专利名称：具有il33n端结构域缺失的鼠炎症模型的制作方法
技术领域：
本发明涉及在IL-33基因的N端结构域中具有缺陷的非人动物。本文还提供所述非人动物作为炎性疾病的体内模型的用途，尤其是用在筛选抗炎化合物的方法中，和用于评估和优化给定的抗炎化合物的药理性质的方法。
背景技术：
白细胞介素33 (IL-33)细胞因子是白细胞介素I (IL-1)家族的最新成员。由于其细胞核定位，它最初被描述为“来自毛细血管后微静脉的核因子”。IL-33主要由成纤维细胞和上皮、内皮和气道平滑肌细胞表达。IL-33是IL-1受体相关蛋白质ST2的配体。ST2受体在几乎所有先天性免疫细胞(肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、自然杀伤(NK)细胞和巨噬细胞)中以及在NK T和T辅助(Th) 2细胞中表达。IL-33与靶细胞上的ST2的相互作用可以触发促炎Thl、 Th2和Thl7细胞因子的表达和分泌、以及参与ThU Th2和先天性免疫效应子功能的趋化因子的表达(公开的论文和Hicks等人正在准备的手稿)。IL-33通过其促炎细胞因子结构域与其特异性表面受体结合。此外，IL-33还具有N端结构域，其含有典型的DNA结合性螺旋-转角-螺旋基序。以其细胞核未切割形式，IL-33与异染色质中的组蛋白2A和2B相互作用，促进染色质压缩且充当潜在的转录阻遏物。有证据强烈地支持IL-33类似于其他染色质相关细胞因子(IL-1 a和HMGB1)，所述细胞因子看起来发挥双重功能，即，在核中调节转录阻遏、和经由经典受体发信号以用作有力的促炎细胞因子。因此，已提出，类似于HMGB1，IL-33可以充当‘警报素(alarmin)’——属于更大的损伤相关分子模式(DAMP)分子家族。
发明内容
IL-33/ST2轴在人炎性疾病的病理生理学中起关键作用，这由其在患病组织中的高水平表达所证实。升高水平的IL-33和/或其可溶性受体ST2在类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病(IBD)、牛皮癣和溃疡性结肠炎、急性嗜酸性粒细胞肺炎、严重哮喘、特发性肺纤维化、肝纤维化疾病、特应性皮炎、系统性硬化病、自身免疫和创伤患者中观察到。类似于其在人中的作用，IL-33/ST2轴已显示在鼠炎症模型中是关键的。IL-33恶化胶原诱发性关节炎(CIA)、变应性结膜炎和实验性自身免疫性脑膜炎(EAE)。用抗体中断IL-33/ST2信号传导已显示对于变应性气道炎症和博来霉素诱发的肺损伤的消减是有利的。近来还已显示IL-33在慢性肠炎症的IBD小鼠模型中是上调的(Oboki等人，PNAS2010107 (43)18581-18586)。该非人动物可以是任何非人动物。优选地，非人动物是哺乳动物，更优选地啮齿类动物例如大鼠或小鼠，最优选地非人动物是小鼠。在优选实施方案中，所述非人动物是小鼠，并且IL-33基因的N端缺失包括在IL-33基因的N端的整个DNA结合结构域的缺失。优选地，在该小鼠中所述IL-33基因N端缺失包括IL-33基因的表达产物的氨基酸1-67的缺失。就该N端IL-33缺失而言，该非人动物可以是杂合或纯合的。优选地，非人动物就N端IL-33缺失而目是杂合的。根据本发明在IL-33基因的N端具有缺陷的非人动物展示出炎性疾病的典型特征。例如，根据本发明的小鼠具有特征，如直至约3-4月龄前的正常出生率和生长，随后在耳中的出血性损害和在胸腔中重复观察到的大凝块、较小的尺寸、和一般疾病状况。在病理学检查时，这些小鼠显示出多器官炎症，包括慢性、多病灶心肌炎；伴有肠壁扩张的慢性、化脓性、强回肠炎；慢性输尿管炎(utreteritis)伴显著肾积水和肾萎缩、肺中的中等多病灶和血管周浸润，脾增生以及免疫器官、肺和小肠中的嗜酸性粒细胞和巨噬细胞的强扩张。因为根据本发明的非人动物显示出炎症表型，所以它作为体内炎症模型是有用的。具有N端IL-33缺失的非人动物可以用于在实践上证明IL-33功能障碍和炎性病症之间的因果关系、以及允许设计定向治疗策略以旨在减少或消除患者中IL-33的异常过生产。因为IL-33的大量产生和分泌到细胞外区室内是这种严重炎性状况的原因，故这种新型和独特的非人动物模型也可以用于评估IL-33药物候选物的体内功效和效力(如果确定与非人IL-33或其受体ST2的交叉反应性)。因此，在本发明的第二个目的中，所述非人测试动物用作炎性疾病的体内模型，尤其是就筛选抗炎化合物而言。在一个实施方案中，提供了用于筛选抗炎化合物的方法，其包括:给根据本发明的具有N端IL-33缺失的非人动物施用候选化合物。在一个实施方案中，所述方法包括a)提供具有N端IL-33缺失的非人动物，b)给所述非人动物施用候选化合物，c)比较所述非人动物的炎症症状与未施用所述化合物的具有N端IL-33缺失的非人动物的炎症症状；其中减轻所述炎症症状的化合物被选择作为抗炎化合物。候选化合物包括但不限于小分子、(多)肽、(糖)蛋白、抗体或抗体片段、(多)或(寡)核苷酸、核苷、脂质、其组合、及其修饰的衍生物。待筛选的候选化合物的施用方法包括但不限于经口施用和肠胃外施用(例如静脉内施用、腹膜内施用和鼻内施用)。在经口施用的情况下，候选活性剂可以掺和在饲料中用于施用。`候选活性剂可以与医学可接受的常规赋形剂(例如载体和稀释剂)或添加剂组合施用。进一步地，候选活性剂可以包封在、或结合(附着)于、脂质体(例如带正电荷的脂质体)或纳米粒中或上，以施用。可以例如，通过肉眼观察、测量体重、组织病理学观察(例如在组织染色后的显微镜观察)和FACS分析(参见下文实施例)，使用炎症症状的缓解或康复、体重的增加、自回肠(ileon)肥大的恢复等作为指标，进行评估。 通过使用具有N端IL-33缺失的主题动物或源自其的细胞，可以鉴定与细胞IL-33结合、调节细胞IL-33、拮抗细胞IL-33或激动(agonize)细胞IL-33的配体或底物。特别有意义的是有关对人细胞具有低毒性的抗炎化合物的筛选试验。广泛多样的测定试验可以用于这个目的，包括体内研究、施用后药物定位的确定、标记的体外蛋白质-蛋白质结合测定试验、蛋白质-DNA结合测定试验、电泳迁移率变动分析试验、用于蛋白质结合的免疫测定试验等。取决于具体的测定试验，可以使用全动物或源自其的细胞。细胞可以是从动物中新鲜分离的，或可以是在培养中的永生化细胞。在本发明的另一个实施方案中，所述体内模型用于评估药理学效应，例如IL-33药物候选物的体内功效和效力。因此，在本发明的另一个实施方案中，提供了用于评估IL-33药物候选物的药理学效应的方法，所述方法包括:给根据本发明的具有N端IL-33缺失的非人动物施用所述IL-33药物候选物。本发明还涉及本发明提供的具有N端IL-33缺失的非人动物的后代，其可以通过与相同或其它基因型繁育而获得。优选地，后代通过与相同基因型繁育而获得。所述后代包含与上文描述的具有N端IL-33缺失的非人动物一样的N端IL-33缺失。本发明的再一目的是所述后代作为炎性疾病的体内模型的用途。在一个实施方案中，所述后代用作体内模型用于筛选抗炎化合物。在另一个实施方案中，所述后代用作体内模型用于评估抗炎化合物的药理学效应。此外，本发明涉及源自如上所述的具有N端IL-33缺失的非人动物或其后代的细胞系或原代细胞培养物。另外，本发明还提供了源自如上所述的具有N端IL-33缺失的非人动物或其后代的组织或器官外植块或其培养物。本发明还提供了源自如上所述的具有N端IL-33缺失的非人动物或其后代的组织或细胞提取物。在本发明的另一个实施方案中，上文提及的源自具有N端IL-33缺失的非人动物或其后代的细胞系或原代细胞培养物、组织或器官外植块或其培养物、组织或细胞提取物被用作炎性疾病的模型。在一个实施方案中，所述炎性疾病模型被用于筛选抗炎化合物，在另一个实施方案中，所述炎性疾病模型被用于评估抗炎化合物的药理学效应，如上文概述的。用于产生在基因例如IL-33基因的N端中具有缺失的非人动物的方法是本领域众所周知的。合适的方法例如在Hogan B等人中描述:Manipulating the mouse embryo, Alaboratory manual,第 2 版(1994), Cold Spring Harbor Laboratory Press。如本文使用的术语“IL-33基因”特别涉及白细胞介素33基因，也称为DVS27 ；NF-HEV ；NFEHEV ；C9orf26 ；DKFZp586H0523 ；RP11-575C20.2 ;IL33、IL-1FlU9230117N10Rik、RGD1311155等。所述基因包含具有推定的DNA结合性螺旋-转角-螺旋基序的N端结构域和C端细胞因子结构域。IL33基因在人、黑猩猩、犬、母牛、小鼠和大鼠中是保守的。作为例子，小鼠IL-33基因的DNA序列在SEQ ID.1中描述。术语“IL-33基因的表达产物”指IL-33基因的翻译蛋白质，即IL-33蛋白质。如本文使用的，“N端IL-33缺失”意指IL-33基因的N端的全部或部分被修饰(例如取代、缺失、添加和/或插入)或破坏，由此IL-33基因的表达产物缺少该N端结构域的全部或部分和/或不表现N端结构域的功能。如本文使用的N端结构域包含负责IL-33的DNA结合和核定位的推定螺旋-转角-螺旋基序。在优选实施方案中，非人动物是小鼠，并且该小鼠IL-33基因的表达产物(IL-33蛋白质)的氨基酸1-67被修饰或破坏。此非人动物在本文中描述为具有N端IL-33缺失的非人动物、或在IL-33基因的N端具有缺陷的非人动物、或N端IL-33基因敲除的非人动物等。在一个特别优选的实施方案中，所述IL-33基因的N端修饰通过DsRed盒的敲入来达到，从而造成IL-33基因的N端部分缺失。所述非人动物相应地也称为DsRed-1L-33/COOH非人动物。如本文使用的术语“野生型”指具有全长IL-33基因的非人动物。如本文描述的“ 非人动物”指不是人的任何动物。优选地，非人动物是哺乳动物，更优选地啮齿类动物例如大鼠或小鼠，最优选地非人动物是小鼠。如上所述具有N端IL-33缺失的非人动物可以用作炎性疾病治疗的模型。它允许研究潜在的非炎性化合物在非人体内模型中对炎性疾病的作用。因为转基因动物对于转基因人mAbll抗体是免疫耐受的，所以可以测定用治疗性抗体例如Mabll进行的长期治疗的效果。此外，可以跟踪对细胞外IL-33水平以及炎性疾病的进程和动力学的影响。如本文使用的术语“炎性疾病”涉及特征在于炎症的任何健康损害或异常功能状况。特别地，如本文使用的术语“炎性疾病”涉及与IL-33的水平增加相关的疾病，例如但不限于炎性肠病、类风湿性关节炎、荨麻疹(urticuria)、动脉粥样硬化血管疾病、牛皮癣结肠炎、溃疡性结肠炎、急性嗜酸性粒细胞性肺炎、严重哮喘、特发性肺纤维化、肝纤维化疾病、特应性皮炎、系统性硬化病、自身免疫疾病等。如本文使用的“抗炎化合物”意指具有减少炎症反应，详细地，影响IL-33的生物作用的能力的任何分子。由此，“抗炎化合物”包括但不限于小分子、(多)肽、(糖)蛋白、抗体或抗体片段、(多)或(寡)核苷酸、核苷、脂质、其组合及其修饰的衍生物。“抗炎化合物”还包括介导RNA干扰的分子，例如shRNA、微小RNA、siRNA、反义寡核苷酸、spiegelmers、LNA或PNA寡聚物、或其组合。如本文使用的推定的抗炎化合物也描述为“IL-33药物候选物”或“候选化合物”。附图简述图la:IL-33的靶向突变的示意图。将DsRed盒插在起始密码子处且在氨基酸位置68上与IL-33融合。
图1b:靶向策略。RFP:红色荧光蛋白质；tml:靶向突变I ;wt:野生型；标记:标记X (Roche) ；kb:1千碱基对；EcoR1:限制性核酸内切酶位点；NeoR:新霉素选择盒；三角形:1x位点。 图2:杂合DsRedIL-33/COOH敲入小鼠的表型。生长迟缓，毛发竖立。图3:杂合DsRedIL-33/COOH敲入小鼠的表型。器官形态。图4:杂合DsRedIL-33/COOH敲入小鼠的表型。与野生型小鼠相比较的器官形态。S1:小肠；He:心脏；Th:胸腺；Ki 肾；Lu:肺；Sp:脾；L1:肝。Co*:在胸腔中的血凝块。图5:杂合DsRedIL-33/COOH敲入小鼠的表型。回肠(ileon)肥大。肠制备物纵向打开。图6:经由 FACS 分析的杂合 DsRedIL-33/COOH 敲入小鼠(DsRedIL-33/COOH-KI)的表型。用对于限定的表面标记具有特异性的抗体染色所示器官的细胞悬液:CD45 (标记的APC-Cy7)，总白细胞；CDllb (标记的别藻蓝蛋白，APC)，巨噬细胞；SiglecF (标记的藻红蛋白PE)，嗜酸性粒细胞；Grl (标记的PE-Cy7)，粒细胞；F4/80 (标记的Alexa488)，单核细胞。使用FACS Canto I装置(BD Corp.)获得染色的细胞且用FlowJo软件分析。Y轴:SiglecF，X轴:F4/80。图显示不同细胞群体的叠加的染色，DsRedIL-33/C00H敲入小鼠具有嗜酸性粒细胞的增加，这通过SiglecF和F4/80的高表达而确定(参见标记的群体，“Eos”=嗜酸性粒细胞)。图7:杂合DsRedIL-33/COOH敲入小鼠的表型。血清IL-33水平。本发明现在通过实施例更详细地描述，这些实施例不应解释为限制本发明的范围。实施例实施例1:靶向载体的生成:祀向载体(SEQID.N0.2)使用 Gene Bridges GmbH, Heidelberg 提供的重组工程技术生成。它含有下述元件:1-70IL-33 外显子 Ib71-3871 内含子3872-3882 IL-33 外显子 23883-4557 dsRed 单体 CDS4558-4579 IL-33 外显子 34580-4590 内含子序列4591-4626 1x 位点4625-6040新霉素选择盒6041-6074 1x 位点6075-6571 内含子序列6572-6682 IL-33 外显子 46683-7285 内含子7286-7603 pBluescript SKII+7604-8463 白喉(diphteria)毒素 a 选择盒8464-10697 pBluescript SKII+靶向载体用于BALB/c ES细胞中的同源重组。使用PCR筛选策略(寡核苷酸的序列参见下文)，鉴定阳性克隆。在Cre表达质粒电穿孔后，位点特异性重组导致在体外新霉素选择盒的去除。在ES细胞克隆的胚泡注射后，培育嵌合动物，并且使用Fl和F2代的活检组织的DNA制备物，使用PCR，证实靶向突变的身份以及基因分型(图1b中的PCR AB,CD,EF 和 EFG) 。
寡核苷酸寡核苷酸A:TAG AAA GAG CCC AGT GTT AAG C (SEQ ID.N0.3)寡核苷酸B:GGC TTG CCC TCG CCC TCG (SEQ ID.N0.4)寡核苷酸C:CAC CTG CGA CTT CAA GAC C (SEQ ID.N0.5)寡核苷酸D:ACG ATT CCT TAG TGA TGG GGC (SEQ ID.N0.6)寡核苷酸E:GTT GCT TCT GAT GAC TTC AGG (SEQ ID.N0.7)寡核苷酸F:GCA ATA GCC CTT GCC AAG GC (SEQ ID.N0.8)寡核苷酸G:TGC TGT TCC AGC CTC TGT TGG (SEQ ID.N0.9)实施例2:N端IL-33敲除小鼠的生成生成在Balb/c背景中的两个遗传修饰的敲入小鼠模型。第一个突变体通过用荧光色素DsRd-单体进行读框内置换(DsRed-1L33/C00H)，靶向N端细胞内转录因子样活性，而保持功能细胞因子结构域完整(图1)。第二个突变体通过在读框内敲入荧光色素DsRd，替换促炎细胞因子结构域，而保持DNA结合结构域完整(NH2/L33-DsRed)。实施例3:N端IL-33敲除小鼠的表征
出乎意料地，失去IL-33N端结构域但维持细胞质中的促炎细胞因子活性的遗传改造的杂合突变型小鼠(DsRed-1L33/C00H)在约4月龄时死亡。它们在出生时看起来正常，在后来的4 - 5个月间病得越来越厉害并最后濒临死亡，具有估计约60%的表型渗透(phenotype penetration)。在3_4月龄时,这些突变体开始展示出耳中出血性损害和膨大的腹部。在尸检时，重复观察到大量脾肿大、回肠肥大(提示肠炎症)、在胸腔中大凝块的存在、和肾萎缩(图2-5)。在FACS分析中对不同器官的更近检查显示，肺、脾、淋巴结、Payer斑和外周血中强的嗜酸性粒细胞增多(图6)。血清IL-33水平在DsRed-1L33/C00H敲除小鼠中是升高的(图7)。讨论我们近来已发现，IL-33的鼻内施用引起显著肺炎症，间质中具有巨噬细胞起源的多核巨细胞(Hicks等人，备稿中)。通过组织病理学显示，以相同方式，IL-33也引发骨髓增生伴随大簇的髓样细胞/粒细胞(Hicks等人，备稿中)。另外，在这些小鼠的外周血的血浆中发现高水平的可溶性IL-33，强烈暗示:在我们的DsRed-1L33/C00H突变动物中见到的免疫病理学效应是完全活性的DsRed-1L33/C00H细胞因子在细胞质中的连续存在及其向细胞外区室的可能释放的结果，从而如已假设的那样，作为有效的内源DAMP信号起作用。敲除IL-33的N端的这种“警报素”样作用因此类似于人免疫病理学状况(其诊断仍是未知的)，在组织损伤、坏死或自身免疫后释放强危险信号。因为在具有编码IL-1RA的基因的纯合突变或缺失的患者中严重的多器官炎症的出现及其被mAbs的阻断已证实IL-1a和IL-P在许多自身炎性疾病中的关键作用(Weber等人，Science signaling，3，2010)。IL-33的可能遗传变异可能导致该可能的“危险”分子的过表达和/或分泌，并且它可以促成自身炎性或变应性疾病的发病。准确地，近来已显示，在IL-33基因的多态性和较高的IL-33水平与日本雪松花粉病的易感性之间存在正相关(Sakashita等人Clin.Exp.Allergy Dec2008)。
权利要求
1.一种具有IL-33基因的N端缺失的非人动物。
2.权利要求1的非人动物，其中位于所述IL-33基因的N端的整个DNA结合结构域是缺失的。
3.权利要求1或2的非人动物，其中所述非人动物是哺乳动物。
4.权利要求3的非人动物，其中所述非人动物是啮齿类动物。
5.权利要求4的非人动物，其中所述非人动物是小鼠，并且其中所述IL-33基因的N端缺失包含所述IL-33基因的表达产物的氨基酸1-67的缺失。
6.权利要求1-5的非人动物的后代，其通过与相同或另一个基因型的动物繁育而获得。
7.一种细胞系或原代细胞培养物，其源自权利要求1-5的非人动物或权利要求6的后代。
8.—种组织或器官外植块或其培养物，其源自权利要求1-5的非人动物或权利要求6的后代。
9.权利要求1- 5中任一项的非人动物、权利要求6的后代、权利要求7的细胞系或原代细胞培养物、或权利要求8的组织或器官外植块作为炎性疾病的模型的用途。
10.根据权利要求9的炎性疾病的模型的用途，用于筛选抗炎化合物。
11.根据权利要求9的炎性疾病的模型的用途，用于评估抗炎化合物的药理学效应。
12.—种用于筛选抗炎化合物的方法，其包括给权利要求1 - 5中任一项的非人动物或权利要求6的后代施用候选化合物。
13.一种用于评估抗炎化合物的药理学效应的方法，其包括给权利要求1 - 5中任一项的非人动物或权利要求6的后代施用所述抗炎化合物。
14.基本上如本文描述的非人动物、 用途和方法。
全文摘要
本发明涉及在IL-33基因的N端结构域中具有缺陷的非人动物。本发明还提供所述非人动物作为炎性疾病的体内模型的用途，尤其是与筛选抗炎化合物的方法相关，和用于评估和优化给定的抗炎化合物的药理学性质的方法。
文档编号C12N15/85GK103179851SQ201180051772
公开日2013年6月26日 申请日期2011年10月26日 优先权日2010年10月29日
发明者J·科特-斯尔拉, A·伊格莱希亚斯, C·A·迈尔 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司