0045]将少量固体GshF酶溶解，配成lmg/ml的溶液，使用现有技术记载的公知的测定GshF酶活性的方法，检测到GshF酶活性约为50U，其中将1 μ Μ底物在1分钟内完全转化定义为1个活性单位(U)。
[0046]实施例4
[0047](1)取含有GshF酶的菌体溶于水中，菌体浓度约为100g/L，高压均质破碎。
[0048](2)使用氨水调节破碎后酶液的pH值至8.0，40°C放置10分钟后，再使用磷酸将酶液pH值调至4.0，离心去除沉淀。
[0049](3)在酶液中加入0.005M硫酸亚铁和0.005M硝酸钙，40°C放置15分钟后，离心除去沉淀杂质；
[0050](4)最后调节pH值至8.0，再加入(λ 05Μ氯化锰及(λ 005Μ氯化锌，40°C放置15分钟后，离心收集沉淀，即为GshF酶。
[0051]将少量固体GshF酶溶解，配成lmg/ml的溶液，使用现有技术记载的公知的测定GshF酶活性的方法，检测到GshF酶活性约为150U，其中将1 μ Μ底物在1分钟内完全转化定义为1个活性单位(U)。
[0052]实施例5
[0053](1)取含有GshF酶的菌体溶于水中，菌体浓度约为100g/L，高压均质破碎。
[0054](2)在粗提液中加入饱和度2%的硫酸铵，离心去除沉淀。
[0055](3)在酶液中加入0.2M氯化钴，40°C放置5分钟后，离心除去沉淀杂质；
[0056](4)最后调节pH值至5.0，再加入0.2M氯化铜，40°C放置5分钟后，离心收集沉淀，即为GshF酶。
[0057]将少量固体GshF酶溶解，配成lmg/ml的溶液，使用现有技术记载的公知的测定GshF酶活性的方法，检测到GshF酶活性约为60U，其中将1 μ Μ底物在1分钟内完全转化定义为1个活性单位(U)。
[0058]实施例6
[0059](1)取含有GshF酶的菌体溶于水中，菌体浓度约为100g/L，高压均质破碎。
[0060](2)在粗提液中加入饱和度30%的硫酸铵，离心去除沉淀。
[0061](3)在酶液中加入0.2M氯化钴和0.05M氯化镁，40°C放置20分钟后，离心除去沉淀杂质；
[0062](4)最后调节pH值至7.0，再加入0.2M氯化锌，40°C放置20分钟后，离心收集沉淀，即为GshF酶。
[0063]将少量固体GshF酶溶解，配成lmg/ml的溶液，使用现有技术记载的公知的测定GshF酶活性的方法，检测到GshF酶活性约为50U，其中将1 μ Μ底物在1分钟内完全转化定义为1个活性单位(U)。
[0064]实施例7
[0065](1)取含有GshF酶的菌体溶于水中，菌体浓度约为100g/L，高压均质破碎。
[0066](2)在粗提液中加入饱和度15%的硫酸铵，离心去除沉淀。
[0067](3)在酶液中加入0.05M氯化亚铁，40°C放置10分钟后，离心除去沉淀杂质；
[0068](4)最后调节pH值至5.0，再加入0.1M氯化铜和0.1M氯化猛，40°C放置5分钟后，离心收集沉淀，即为GshF酶。
[0069]将少量固体GshF酶溶解，配成lmg/ml的溶液，使用现有技术记载的公知的测定GshF酶活性的方法，检测到GshF酶活性约为125U，其中将1 μ Μ底物在1分钟内完全转化定义为1个活性单位(U)。
[0070]本发明的双功能谷胱甘肽合成酶的纯化方法的纯化前后的结果可参见图2。如图2所示，泳道1为蛋白标志物14.4-116kDa(购于北京中科瑞泰生物技术有限公司)；泳道2为含GshF酶的菌体，GshF酶约85kDa ;泳道3为酸碱沉淀后的GshF酶；泳道4为钙离子沉淀后的GshF酶；泳道5为纯化后的GshF酶。
[0071]本发明的双功能谷胱甘肽合成酶的纯化方法，与传统的使用超滤、离子交换层析、凝胶筛层析等方法提纯同样量的蛋白相比，其更加简单，易于操作，耗时短、成本低，且该方法制备的GshF不溶于水，可重复使用，更加适用于工业化大规模生产GshF。
[0072]虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。
【主权项】
1.一种双功能谷胱甘肽合成酶的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)制备含双功能谷胱甘肽合成酶的粗提液； (2)向粗提液中加入浓度为0.001M-0.5M的二价金属离子进行沉淀，去除沉淀，得上清液； (3)将上清液的pH值调节至4-9，再加入浓度为0.005M-0.4M的二价金属离子铜离子(Cu2+)、锰离子(Mn2+)或锌离子(Zn2+)的一种或几种进行沉淀，收集沉淀即为双功能谷胱甘肽合成酶。2.根据权利要求1所述的双功能谷胱甘肽合成酶的纯化方法，其特征在于，所述粗提液的制备方法为:将含双功能谷胱甘肽合成酶的菌体溶于水中进行破碎处理，破碎后进行初沉淀，去除沉淀，得到含双功能谷胱甘肽合成酶的粗提液。3.根据权利要求2所述的双功能谷胱甘肽合成酶的纯化方法，其特征在于，所述初沉淀的方法为酸碱沉淀或饱和度2-30%的硫酸铵沉淀。4.根据权利要求3所述的双功能谷胱甘肽合成酶的纯化方法，其特征在于，所述酸碱沉淀的方法为先将粗酶液的pH值调至7-9后，再调节pH值至3-7，去除沉淀；或先将粗酶液的pH值调至3-7后，再调节pH值至7-9，去除沉淀。5.根据权利要求4所述的双功能谷胱甘肽合成酶的纯化方法，其特征在于，所述酸选自于盐酸、磷酸、硫酸或醋酸的一种或几种，所述碱选自于氢氧化钾、氢氧化钠、氨水、Tris或三乙醇胺的一种或几种。6.根据权利要求1所述的双功能谷胱甘肽合成酶的纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)的破碎处理为高压均质破碎、酶解破碎、冷冻破碎或超声破碎。7.根据权利要求1所述的双功能谷胱甘肽合成酶的纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)中的二价金属离子选自于钙离子(Ca2+)、镁离子(Mg2+)、铁离子(Fe2+)、钴离子(Co2+)、镉离子(Cd2+)或镍离子(Ni2+)的一种或几种。8.根据权利要求1或7所述的双功能谷胱甘肽合成酶的纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)和步骤(3)中的二价金属离子均选自于可溶性盐或可溶性盐的水合物中的一种或几种。9.根据权利要求8所述的双功能谷胱甘肽合成酶的纯化方法，其特征在于，所述可溶性盐为硫酸盐、磷酸盐、醋酸盐、硝酸盐或氯化盐。10.根据权利要求1-9任一权利要求所述的双功能谷胱甘肽合成酶的纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)至步骤(3)的操作温度为4°C -40°c。
【专利摘要】本发明公开了一种双功能谷胱甘肽合成酶的纯化方法，包括以下步骤：(1)制备含双功能谷胱甘肽合成酶的粗提液；(2)向粗提液中加入浓度为0.001M-0.5M的二价金属离子，去除沉淀，得上清液；(3)将上清液的pH值调节至4-9，再加入浓度为0.005M-0.4M的二价金属离子铜离子(Cu2+)、锰离子(Mn2+)或锌离子(Zn2+)的一种或几种，收集沉淀，该沉淀即为双功能谷胱甘肽合成酶。本发明的纯化方法更加简单，易于操作，耗时短、成本低，且该方法制备的GshF不溶于水，可重复使用，更加适用于工业化大规模生产GshF。
【IPC分类】C12N9/00
【公开号】CN105274065
【申请号】CN201510760401
【发明人】于铁妹, 刘珊珊, 秦永发
【申请人】深圳市古特新生生物科技有限公司
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年11月10日