一种治疗支气管哮喘的人体气道上皮细胞的培养方法
【技术领域】
[0001]本发明公开了一种治疗支气管哮喘的人体气道上皮细胞的培养方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]哮喘是一种气道慢性炎症性疾病，表现为反复发作性的喘息、气促、胸闷、咳嗽等症状，常在夜间和清晨发作加剧。患者讲话发音难以连续，严重者甚至不能讲话。多数患者经治疗可以缓解，但遇到诱发因素，又会反复发作。哮喘多在婴幼儿时期发病，因为不能根治，慢慢转变成慢性病、多发病，此病还会伴随患者终生。其诱发病因十分复杂:有环境污染、气候变化异常、呼吸道疾病、接触物过敏、食物药品过敏、体质弱免疫力低、遗传等等。
[0003]支气管哮喘常伴有气道的结构重塑，其典型特征之一是气道上皮下成纤维细胞活动增强所产生的基膜增厚、气道顺应性降低，导致持久性气道阻力增高，发生难以逆转的通气功能损坏。气道重塑的机制目前仍不清楚，因此在临床上难以获得有效的防治方法，所以探讨一种人体气道上皮细胞的培养方法是非常有意义的。目前，气道上皮细胞的培养方法主要有:胰酶和/或蛋白酶消化结合机械剥离粘膜法和/或机械刮刷法，这些方法都存在以下缺点:(1)机械剥离粘膜法/机械刮刷法是采用镊子等器械在气管或支气管上进行钝性分离，其操作难度大，且在剥离过程中容易损伤上皮细胞，获得的存活细胞少，且细胞活力差。(2)胰酶消化/蛋白酶消化法是采用胰酶/蛋白酶溶液对气管或支气管进行消化处理，以获得上皮细胞，但是胰酶/蛋白酶的消化力很强，且消化时间不易掌握，易对上皮细胞造成损失，细胞获得率少，细胞存活率低且活力差。另外，尚存在以下原因导致以人气道上皮细胞为来源的细胞培养受到限制:1.肺脏为一开放性脏器，因此获得的气道在进行细胞培养的过程中易发生污染，同时由于患者气道含有大量粘蛋白等渣滓而增加了细胞分离的难度；2.可用于分离气道上皮细胞的标本，都是从手术切除下来的具病灶的部位，标本数量有限，且标本中的正常的气管或支气管很少，如采用一般的气道上皮细胞培养方法，对细胞损伤大、获得率低再加上细胞贴附能力差，最后成活的细胞数量极少；3.气道上皮细胞原代培养中，最容易引进成纤维细胞污染，成纤维细胞生长快、活力好，具有生长优势，最终造成原代气道上皮细胞培养失败。
【发明内容】
[0004]本发明主要解决的技术问题:针对目前在人体气道上皮细胞的培养过程中，传统的机械剥离粘膜法操作难度大、容易损伤细胞，而胰酶消化难以控制，细胞存活率低且活力差，以及细胞培养的过程中易发生污染导致皮细胞培养失败的缺点，提供了一种治疗支气管哮喘的人体气道上皮细胞的培养方法。该方法首先取人体气管消化收集气道上皮细胞，并用异丙醇溶液洗净放入培养皿中去污，之后采用消化法进行消化后收集消化液，随后将消化液进行离心处理，取上清液并加入胎牛血清和A⑶E培养基混合后再次离心处理，得人体起到皮肤细胞培养基，最后将人体气道上皮肤细胞培养基接种在培养板上，培养后得一种治疗支气管哮喘的人体气道上皮细胞。该方法不仅操作简单易行，操作过程中不会有任何污染，而且不会损伤细胞，提高了细胞存活率。
[0005]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
[0006](1)取离体人气管或支气管，用消化培养基在3?5°C下消化30?32h后收集气道上皮细胞，之后用90?95%的异丙醇溶液分离清洗组织样品，然后将组织样品放入无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀去除组织样品中残留的脂肪；
[0007](2)将上述处理后的组织样品，采用密闭管腔消化法，用消化液对气道上皮细胞进行活性的去除血液和粘液，在37?38°C下消化5?15h，并不时动摇，使组织消化均匀、完全，之后收集处理后的消化液，所述的消化液为含胶原酶的IV培养基；
[0008](3)将上述得到后的消化液放入离心机中，以500?800r/min的转速，离心15?20min，之后取上清液，并加入10?15%的胎牛血清和A⑶E培养基，充分搅拌均匀，再放入离心机中，提高转速为550?850r/mn，离心10?15min后，取上清液获得人体气道上皮肤细胞培养基；
[0009](5)将上述得到的人体气道上皮肤细胞培养基，以2?5X 106细胞/mL的密度接种于消毒后的、铺有胶原蛋白和琼脂的培养板上，设置温度为35?37°C，在5?10% 0)2常氧环境下静置培养10?15天，即可获得一种治疗支气管哮喘的人体气道上皮细胞。
[0010]所述的IV、A⑶E培养基制作步骤为：
[0011](1)先在烧杯中倒入1L蒸馏水；
[0012](2)分别取10?12g肌醇、0. 05?0. 08g烟酸、0. 01?0. 03g盐酸硫胺素、30?50g鹿糖倒入至蒸馈水中，用搅拌棒充分搅拌溶解；
[0013](3)用可调动液器吸取0. 2mg吲哚乙酸放入上述溶液中；
[0014](4)将精密试纸或者酸度计调整pH至5. 7?5. 8 ;
[0015](5)称取6g琼脂粉倒入到上述配好的溶液中，放置在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉溶化为止；
[0016](6)稍微冷却后装入培养容器中，并且放入消毒灭菌锅灭菌20?30min ;
[0017](7)灭菌后从灭菌锅中取出培养基，等其冷却凝固即可。
[0018]本发明的应用方法是：当发生支气管肺癌、慢性支气管炎、支气管扩张、支气管狭窄时，可以通过取本发明所制得的人体气道上皮细胞进行研究，可将组织器官重建或再造，不仅使得细胞再造后存活率达到85%以上，而且对于基础和临床医学研究与应用有重大意义。
[0019]本发明的有益效果是：
[0020](1)本发明制备方法简便，技术稳定，没有污染；
[0021](2)安全可靠，在普通实验条件下即可开展，具有广泛的应用前景；
[0022](3)处理过程中不会对细胞有任何损伤，使得细胞的存活率高达90%以上。
具体实施方案
[0023]首先取离体人气管或支气管，用消化培养基在3?5°C下消化30?32h后收集气道上皮细胞，之后用90?95%的异丙醇溶液分离清洗组织样品，然后将组织样品放入无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀去除组织样品中残留的脂肪；随后将上述处理后的组织样品，采用密闭管腔消化法，用消化液对气道上皮细胞进行活性的去除血液和粘液，在37?38°C下消化5?15h，并不时动摇，使组织消化均匀、完全，之后收集处理后的消化液，所述的消化液为含胶原酶的IV培养基；接下来将上述得到后的消化液放入离心机中，以500?800r/min的转速，离心15?20min，之后取上清液，并加入10?15%的胎牛血清和A⑶E培养基，充分搅拌均匀，再放入离心机中，提高转速为550?850r/mn，离心10?15min后，取上清液获得人气道上皮肤细胞培养基；接下来将上述得到的人体气道上皮肤细胞培养基，以2?5X 106细胞/mL的密度接种于消毒后的、铺有胶原蛋白和琼脂的培养板上，设置温度为35?37°C，在5?10% C02常氧环境下静置培养10?15天，即可获得一种治疗支气管哮喘的人体气道上皮细胞。其中所述的IV、ACDE培养基制作步骤为首先在烧杯中倒入1L蒸馈水；然后分别取10?12g肌醇、0. 05?0. 08g烟酸、0. 01?0. 03g盐酸硫胺素、30?50g蔗糖倒入至蒸馏水中，用搅拌棒充分搅拌溶解；随后用可调动液器吸取0. 2mg吲哚乙酸放入上述溶液中；之后将精密试纸或者酸度计调整pH至5. 7?5. 8 ;接下来称取6g琼脂粉倒入到上述配好的溶液中，放置在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉溶化为止；稍微冷却后装入培养容器中，并且放入消毒灭菌锅灭菌20?30min ;最后灭菌后从灭菌锅中取出培养基，等其冷却凝固即可。
[0024]实例1
[0025]首先取离体人气管或支气管，用消化培养基在3°C下消化30h后收集气道上皮细胞，之后用90%的异丙醇溶液分离清洗组织样品，然后将组织样品放入无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀去除组织样品中残留的脂肪；随后将上述处理后的组织样品，采用密闭管腔消化法，用消化液对气道上皮细胞进行活性的去除血液和粘液，在37°C下消化5h，并不时动摇，使组织消化均匀、完全，之后收集处理后的消化液，所述的消化液为含胶原酶的IV培养基；接下来将上述得到后的消化液放入离心机中，以500r/min的转速，离心15