高滴度hiv-1毒种的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其高滴度HIV-ι毒种的制备方法。
【背景技术】
[0002] 人类免疫缺陷病毒（Humanimmunodeficiencyvirus,HIV)是引起人获得性免疫 缺陷综合征（Acquiredimmunodeficiencysyndrome，AIDS)的病原体，自1981年在美国首 次诊断以来，艾滋病在全球范围内迅速传播。中国艾滋病的流行已有30年，截止2014年12 月底，全国累计报告存活的HIV感染者/艾滋病患者500679例，估计实际有存活的HIV感 染者810000例。
[0003] HIV的传播途径包括血液传播、性传播和母婴传播。血液传播是最早确定的HIV的 传播途径之一，世界很多国家都发生过艾滋病病毒经血和血液制品传播的事件，如通过临 床用血或血友病患者使用麗因子等。我国最早发现的HIV感染者就是因使用麗因子而感染 HIV的血友病患者，上世纪90年代初中期我国中部农村还发生了因单采血浆而导致的HIV 在有偿供血献血员中的爆发流行。目前尽管已经对采供血进行了严格的管理、对献血员进 行了严格的检测，但窗口期经血传播HIV的事件仍时有发生。预防和控制HIV的经血传播 始终是艾滋病防治的重要任务。《中国遏制与防治艾滋病"十二五"行动计划》将"加强血液 安全管理、预防HIV医源性传播"作为主要防控措施之一，要求"加强对采供血和血液制品 生产的全程监督与管理"、"加强对医疗卫生机构临床合理用血和院内感染控制的培训与管 理，完善并落实预防艾滋病医源性传播的工作制度和技术规范"。
[0004] 按照国家要求，所有临床使用的血液（生物）制品及植入性医疗器械的生产工艺 都要包含病毒灭活的步骤，对灭活的效果需要进行验证。国家食品药品监督管理局（CFDA) 《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》（国药监注[2002]160号）要求， "为了提高血液制品的安全性，生产工艺要具有一定的去除/灭活部分病毒的能力，生产 过程中应有特定的去除/灭活病毒的方法"，对这些方法的效果应进行验证。病毒降低量 (log)多4.Olog表示去除/灭活病毒有效。《无源植入性和动物源性医疗器械注册申报资 料指导原则》（食药监办械函[2009] 519号）要求，对于动物源性医疗器械，需要增加涉及 控制病毒和/或传染性病原体感染以及免疫原性风险方面的有关的技术内容。提供"生产 过程中灭活和去除病毒和/或传染病病原体工艺过程的描述以及有效性验证的数据"。
[0005] 拟证明处理后病毒降低量（log)彡4.Olog，病毒的初始滴度要达到6.Olog，加上 测定病毒滴度必不可少的取样和稀释，病毒的初始滴度至少要达到8.Olog。此外，制备诊 断用HIV裂解抗原和HIV检测的质控品、评价抗HIV药物的活性以及其他艾滋病防治研究 也需要获得高滴度的HIV培养上清液。而一般条件下培养HIV-1滴度最高只能达到5.Olog， 难以满足病毒灭活验证和制备HIV-1抗原及质控品的需要。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种培育HIV-1毒液的方法。
[0007] 本发明提供的方法，包括如下步骤：
[0008] 1)去除靶细胞培养体系中的支原体，得到处理后靶细胞悬液；
[0009] 2)HIV-1毒种接种到所述处理后靶细胞悬液中，孵育培养，收集培养上清液，得到 培育后HIV-1毒液。
[0010] 上述方法中，所述去除靶细胞培养体系中的支原体为在靶细胞培养过程中加入去 支原体抗生素。
[0011] 上述方法中，所述在靶细胞培养中加入去支原体抗生素包括如下步骤:A、将靶细 胞在含体积百分含量10 %血清和37. 5μg/ml去支原体抗生素的细胞培养液培养；B、将经 过A培养的靶细胞在含体积百分含量10%血清和25μg/ml去支原体抗生素的细胞培养液 继续培养，得到处理后靶细胞悬液，实现除靶细胞培养中的支原体。
[0012] 上述方法中，A中，所述培养为每3天传代一次，培养3周；
[0013] B中，所述继续培养的时间为1周。
[0014] 上述方法中，步骤2)中，所述HIV-1毒种和所述处理后靶细胞悬液中细胞的Μ0Ι 为 0.2 ;
[0015] 所述处理后靶细胞悬液中细胞含量为5X105个/ml。
[0016] 上述方法中，在所述孵育培养中还包括向培养体系中进行交替补液和补细胞的步 骤，使培养体系中的血清含量逐渐升高；所述培养体系为反应容器中所有物质。
[0017] 上述方法中，所述交替补液和补细胞包括如下步骤：
[0018] 1)在接种后6小时，进行补液；
[0019] 2)在接种后第3天，进行补细胞；
[0020] 3)在接种后第5天，进行补液；
[0021] 4)在接种后第7天，进行补细胞；
[0022] 5)在接种后第9天，进行补液；
[0023] 6)在接种后第11天，进行补细胞；
[0024] 7)在接种后第13天，进行补液；
[0025] 将每次补液或每次补细胞前体系记作初始培养体系，每次补液或每次补细胞后体 系记作补充后培养体系；
[0026] 在所述接种后6小时、所述接种后第5天、所述接种后第9天进行补液为均向各 自初始培养体系中加入含胎牛血清和去支原体抗生素的细胞培养液，得到补充后培养体 系，使所述胎牛血清在各自所述补充后培养体系中的体积百分含量均为5 %、所述去支原体 抗生素在各自所述补充后培养体系中的浓度均为12. 5μg/ml;
[0027] 在所述接种后第13天进行补液为向初始培养体系中加入含胎牛血清和去支原体 抗生素的细胞培养液，得到补充后培养体系，使所述胎牛血清在所述补充后培养体系中的 体积百分含量为10 %、所述去支原体抗生素在所述补充后培养体系中的浓度为12. 5μg/ ml；
[0028]在所述接种后第3天、所述接种后第7天进行补细胞均为将各自初始培养体系的 上清液与含胎牛血清和去支原体抗生素的细胞悬浮液混匀，得到补充后培养体系，使所述 胎牛血清在各自所述补充后培养体系中的体积百分含量均为5 %、所述去支原体抗生素在 各自所述补充后培养体系中的浓度均为12. 5μg/ml，所述细胞悬浮液中细胞在各自所述补 充后培养体系中的含量均为4X106个/ml;
[0029] 在所述接种后第11天进行补细胞为将初始培养体系的上清液与含胎牛血清和去 支原体抗生素的细胞悬浮液混匀，得到补充后培养体系，使所述胎牛血清在所述补充后培 养体系中的体积百分含量为8%、所述去支原体抗生素在各自所述补充后培养体系中的浓 度为12. 5μg/ml，所述细胞悬浮液中细胞在各自所述补充后培养体系中的含量为4X106个 /ml；
[0030] 所述细胞悬浮液由细胞和所述含胎牛血清和去支原体抗生素的细胞培养液组 成；
[0031] 将接种当天记作第1天；
[0032] 所述上清液和所述细胞悬浮液的体积比为1:39。
[0033] 上述方法中，所述收集培养上清液的时间为接种后第14天。
[0034] 上述方法中，所述血清为胎牛血清，所述细胞培养液为RPMI1640培养基；所述细 胞为MT4细胞，所述HIV-1毒种为HIV-1IIIB。
[0035] 由上述方法培育的HIV-1毒液也是本发明保护的范围，所述HIV-1毒液的滴度为 9. 50-10. 501og。
[0036] 本发明对以上通用的HIV-1培养方法进行了改进：（1)改进靶细胞的培养：用去支 原体抗生素（Plasmocin?Treatment)处理革E细胞中的支原体。做法是用含37. 5μg/ml去 支原体抗生素的RPMI1640培养液培养细胞3周，每3天传代处理；然后将去支原体抗生素 的终浓度调整为25μg/ml继续培养1周；在病毒培养的过程中，去支原体抗生素的浓度维 持在12. 5μg/ml。倒置显微镜下观察，根据细胞的形态、透光度及背景洁净度等判断细胞状 态，且经PCR检测，培养上清液中的支原体核酸为阴性；(2)改进接种和起始培养技术：将培 养起始细胞数由原来的IX1〇6个降低到5X10 5个，将RPMI1640培养基中添加的胎牛血清 浓度由10%降低到5%。病毒与细胞的孵育体系由10ml减少为2ml，孵育时间由4小时延 长到6小时。（3)延长接种病毒后的培养时间：由原来的7天延长到14天；（4)建立"细胞 /液体交替补充/更换"的培养模式：在培养的第3天补充细胞（将0. 5ml细胞-病毒悬液 加到1X106个细胞29. 5ml5 %牛血清细胞培养基中）、第5天更换液体（吸弃10ml上清补 充10ml5 %牛血清细胞培养基）、第7天补充细胞（将0. 5ml细胞-病毒悬液加到1X106 个细胞29. 5ml5 %牛血清细胞培养基中）、第9天更换液体（吸弃10ml上清、补充10ml5 %牛 血清细胞培养基）、第11天补充细胞（将lml细胞-病毒悬液加到4X106个细胞39ml8 % 牛血清细胞培养基中）、第13天补充液体（补充10ml10%牛血清细胞培养基），第14天离 心、收集病毒上清、滴定、分装保存。（5)改进病毒释放技术，收获的病毒培养上清液不是按 照一般的方法冻融3次，而是直接进行滴定和分装保存。
[0037] 上述HIV-1毒株为HIV-1IIIB国际标准株，由美国引进。
[0038] 上述HIV-1培养指的是在细胞培养瓶中（规格为25cm2\75cm2)加入处于对数生长 期的MT4细胞10ml，再加入HIV-1毒种0.lml，37°C、5%C02条件下置于孵箱中培养。
[0039] 上述HIV-1滴度指的是用Reed-Muench方法滴定和计算获得的病毒