图5,扩增曲线见图7,通过标准曲线 及待测样本Ct值即可计算出待测样本含有马源性及驴源性拷贝数。
[0099] 实施例2特异性验证
[0100] 利用所设计的引物及探针，分别以牛、猪、马、驴、骡子、山羊、绵羊、兔、鱼、鸡、鸭、 狗、骆驼、水貂及狐狸等动物的总基因组DNA为模板，进行实时荧光定量PCR检测，验证引物 及探针的特异性。其结果见表2,结果表明本发明所设计的引物及探针具有很强的特异性。
[0101] 表2特异性验证实验
[0104] 实施例3灵敏度实验
[0105] 按照驴皮中掺入5%〇、1%、2%、5%，10%，20%，50%的马皮混匀（质量比），提取 DNA，利用本发明体系进行多重实时荧光定量PCR检测，评估本发明的检测限，结果表明本方 法定量检测限为1%，见【附图说明】图8。
[0106] 实施例4模拟掺假定量检测
[0107] 按照驴皮中掺入0 %、1 %、2%、5%、10 %、20%、50%和100 %的比例掺入马皮，按 照本专利所述定量方法进行定量检测，设5个平行试验，结果见表3，结果显示含有马源成分 越低如1%、2%时，定量相对误差值越大，随着马源百分比含量的增加相对误差值减小，造 成误差的原因可能是操作误差或检测误差，实际混合比例和检测混合比例结果基本符合， 验证了本发明的定量方法的可行性。
[0108] 表3混合样本驴和马源成分定量检测
[0111] 实施例5阿胶胶液样品的定量检测
[0112] 按照不同的掺入比例，驴皮中分别掺入0%、1%、5%、10%、20%、50%的马皮进行 实验室阶段的熬制，完全按照生产过程进行模拟，在化皮阶段取样，该步骤供试样本由山东 国胶堂阿胶药业有限公司提供，由本实验室以未知样本处理，提取DNA，每个样品设5个平行 试验，通过标准曲线法对阿胶中驴、马源性进行定量分析，实验结果见表4，结果表明马皮实 际掺入比例与定量检测结果基本一致，进一步验证了本发明的定量方法的可行性。
[0113]表4实际阿胶样品检测
[0116] 备注:样品编号为1-6为化皮阶段不同掺假比例阿胶样本
[0117] 上述虽然结合实施例对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护 范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员 不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
【主权项】
1. 一种阿胶胶液半成品或成品中驴、马源性成分的定量检测方法，其特征在于， 根据驴和马看家基因单拷贝基因，设计引物及探针，提取待测样品DNA，采用TaqMan qPCR的方法对阿胶胶液半成品或成品进行驴源或马源成分定量检测，根据标准曲线和待测 样本的Ct值计算阿胶胶液单位质量中驴和马源核基因的拷贝数，计算出阿胶中驴源和马源 所占比例，进而对阿胶样品驴源或马源成分定量。2. 根据权利要求1所述的阿胶胶液半成品或成品中驴、马源性成分的定量检测方法，其 特征在于，所述看家基因为驴和马的特征基因 LHB基因。3. 根据权利要求1所述的阿胶胶液半成品或成品中驴、马源性成分的定量检测方法，其 特征在于，所述引物为驴和马通用引物，所述探针为驴、马特异性探针，序列分别如下： (1) 驴和马通用引物： UF: 5 ' -TGGACCCCATGGTCTCCTTC-3 '，如SEQ NO · 1所示； UR: 5 ' -CAGGAGTTGGGGTGGATGTG-3 '，如 SEQ NO · 2所示； (2) 驴、马特异性探针： 驴特异探针： Equus asinus-Probe:P:5'CGGGGGTCCCAGAGACCACC 3'，如SEQ N0.3所示； 马特异探针： Equuscaballus-Probe:5'CTGCCAGATCAAGACCACTGACTGC3'JnSEQN0.4K*; 其中，所述驴、马特异性探针的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，所述报告 基团为?六1、冊父、了六11^、1?(^、0￥5中的任一种，所述淬灭基团为〇31^71、8即1、8即2中的任一 种。4. 根据权利要求1所述的阿胶胶液半成品或成品中驴、马源性成分的定量检测方法，其 特征在于，所述提取阿胶样品DNA为使用专利号为CN. 201410317118.7的专利公开的方法提 取。5. 根据权利要求1所述的阿胶胶液半成品或成品中驴、马源性成分的定量检测方法，其 特征在于，所述标准曲线的制作具体为:将驴和马的目标靶基因分别克隆到PMD18-T载体 中，通过测序筛选阳性克隆，分别取已知浓度的驴、马阳性克隆质粒作为标准样，按照10倍 体积梯度稀释作为标准模板，标准模板与待测样品DNA同时进行定量PCR扩增，反应结束后， 根据各个浓度梯度的Ct值和浓度值绘制荧光定量PCR标准曲线。6. 根据权利要求5所述的阿胶胶液半成品或成品中驴、马源性成分的定量检测方法，其 特征在于，所述PCR扩增体系为:含TaqMan reaction Mix(2x) 10μ1，驴特异探针0.2~0.5μ Μ，马特异探针0.2~0.5μΜ，驴和马通用引物正反向序列均为0.5yM，R0X参比荧光50χ 0.4μ 1，待测样本总DNA2yl，用双蒸水补足20μ1反应体系；所述PCR扩增条件为:95°C lOmin; 95°C 10s，60°C，35s，在此收集荧光信号，45个循环。7. 根据权利要求5或6所述的阿胶胶液半成品或成品中驴、马源性成分的定量检测方 法，其特征在于，所述PCR扩增阶段反应需在至少2通道型号的荧光定量PCR仪上进行。8. -种阿胶胶液半成品或成品中驴、马源性成分的定量检测引物、探针组合物，其特征 在于，包括以下引物、探针： (1)驴和马通用引物： UF: 5 ' -TGGACCCCATGGTCTCCTTC-3 '，如SEQ NO · 1所示； UR: 5 ' -CAGGAGTTGGGGTGGATGTG-3 '，如 SEQ NO · 2所示； (2)驴、马特异性探针： 驴特异探针： Equus asinus-Probe:P:5'CGGGGGTCCCAGAGACCACC 3'，如SEQ N0.3所示； 马特异探针： Equuscaballus-Probe:5'CTGCCAGATCAAGACCACTGACTGC3'JnSEQN0.4K*; 其中，所述驴、马特异性探针的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，所述报告 基团为?六1、冊父、了六11^、1?(^、0￥5中的任一种，所述淬灭基团为〇31^71、8即1、8即2中的任一 种。9. 一种阿胶胶液半成品或成品中驴、马源性成分的定量检测试剂盒，其特征在于，包括 权利要求8所述引物、探针组合物以及荧光PCR反应所需试剂。10. 根据权利要求9所述胶胶液半成品或成品中驴、马源性成分的定量检测试剂盒，其 特征在于，所述荧光PCR反应体系为为20μ1，所需试剂包括含TaqMan reaction Μ?χ(2χ)10μ 1，驴特异探针0.2~0.5μΜ，马特异探针0.2~0.5μΜ，驴和马通用引物正、反向序列均为0.5μ M，R0X参比荧光50χ 0.4μ1，待测样本总DNA2yl，双蒸水。
【文档编号】C12Q1/68GK105821129SQ201610272708
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月28日
【发明人】步迅, 张全芳, 刘艳艳, 范阳阳
【申请人】山东省农业科学院生物技术研究中心