一种建立肝细胞癌顺铂耐药细胞株的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学技术领域，涉及一种肝细胞癌顺钼耐药细胞株的建立方法。
【背景技术】
[0002] 原发性肝癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在恶性肿瘤中排名第 六，死亡率则居第三，且大多数肝癌患者诊断时已是中晚期，术后频频复发转移，导致肝癌 患者的预后较差。化疗是治疗肝癌的重要手段之一，但化疗中常出现且难以解决的是肿瘤 多药耐药性（multidrugresistance,MDR)，即肿瘤同时对多种结构和作用机制不同的化学 药物产生交叉耐药，它是化疗失败的主要原因。因此克服肿瘤多药耐药性以及防止或逆转 肿瘤多药耐药的发生对于提高化疗效果十分重要。而建立肿瘤耐药细胞株对于研究肿瘤耐 药机制、肿瘤细胞耐药性逆转、开发及评价新药等具有重要的应用价值。
[0003] 顺钼（cis-diaminedichloroplatinum，Q)DP)属细胞周期非特异性药物，具有细 胞毒性，可抑制癌细胞的DNA复制过程，并损伤其细胞膜上结构，有较强的广谱抗癌作用， 为临床治疗肝癌常用药物。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种肝细胞癌顺钼耐药细胞株，本发明的另一目的是提供 该耐药细胞株的构建方法。
[0005] 本发明的主要技术方案是以人肝细胞癌细胞株LM3为诱导对象，设立顺钼浓度梯 度，寻找最大耐药浓度，即、细胞可以存活并缓慢生长的浓度，并以此浓度长期刺激细胞4 个月以上，最终获得人肝细胞癌顺钼耐药细胞株LM3/CDDP细胞株。
[0006] 本发明提供了一种肝细胞癌顺钼耐药细胞株的构建方法如下：
[0007] (1)取人肝癌细胞LM3细胞复苏后用DMEM培养液，于37°C，5%C02培养箱中培 养；
[0008] (2)为找寻最适宜顺钼刺激浓度，取对数生长期LM3细胞种于24孔板中，分别加 入 0· 1μg/mL、0. 25μg/mL、0. 5μg/mL、lμg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL顺钼，适时传 代或换液。
[0009] 每次传代或换液时，均加入相应浓度顺钼。以顺钼加入后细胞可以存活并缓慢生 长的最大耐药浓度作为筛选浓度。
[0010] 当顺钼的浓度为0. 5μg/mL时LM3细胞可以存活但生长非常缓慢；浓度小于 0. 5μg/mL时LM3细胞不但可以大量存活，还能较快生长；浓度大于0. 5μg/mL时LM3细胞 全部死亡。因此，我们确定筛选浓度为0. 5μg/mL，并用该筛选浓度继续长期刺激细胞4个 月，最后筛选到能在〇. 5μg/mL顺钼刺激下快速生长的LM3耐药细胞，其最大耐药浓度可达 3μg/mL〇
[0011] 本发明还提供了一种根据上述构建方法获得的肝细胞癌顺钼耐药细胞株。
[0012] 本发明提供了一种肝细胞癌顺钼耐药细胞株，该细胞株的构建方法如下：
[0013] 复苏人肝癌细胞株LM3细胞后，用含10%胎牛血清的DMEM培养液，于37°C，5% C02培养箱中培养；取对数生长期的人肝癌细胞株LM3细胞接种于培养孔中；在培养孔中加 入顺钼至终浓度为0. 5μg/mL,适时传代或换液；每次传代或换液之后，均加入顺钼至终浓 度为0. 5μg/mL，连续培养3个月以上；筛选到仍能快速生长的人肝癌细胞株LM3细胞即为 顺钼耐药细胞株。
[0014] 本发明所述的顺钼耐药细胞株是在0. 5μg/mL顺钼刺激4个月后，仍能快速生长 的人肝癌细胞株LM3细胞。
[0015] 本发明所述的顺钼耐药细胞株的最大耐药浓度为3μg/L。
[0016] 本发明所述的顺钼耐药细胞株命名为LM3/⑶DP。
[0017] 本发明通过细胞形态学观察、生长曲线测定、细胞周期的测定和划痕实验，评价肝 癌耐药株LM3/⑶DP的生物学特性，成功建立LM3/⑶DP耐药株。
[0018] 本发明还提供了肝癌顺钼耐药细胞株LM3/CDDP在筛选抗肿瘤药物中的应用。
[0019] 本发明还提供了肝癌顺钼耐药细胞株LM3/CDDP在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0020] 发明作用与效果
[0021 ] 本发明的建立肝细胞癌顺钼耐药细胞株的方法简便易行，本发明可用于分析肝癌 细胞顺钼耐药后的形态学及生物学表型的变化；研究肿瘤对顺钼耐药的分子机制和逆转肿 瘤耐药的方法及筛选其他抗肿瘤药物；发现肿瘤耐药标志物以及筛选和评估新型抗肿瘤药 物等，具有较高的科研和生产应用价值。
【附图说明】
[0022] 图1是肝癌耐药株LM3/⑶DP细胞的诱导建立验证图；
[0023] 图2是光学显微镜下LM3和LM3/⑶DP细胞的细胞形态；其中a是LM3,b是LM3/ S0RA；
[0024] 图3是LM3和LM3/CDDP细胞生长曲线图；
[0025] 图4是LM3和LM3/CDDP细胞细胞周期；
[0026] 图5是LM3和LM3/⑶DP细胞的划痕实验图；
[0027] 图6是LM3和LM3/CDDP细胞中P-gpmRNA含量图；以及
[0028] 图7是LM3和LM3/CDDP细胞索拉非尼（Sorafenib)刺激后的生长曲线图。
【具体实施方式】
[0029] 以下通过实施例进一步说明本发明，
[0030] 以下通过实施例进一步说明本发明，但本发明的实施不仅限于此。
[0031] 实施例所用的人肝癌细胞LM3细胞，以下简称LM3细胞，购自中科院；实施例所用 的顺钼为市售的Selleck Chemicals公司的50mg规格的产品。
[0032] 各附图中的LM3C0N表示以正常LM3细胞作为对照组，LM3⑶DP表示肝癌耐药株 LM3/CDDP。
[0033]〈实施例一〉
[0034] 肝癌耐药株LM3/⑶DP细胞的诱导建立方法
[0035] (1)取LM3细胞复苏后用DMEM培养液，于37°C，5%C02培养箱中培养；
[0036] (2)为找寻最适宜顺钼刺激浓度，取对数生长期LM3细胞种于24孔板中，分别加入 0. 1μg/L、0. 25μg/L、0. 5μg/L、lyg/L、2yg/L、5yg/L、10yg/L顺钼，适时传代或换液。 每次传代或换液时，均相应加入各浓度化疗药。以化疗药加入后细胞可以可以存活并缓慢 生长的最大浓度为最佳浓度。本实施例中所指的长期生长指的是3个月以上的生长时间。
[0037] 实验结果显示：当顺钼的浓度为0. 5 μ g/mL时LM3细胞可以存活但生长非常缓慢； 浓度小于〇.5 μ g/mL时LM3细胞不但可以大量存活，还能较快生长；浓度大于0. 5 μ g/mL时 LM3细胞全部死亡。因此，我们确定筛选浓度为0. 5 μ g/mL。
[0038] (3)用最佳浓度0. 5μg/L长期刺激细胞4个月，得到顺钼耐药细胞株。用该细胞与 同期培养的LM3细胞，细胞计数后，种于24孔板，每孔种5X104个细胞，24小时后加入浓度 梯度的顺钼（〇. 5~15μg/L)，96小时后拍照。所得到的耐药细胞如图1所示。LM3/⑶DP 细胞与LM3细胞相比在3μg/mL浓度时仍能生长代谢，培养基颜色变黄，说明LM3/CDDP细 胞有较好的的耐药性（各数字表示所用顺钼浓度，单位μg/mL)。LM3/CDDP细胞的最大耐 药浓度可达3μg/mL。
[0039]〈实施例二〉
[0040] 肝癌耐药株LM3/⑶DP细胞的形态学观察
[0041] 使用倒置相差显微镜观察活细胞形态：分别取对数生长期的LM3细胞和LM3/⑶DP 细胞，生理盐水清洗换液后，在倒置显微镜放大倍数200倍下观察活细胞形态。如图2 (a) 所示，通过光镜可以观察到LM3细胞大小基本一致，多伪足样多角形，部分为圆形。而如图 2(b)所示，通过光镜可以观察到LM3/CDDP细胞大小不一，有圆形与多角形，且多角形形态 各异。
[0042]〈实施例三〉
[0043] 肝癌耐药株LM3/⑶DP细胞的生长曲线测定
[0044] 取对数生长期的LM3、LM3/⑶DP细胞，用0. 5%胰酶消化并计数，按每孔5000个细 胞的密度接种入96孔板并设3个复孔，每孔再各加200μL培养基，放置于37°C，5%C02培 养箱中培养。分别于〇h，24h，48h，72h以及96h各时间点吸除培养基，每孔各加100μLCCK8 工作液，在培养箱中培养1小时后，放入酶标仪以570nm波长检测，读出每孔的0D值并计算 平均值，以时间为横坐标、0D值平均值为纵坐标，绘制成生长曲线。
[0045] 结果如图3所示。LM3、LM3/⑶DP的生长曲线图，结果如图3所示。经过多天连 续测两细胞生长曲线发现，两细胞生长曲线形态相似，结果如图3所示，且顺钼耐药细胞株 LM3/⑶DP较正常肿瘤细胞株LM3的增殖速度更快，并在培养至96小时时曲线仍然向上，而 此时正常肿瘤细胞株LM3/C0N的生长曲线趋于平缓，显示耐药细胞LM3/CDDP具有很好的耐 药性。
[0046]〈实施例四〉
[0047] 检测细胞周期
[0048] 将LM3、LM3/CDDP细胞分别种于6孔板中，(λ1%FBSDMEM同步化12h，换为10% FBSDMEM培养基，在相应时间点收集细胞，吸去培养基，用0. 5%的胰酶、ImMEDTA的消化缓 冲液消化细胞，用70%的乙醇固定细胞，置4°C保存待测。至流式细胞仪分析之前，置于离 心机中在l〇〇〇g，即、1000倍重力加速度的条件下，离心lOmin，去除固定液。使用碘化丙陡 (PI)染色。立即上流式细胞仪分析，细胞周期